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1、(10)申请公布号 CN 104031997 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104031997 A (21)申请号 201410244204.X (22)申请日 2014.06.04 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 沈万宽 徐刚红 罗明珠 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 (54) 发明名称 一种用于。
2、快速检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 引 物组、 试剂盒及其检测方法 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域, 具体公开了一种 快速检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 引物组、 试剂盒及 其检测方法。本发明针对甘蔗黑穗病菌核糖体基 因转录间隔区 ITS 序列设计得到一组引物组 F3/ B3 和 FIP/BIP, 由该引物组或含有该引物组的试 剂盒通过环介导等温扩增 (LAMP) 检测甘蔗黑穗 病菌, 具有成本低、 易操作、 简单、 快速、 检测结果 直观、 肉眼可判断、 灵敏度高、 特异性强等优点, 本 发明适用于基层部门甘蔗引种检疫、 脱毒种苗质 量检测及甘蔗黑穗病田间早期检测等, 具有广泛 和实际的。
3、应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104031997 A CN 104031997 A 1/1 页 2 1. 一种用于检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 引物组, 其特征在于, 所述引物组包含一对外引 物对 F3/B3 和一对内引物对 FIP/BIP, 引物序列如 SEQ ID NO : 1 4 所示。 2. 一种用于检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 试剂盒, 其特征在于, 所述试剂盒含有权利要求 1 。
4、所述引物组。 3. 根据权利要求 2 所述试剂盒, 其特征在于, 所述试剂盒还含有基因组 DNA 提取液、 LAMP 反应液、 阳性对照品、 阴性对照品、 稳定液和显色液 ; 所述 LAMP 反应液除含有权利要求 1 所述引物组还含有 Bst DNA 聚合酶和检测基础液。 4. 根据权利要求 3 所述试剂盒, 其特征在于, 所述基因组 DNA 提取液为 CTAB 提取液。 5. 根据权利要求 3 所述试剂盒, 其特征在于, 所述检测基础液为终浓度为 1.3 1.5 mmol/L dNTPs、 0.6 0.9 mmol/L 甜菜碱和 7 9 mmol/L MgSO4。 6. 根据权利要求 3 所。
5、述试剂盒, 其特征在于, 所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组 DNA ; 所述阴性对照品为无菌水。 7. 根据权利要求3所述试剂盒, 其特征在于, 所述稳定液为石蜡油 ; 所述显色液为SYBR Green I。 8. 根据权利要求 3 所述试剂盒, 其特征在于, 所述试剂盒的反应体系为 : 基因组 DNA 2.5L, 8U/L 的 Bst DNA 聚合酶 0.5L, 检测基础液 19L, 0.2 mol/L 的 F3/B3 引物各 0.5L, 1.6 mol/L的 FIP/BIP引物各1L ; 所述检测基础液为终浓度为1.31.5 mmol/ L dNTPs、 0.6 0.9 mmol/L 甜。
6、菜碱和 7 9 mmol/L MgSO4。 9. 根据权利要求3所述试剂盒, 其特征在于, 所述试剂盒的反应程序为6365 1 h, 80 82 5 min, 4保存。 10. 利用权利要求 1 所述引物组或权利要求 2 至 9 任一项所述试剂盒检测甘蔗黑穗病 菌的方法, 其特征在于, 包括以下步骤 : S1. 基因组 DNA 提取 : 处理甘蔗得到甘蔗黑穗病菌基因组总 DNA ; S2. 配制反应体系, 在反应体系中加入稳定液, 在反应管内壁加入显色液 ; 所述稳定液 的加入量为 45 50 L, 显色液的加入量为 1.5 2 L ; S3. 环介导等温扩增 : 以基因组总 DNA 为模板,。
7、 利用引物组经扩增得到扩增产物 ; 所述 引物组包含一对外引物对 F3/B3 和一对内引物对 FIP/BIP, 引物序列如 SEQ ID NO : 1 4 所 示 ; 所述扩增反应的程序为 63 65 1 h, 80 82 5 min, 4保存 ; S4. 扩增产物检测 : 利用显色法对扩增产物进行分析, 观察颜色变化, 反应产物颜色变 为绿色, 说明待测样品含有甘蔗黑穗病菌 ; 反应产物变为橙色, 则不含有甘蔗黑穗病菌。 权 利 要 求 书 CN 104031997 A 2 1/8 页 3 一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 引物组、 试剂盒及 其检测方法 技术领域 0001 本发明涉。
8、及生物技术领域, 更具体地, 涉及一种快速检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 引 物组、 试剂盒及其检测方法。 背景技术 0002 由甘蔗鞭黑粉菌 (Sporisorium scitamineum) 引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重 要甘蔗病害, 也是我国一种经济危害性最严重的甘蔗病害, 其主要传播途径是在种苗或种 茎带有甘蔗黑穗病菌, 甘蔗黑穗病菌在甘蔗存放和种植过程中扩散传染。甘蔗黑穗病最典 型的症状是蔗茎生长点变异产生黑色鞭状物, 是甘蔗病害中最容易诊断的病害, 但其发病 潜伏期较长, 早期无症状的甘蔗小苗或甘蔗种茎一般方法难以准确诊断其是否感染或携带 甘蔗黑穗病。 因此, 探索其快速检测技术对。
9、甘蔗引种检疫、 病害早期诊断及抗病品种快速筛 选等及其重要。 0003 目前, 对于甘蔗黑穗病已建立的检测方法有 : 分生组织染色技术 (Nallathambi P, Padmanaban P, Mohanraj D. Histological staining: an effect method for sugarcane smut screening J. Sugar Cane, 1998(2):10-13) 、 ELISA 快速检测技术 (Nallathambi P, Padmanaban P, Mohanraj D. Standardization of an indirect ELI。
10、SA technique for detection of u.scitamineasyd., causal agent of sugarcane smut disease J. Journal of Mycology and Plant pathology, 2001, 31(1):76-78) ; PCR 检测技术等。 0004 随着分子生物技术的发展, PCR 检测技术也得到的广泛的应用, 专利号为 201010230534.5 的发明专利公开了一种甘蔗黑穗病菌快速检测方法, 该方法使用真菌 ITS 通用引物, 其检测特异性极差, 灵敏度有限, 在黑穗病菌感染量小时无法准确检测出 ; 专。
11、利 号为 201110218585.0 的发明专利公开了一种甘蔗黑穗病菌巢式 PCR 快速检测方法, 这种 PCR 检测方法主要包括以下步骤 : 步骤 1 : 采用 CTAB 法提取甘蔗黑穗病菌基因组总 DNA ; 步 骤 2 : 以甘蔗黑穗病菌基因组总 DNA 为模板, 采用真菌核糖体基因转录间隔区 ITS 的通用引 物 ITS4 和 ITS5 进行第一轮 PCR 扩增 ; 步骤 3 : 以第一轮 PCR 扩增产物或者第一轮 PCR 扩增 产物的稀释液为模板, 采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区 ITS 的特异引物 Smut-L1 和 Smut-R2 经过 PCR 扩增得到第二轮 PCR 。
12、扩增产物 ; 步骤 4 : 对第二轮 PCR 扩增产物进行凝 胶电泳分析。这种方法虽然能检测出甘蔗是否感染黑穗病菌, 但该方法要经过两轮 PCR 扩 增, 需要 PCR 仪、 电泳仪及凝胶成像系统等昂贵的专业仪器及分子生物学专业实验人员操 作, 限制了该检测方法的推广应用。 0005 环介导等温扩增法 (Loop-mediated isothermal amplifi cation, LAMP) 是日本学者 Notomi 等 (2000) 发明的一种新型体外等温扩增特异核酸判断的技术 (Notomi T, Okayama H, Masubuchi H et al.,2000. Loop-med。
13、iated isothermal amplifi cation of DNA. Nucleic Acids Research, 28(12): e63) , 随着 LAMP 技术的发展, 已成功应用 LAMP 技术检测病毒、 细 菌、 真菌以及寄生虫等病原的检测 (刘永生, 丁耀忠, 张杰。环介导等温扩增 (LAMP) 技术的 说 明 书 CN 104031997 A 3 2/8 页 4 应用研究 J, 2010,26(8) : 87-89) 。 0006 LAMP 法具有特异性强, 快速、 高效, 敏感性高, 操作简便, 检测方法简单等优点, 肉 眼即可判断结果, 从而简化了检测过程, 检测。
14、时间也大大缩短。目前尚未见应用 LAMP 技术 用于检测甘蔗黑穗病菌的相关技术报道。 发明内容 0007 本发明针对现有技术中甘蔗黑穗病菌检测方法存在成本高、 特异性低、 步骤繁琐、 易污染等缺点, 提供一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 引物组。 0008 本发明的第二个目的是提供一种快速检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 试剂盒。 0009 本发明的第三个目的是提供一种快速检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 检测方法。 本发明所述引物组或试剂盒特异性的检测甘蔗黑穗病菌, 所述检测方法具有成本低、 易操作、 简单、 快速、 特异性强, 灵敏度高等特点, 适合于基层农技部门对甘蔗黑穗病菌的田 间快速。
15、检测。 0010 本发明的目的通过以下技术方案予以实现 : 一种用于检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组, 所述引物组包含一对外引物对F3/B3和一 对内引物对 FIP/BIP, 引物序列如 SEQ ID NO : 1 4 所示。 0011 所述引物组针对甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区 ITS 序列进行设计。 0012 一种用于检测甘蔗黑穗病菌的 LAMP 试剂盒, 所述试剂盒含有上述引物组。 0013 优选地, 所述试剂盒还含有基因组 DNA 提取液、 LAMP 反应液、 阳性对照品、 阴性对 照品、 稳定液和显色液 ; 所述 LAMP 反应液除含有上述引物组还含有 Bst DNA 聚合酶和检。
16、测 基础液。 0014 优选地, 所述基因组 DNA 提取液为 CTAB 提取液, CTAB 提取液的成分参照本领域 常规配方即可。优选地, 所述 CTAB 提取液的配方为 : 2% CTAB, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 为 8.0), 1.4 mol/L NaCl。 0015 优选地, 所述检测基础液为 dNTPs、 MgSO4及甜菜碱。 0016 更优选地, 所述检测基础液为终浓度为1.31.5 mmol/L dNTPs、 0.60.9 mmol/ L 甜菜碱和 7 9 mmol/L MgSO4。 0017 更优选地, 检测基础液为终浓。
17、度为 1.4 mmol/L dNTPs、 0.8 mmol/L 甜菜碱和 8 mmol/L MgSO4。 0018 优选地, 所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组 DNA ; 所述阴性对照品为无菌水。 0019 优选地, 所述稳定液为石蜡油 ; 优选地, 所述显色液为 SYBR Green I。 0020 优选地, 所述试剂盒的反应体系为 : 基因组 DNA 2.5L, Bst DNA 聚合酶 0.5L (8U/L) , 检测基础液19L, 0.2 mol/L 的F3/B3引物各0.5L, 1.6 mol/L的 FIP/BIP 引物各1L ; 所述检测基础液为终浓度为1.31.5 mmol/L 。
18、dNTPs、 0.60.9 mmol/L 甜菜 碱和 7 9 mmol/L MgSO4。 0021 优选地, 所述试剂盒的反应程序为6365 1 h, 8082 5 min, 4保存 ; 更优 选地, 所述试剂盒的反应程序为 65 1 h, 80 5 min, 4保存。 0022 本发明还提供了利用上述引物组或上述试剂盒检测甘蔗黑穗病菌的方法, 包括以 下步骤 : 说 明 书 CN 104031997 A 4 3/8 页 5 S1. 基因组 DNA 提取 : 处理甘蔗得到甘蔗黑穗病菌基因组总 DNA ; S2. 配制反应体系, 在反应体系中加入稳定液, 在反应管内壁加入显色液 ; 所述稳定液 。
19、的加入量为 45 50 L, 显色液的加入量为 1.5 2 L ; S3. 环介导等温扩增 : 以基因组总 DNA 为模板, 利用引物组经扩增得到扩增产物 ; 所述 引物组包含一对外引物对 F3/B3 和一对内引物对 FIP/BIP, 引物序列如 SEQ ID NO : 1 4 所 示 ; 所述扩增反应的程序为 63 65 1 h, 80 82 5 min, 4保存 ; S4. 扩增产物检测 : 利用显色法对扩增产物进行分析 ; 观察颜色变化, 反应产物颜色变 为绿色, 说明待测样品含有甘蔗黑穗病菌 ; 反应产物变为橙色, 则不含有甘蔗黑穗病菌。 0023 优选地, S1 所述甘蔗黑穗病菌基因。
20、组总 DNA 的提取通过 CTAB 法利用 CTAB 提取液 提取得到。 0024 CTAB 提 取 液 的 配 方 为 : 2% CTAB, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 为 8.0), 1.4 mol/L NaCl。 0025 作为一种优选方式, 利用上述引物组或试剂盒检测甘蔗黑穗病菌的方法, 包括以 下步骤 : S1. 基因组 DNA 提取 : 采用 CTAB 法处理甘蔗心片, 得到甘蔗黑穗病菌基因组总 DNA ; S2. 环介导等温扩增 : 以基因组总DNA为模板, 采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔 区 ITS 序列设计的内外两对特异。
21、引物 F3、 B3(外引物对) 和 FIP、 BIP(内引物对) 经过扩增 得到扩增产物 ; F3 : 5- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3 ; B3 : 5-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3 ; FIP : 5- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3 ; BIP : 5- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3 ; 反应体系 : 总体系 25L, 其中, 基因组 DNA 2.5L, Bst DNA 聚合酶 0.5L(8U/L) , 检测基础液 19L, 0.2 mol/L 。
22、的 F3、 B3 引物各 0.5 L, 1.6 mol/L 的 FIP、 BIP 引物各 1 L ; 另外在每 PCR 管反应体系上面加稳定液 50L, PCR 管盖内壁加显色液 2 L ; 所述扩增程序为 : 65 1 h, 80 5 min, 4保存 ; S3. 扩增产物检测 : 采用显色法对得到的扩增产物进行分析。 0026 优选地, 所述检测基础液为 dNTPs、 MgSO4及甜菜碱。 0027 更优选地, 所述检测基础液的所述检测基础液终浓度为 1.4 mmol/L dNTPs、 0.8 mmol/L 甜菜碱和 8 mmol/L MgSO4。 0028 优选地, 所述稳定液为石蜡油 。
23、; 所述显色液为 SYBR Green I。 0029 与现有技术相比, 本发明具有以下有益效果 : (1) 成本低、 易操作、 简单 : 本发明最大的优点是不需要以往 PCR 检测所需要的 PCR 仪、 电泳仪、 凝胶成像系统等昂贵的专业仪器, 仅需一台廉价的恒温仪器, 如水浴锅 ; 本发明省 去了繁琐的操作步骤和规程, 简单易行。 0030 (2) 快速 : 应用本发明检测方法, 可在 1 1.5h 得到检测结果, 而以往的 PCR 或巢 式PCR检测需46h才可得到检测结果 ; 本发明所述方法多大缩短了操作时间, 方便快速。 0031 (3) 检测结果直观, 肉眼可判断 : 本发明扩增产。
24、物可通过加显色剂进行染色, 绿色 为阳性, 即待测样品中含甘蔗黑穗病菌, 橙色为阴性, 说明待测样品中不含黑穗病菌 ; 肉眼 说 明 书 CN 104031997 A 5 4/8 页 6 可判断检测结果, 无需电泳检测及凝胶成像。 0032 (4) 减少假阳性 : 本发明所述显色液在等温扩增前已加在 PCR 管内壁, 这样避免扩 增后开盖加反应液, 气溶胶污染, 可大大减少假阳性产生。 0033 (5) 灵敏度极高 : 本发明最低检测限量不超过 5 fg 甘蔗黑穗病菌基因组 DNA, 可检 测出无症状甘蔗苗是否携带甘蔗黑穗病菌。 0034 (6) 特异性强 : 本发明设计的引物组是该技术的关键。
25、, 该引物组针对甘蔗黑穗病菌 核糖体基因转录间隔区 ITS 序列设计得到。因此在检测过程中不会检测出甘蔗梢腐病菌、 玉米黑粉菌、 甘蔗宿根矮化病菌、 甘蔗眼点病菌、 甘蔗赤腐病菌、 甘蔗白条病菌, 特异性强, 准确率高。 0035 本发明适用于基层部门甘蔗引种检疫、 脱毒种苗质量检测及甘蔗黑穗病田间早期 检测等, 具有广泛和实际的应用价值。 附图说明 0036 图 1 为基因组 DNA 扩增产物染色结果图 ; 图 2 为 LAMP 试剂盒的特异性检测 ; 图 3 为 LAMP 试剂盒的灵敏性检测。 具体实施方式 0037 下面结合说明书附图和具体实施例, 进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明。
26、 本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法, 通常按照 常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义, 文中所使用的所有专业与科学用语 与本领域技术人员熟悉的意义相同。 0038 实施例 1 引物设计 本发明根据甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区 ITS 序列重新设计引物, 共有一对外 引物对 F3/B3 和一对内引物对 FIP/BIP。引物序列如 SEQ ID NO : 1 4 所示。 0039 上述 2 对引物序列如下 : F3 : 5- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3 ; B3 : 5-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3 ; FIP : 。
27、5- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3 ; BIP : 5- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3。 0040 实施例 2 甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增 (LAMP) 快速检测方法 使用实施例 1 所述引物对, 建立甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增 (LAMP) 快速检测方法, 具体步骤如下 : S1. 基因组 DNA 提取 : 2014 年 4 月田间采集甘蔗品种新台糖 22 号蔗苗心叶 9 片 (有甘 蔗黑穗病早期症状, 但黑穗未抽出) , 采用 CTAB 法用基因组 DNA 提取液对每片小苗心叶。
28、进行 甘蔗黑穗病菌基因组总 DNA 提取, 得到样品并依次编号为样品 2 10 ; S2. 配制反应体系 : 总体系 25L, 其中, 基因组 DNA 2.5L, Bst DNA 聚合酶 0.5L (8U/L) , 检测基础液 19L, 0.2 mol/L 的 F3、 B3 引物各 0.5 L, 1.6 mol/L 的 FIP、 BIP 引物各 1 L。另外在每 PCR 管反应体系上面加稳定液石蜡油 50L, PCR 管盖内壁加 说 明 书 CN 104031997 A 6 5/8 页 7 显色液 SYBR Green I 2 L/ 体系 ; S3. 环介导等温扩增 : 分别以样品 2 10 。
29、及甘蔗黑穗病菌基因组 DNA (阳性对照, 标记 为 1 号) 及 ddH2O(阴性对照, 标记为 11 号) 为模板, 采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔 区 ITS 序列设计的内外两对特异引物 F3、 B3(外引物对) 和 FIP、 BIP(内引物对) 经过扩增 得到扩增产物 ; 所述扩增反应的程序为 : 65 1 h, 80 5 min, 4保存 ; 其中, 所述基因组 DNA 提取液为 CTAB 提取液, 其配方为 : 2% CTAB, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 为 8.0), 1.4mol/L NaCl ; 其中, 检测基础液为d。
30、NTPs、 MgSO4及甜菜碱, 其配方是终浓度分别为1.4 mmol/L dNTPs、 0.8 mmol/L 甜菜碱和 8 mmol/L MgSO4; S4. 扩增产物检测 : 扩增反应结束后, 将 PCR 管倒置并轻轻振荡, 使 PCR 管盖内的显色 液与扩增产物充分混合染色, 图 1 为染色结果。 0041 根据图 1 中染色结果判断检测结果, 绿色为阳性, 即待测样品中含有甘蔗黑穗病 菌, 橙色为阴性, 即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。本实施例中 2 10 号样品结果显示表 明 : 9 个样品及阳性对照均为阳性 (绿色) , 检测出甘蔗黑穗病菌, 而阴性对照为阴性 (橙色) 。 0042。
31、 对比例 1 甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增 (LAMP) 快速检测方法 使用实施例 2 所述方法检测甘蔗黑穗病菌, 唯一不同的是所使用的引物组不同。本对 比例中所使用的引物组为一对外引物对 F3b/B3b和一对内引物对 FIPb/BIPb, 该引物组的序 列为 : F3b: 5- GTCGCGTCCAGCTTCTTG -3 ; B3b: 5- ATTACGAAAGAGCTGGCGG -3 ; FIPb: 5- TCGACTTTTGGCCCATCTTCCCATCCTCACCACCAAAGTCCT -3 ; BIPb: 5- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTT。
32、TTGC -3。 0043 使用上述引物组进行甘蔗黑穗病菌的 LAMP 快速检测, 结果显示 : 9 个样品及阳性 对照均为阴性 (橙色) , 检测不出甘蔗黑穗病菌。 0044 说明使用该对比例中的引物组无法检测出甘蔗黑穗病菌。 0045 对比例 2 甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增 (LAMP) 快速检测方法 使用实施例 2 所述方法检测甘蔗黑穗病菌, 唯一不同的是所使用的引物组不同。本对 比例中所使用的引物组为一对外引物对 F3c/B3c和一对内引物对 FIPc/BIPc, 该引物组的序 列为 : F3c: 5- GGCCCTCAAATAGGCATG -3 ; B3c: 5- ACATTTTAC。
33、GACTGGTAATGC -3 ; FIPc : 5- TGAATTGCAGAAGTGAATCATCGAACCAGATTAGATCTGCAAGGA -3 ; BIPc : 5- CGCAATTCGCTGCGTTCTTCGGTCGTCTAAAATCTAAAAAACAAC -3。 0046 使用上述引物组进行甘蔗黑穗病菌的 LAMP 快速检测, 结果显示 : 9 个样品及阳性 对照均为阴性 (橙色) , 检测不出甘蔗黑穗病菌。 0047 说明使用该对比例中的引物组无法检测出甘蔗黑穗病菌。 说 明 书 CN 104031997 A 7 6/8 页 8 0048 实施例 3 甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增。
34、 (LAMP) 快速检测试剂盒的建立 按下列组成配制甘蔗黑穗病菌环介导等温扩增 (LAMP) 快速检测试剂盒 : 含有基因组 DNA 提取液、 LAMP 反应液、 阳性对照品、 阴性对照品、 稳定液、 显色液。 0049 其中, LAMP 反应液含有两对特异引物 F3/B3(外引物对) 和 FIP/BIP(内引物对) 、 Bst DNA 聚合酶、 检测基础液。 0050 其中, 检测基础液为 dNTPs、 MgSO4及甜菜碱, 其配方是终浓度为 1.31.5 mmol/L dNTPs、 0.60.9 mmol/L 甜菜碱和 79 mmol/L MgSO4。 0051 其中, 试剂盒中所述基因组。
35、 DNA 提取液为 CTAB 提取液, 其配方为 : 2 % CTAB, 20mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 为 8.0), 1.4mol/L NaCl。 0052 其中, 试剂盒中所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组 DNA ; 所述阴性对照品为 无菌水。 0053 其中, 试剂盒中所述稳定液为石蜡油 ; 所述显色液为 SYBR Green I。 0054 本发明对上述条件进行了优化, 最终确定该试剂盒的反应体系为 : 基因组 DNA 2.5L, Bst DNA 聚合酶 0.5L (8U/L) , 检测基础液 19L, 0.2 mol/L 的 F3/B。
36、3 引物各 0.5L, 1.6 mol/L 的 FIP/BIP 引物各 1L。另 : 每 PCR 管反应体系上面加稳定液石蜡油 50L, PCR 管盖内壁加显色液 SYBR Green I 2 L/ 体系。 0055 上述基因组 DNA 通过常见的 CTAB 法提取得到。 0056 上述 LAMP 试剂盒的反应条件为 : 65 1 h, 80 5 min, 4保存。 0057 上述 LAMP 扩增产物的检测 : 所述扩增反应结束后, 将 PCR 管倒置并轻轻振荡, 使 PCR 管盖内的显色液与扩增产物充分混合染色, 根据染色结果判断检测结果, 绿色为阳性, 即待测样品中含有甘蔗黑穗病菌, 橙色。
37、为阴性, 即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。 0058 所述试剂盒还包括一份使用说明书, 所述试剂盒分装为 20 次反应 / 盒。 0059 实施例 4 所述 LAMP 试剂盒的特异性检测 对实施例 3 所述 LAMP 试剂盒进行特异性检测, 步骤如下 : S1. 基因组 DNA 提取 : 2014 年 3 月通过 CTAB 法利用基因组 DNA 提取液分别提取 5 株不 同地理来源的甘蔗黑穗病菌、 1株甘蔗赤腐病菌、 1株甘蔗眼点病菌、 1株甘蔗梢腐病菌、 1株 甘蔗宿根矮化病菌、 1株甘蔗白条病菌、 及1株玉米黑粉菌基因组DNA, 得到样品并依次编号 为 1 11 ; S2. 配制反应体系 :。
38、 总体系 25L, 其中, 基因组 DNA 2.5L, Bst DNA 聚合酶 0.5L (8U/L) , 检测基础液 19L, 0.2 mol/L 的 F3、 B3 引物各 0.5 L, 1.6 mol/L 的 FIP、 BIP 引物各 1 L。另外在每 PCR 管反应体系上面加稳定液石蜡油 50L, PCR 管盖内壁加 显色液 SYBR Green I 2 L/ 体系 ; S3. 环介导等温扩增 : 分别以样品 1 11 及 ddH2O(阴性对照, 标记为 12 号) 为模板, 采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区 ITS 序列设计的内外两对特异引物 F3、 B3(外引 物对) 和 FIP。
39、、 BIP(内引物对) 经过扩增得到扩增产物 ; F3 : 5- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3 ; B3 : 5-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3 ; FIP : 5- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3 ; BIP : 5- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3。 说 明 书 CN 104031997 A 8 7/8 页 9 0060 所述扩增反应的程序为 : 65 1 h, 80 5 min, 4保存。 0061 其中, 检测基础液为 dNTPs、 MgSO4及甜菜。
40、碱, 其配方是终浓度为 1.4mmol/L dNTPs、 0.8mmol/L 甜菜碱和 8mmol/L MgSO4。 0062 其中, 试剂盒中所述基因组 DNA 提取液为 CTAB 提取液, 其配方为 : 2% CTAB, 20mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 为 8.0), 1.4mol/L NaCl。 0063 其中, 试剂盒中所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组 DNA。 0064 S4. 扩增产物检测 : 扩增反应结束后, 将 PCR 管倒置并轻轻振荡, 使 PCR 管盖内的 显色液与扩增产物充分混合染色, 图 2 为染色结果。 0065 根据图。
41、 2 中染色结果判断检测结果, 绿色为阳性, 即待测样品中含有甘蔗黑穗病 菌, 橙色为阴性, 即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。本实施例中 1 12 号样品结果显示表 明 : 1 5 样品 (不同地理来源的甘蔗黑穗病菌) 阳性 (绿色) , 检测出甘蔗黑穗病菌, 而 6 11样品及阴性对照为阴性 (橙色) 。 检测结果表明该引物组及试剂盒对甘蔗黑穗病菌具有很 好的特异性。 0066 实施例 5 所述 LAMP 试剂盒的灵敏性检测 对实施例 3 所述 LAMP 试剂盒进行灵敏性检测, 步骤如下 : S1. 模板基因组DNA质量梯度 : 2014年3月采用10倍稀释法, 获得20ng/L、 2ng/L。
42、、 200pg/L、 20pg/L、 2pg/L、 200fg/L、 20fg/L、 2fg/L 系列质量梯度甘蔗黑穗病菌 基因组 DNA, 得到样品并依次编号为 1 8 ; S2. 配制反应体系 : 总体系 25L, 其中, 基因组 DNA 2.5L, Bst DNA 聚合酶 0.5L (8U/L) , 检测基础液 19L, 0.2 mol/L 的 F3、 B3 引物各 0.5 L, 1.6 mol/L 的 FIP、 BIP 引物各 1 L。另外在每 PCR 管反应体系上面加稳定液石蜡油 50L, PCR 管盖内壁加 显色液 SYBR Green I 2 L/ 体系 ; S3. 环介导等温扩。
43、增 : 分别以样品 1 8 及 ddH2O(阴性对照, 标记为 9 号) 为模板, 采 用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区 ITS 序列设计的内外两对特异引物 F3、 B3(外引物 对) 和 FIP、 BIP(内引物对) 经过扩增得到扩增产物 ; F3 : 5- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3 ; B3 : 5-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3 ; FIP : 5- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3 ; BIP : 5- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3。 0067。
44、 所述扩增反应的程序为 : 65 1 h, 80 5 min, 4保存。 0068 其中, 检测基础液为dNTPs、 MgSO4及甜菜碱, 其配方是终浓度为1.4 mmol/L dNTPs、 0.8 mmol/L 甜菜碱和 8 mmol/L MgSO4。 0069 其中, 试剂盒中所述基因组 DNA 提取液为 CTAB 提取液, 其配方为 : 2% CTAB, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 为 8.0) , 1.4 mol/L NaCl。 0070 其中, 试剂盒中所述阳性对照品为甘蔗黑穗病菌基因组 DNA。 0071 S4. 扩增产物检测 :。
45、 扩增反应结束后, 将 PCR 管倒置并轻轻振荡, 使 PCR 管盖内的 显色液与扩增产物充分混合染色, 图 3 为染色结果。 0072 根据图 3 中染色结果判断检测结果, 绿色为阳性, 即待测样品中含有甘蔗黑穗病 菌, 橙色为阴性, 即待测样品中不含甘蔗黑穗病菌。 本实施例中19号样品结果显示表明 : 说 明 书 CN 104031997 A 9 8/8 页 10 1 8 样品 (不同质量浓度的甘蔗黑穗病菌基因组 DNA) 阳性 (绿色) , 检测出甘蔗黑穗病菌, 而阴性对照为阴性 (橙色) 。检测结果表明该引物组对甘蔗黑穗病菌基因组 DNA 的最低检测 限量不超过 5fg/25L 反应体。
46、系。 0073 实施例 6 所述 LAMP 试剂盒检测甘蔗黑穗病菌 应用参照实施例3制备得到的甘蔗黑穗病菌LAMP可视化快速检测试剂盒进行检测, 具 体步骤如下 : S1. 基因组 DNA 提取 : 2014 年 4 月田间采集甘蔗品种新台糖 22 号蔗苗心叶 9 片 (有甘 蔗黑穗病早期症状, 但黑穗未抽出) , 通过 CTAB 法利用基因组 DNA 提取液对每片小苗心叶进 行甘蔗黑穗病菌基因组总 DNA 提取, 得到样品并依次编号为样品 2 10 ; S2. 配制反应体系 : 总体系 25L, 其中, 基因组 DNA 2.5L, Bst DNA 聚合酶 0.5L (8U/L) , 检测基础。
47、液 19L, 0.2 mol/L 的 F3、 B3 引物各 0.5 L, 1.6 mol/L 的 FIP、 BIP 引物各 1 L。另外在每 PCR 管反应体系上面加稳定液石蜡油 50L, PCR 管盖内壁加 显色液 SYBR Green I 2 L/ 体系 ; S3. 环介导等温扩增 : 分别以样品 2 10 及甘蔗黑穗病菌基因组 DNA (阳性对照, 标记 为 1 号) 及 ddH2O(阴性对照, 标记为 11 号) 为模板, 采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔 区 ITS 序列设计的内外两对特异引物 F3、 B3(外引物对) 和 FIP、 BIP(内引物对) 经过扩增 得到扩增产物 ; 。
48、F3 : 5- GGTGTTCAGAAGCACTCCAA-3 ; B3 : 5-ATTACGAAAGAGCTGGCGG-3 ; FIP : 5- CTTTTGGCCCATCTTCCCTGCCGTCGCGTCCAGCTTCTTG-3 ; BIP : 5- CTTCGTCCGTCTTTGCCTGTCATCGGTAGTGAGGGTTTTGC-3。 0074 所述扩增反应的程序为 : 65 1 h, 80 5 min, 4保存。 0075 其中, 检测基础液为dNTPs、 MgSO4及甜菜碱, 其配方是终浓度为1.4 mmol/L dNTPs、 0.8 mmol/L 甜菜碱和 8 mmol/L MgSO4。 0076 其中, 试剂盒中所述基因组 DNA 提取液为 CTAB 提取液, 其配方为 : 2% CTAB, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 为 8.0), 1.4 mol/L NaCl。 0077 S4. 扩增产物检测 : 扩增反应结束后, 将 PCR 管倒置并轻。