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1、(10)申请公布号 CN 104046639 A (43)申请公布日 2014.09.17 CN 104046639 A (21)申请号 201410313216.3 (22)申请日 2014.07.02 C12N 15/53(2006.01) C12N 9/02(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 陈凡国 黄舒 丁鹏程 张尚立 夏光敏 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (54) 发明名称。
2、 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3.1 及 其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种小麦山融 3 号甲硫氨酸亚 砜还原酶基因 TaMsrB3.1。本发明还公开了所述 基因 TaMsrB3.1 在拟南芥和小麦植株中提高其抗 盐/耐旱性的应用。 实验结果表明， 本发明所述转 基因植株比非转基因植株的抗盐 / 耐旱能力得到 了很大程度的提高， 为通过基因工程手段提高作 物抗盐 / 耐旱性提供了理论依据和实践基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 序列表 1 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11。
3、页 序列表1页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104046639 A CN 104046639 A 1/1 页 2 1. 一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3.1， 其特征在于 ： 所述基因 cDNA 的核苷 酸序列如 SEQ ID No.1 所示。 2.如权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1， 其特征在于 ： 所述小麦 是山融 3 号小麦。 3.权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1在提高植株抗盐/耐旱性 中的应用。 4. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述植株是小麦或拟南芥。 权 利 要 求 书 CN 1040466。
4、39 A 2 1/11 页 3 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3.1 及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物基因工程技术领域， 尤其涉及一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3.1 及其应用。 背景技术 0002 干旱和高盐等逆境是限制植物产量的重要因素。因此， 鉴定抗逆相关基因用于作 物改良是未来抗逆育种的关键策略之一。 Msr能被多种非生物胁迫诱导表达， 而且MSR可以 清除机体内过量的 ROS， 也可以体外催化因 ROS 氧化的 R 和 S 型 MetSO 的还原， 暗示其在植 物胁迫应答中发挥作用。 0003 小麦作为世界上最重要的粮食作物之一， 提高小麦产量一直。
5、是科研和育种工作者 们最为关注的研究课题。 然而， 近年来农业生态环境不断恶化， 许多土地处于干旱、 盐渍、 沼 泽、 冷土等逆境中， 干旱胁迫与盐胁迫尤其严重影响作物生长发育和产量。 因此加强小麦应 对各种非生物胁迫的能力是提高小麦产量最为有效的途径之一。 本实验室前期将小麦近缘 禾草中耐逆性极强的长穗偃麦草的染色质渐渗入小麦济南 177 的基因组， 创制了一批抗逆 新种质资源并从中选育出高产 / 耐盐小麦新品种山融 3 号 (SR3)。前期的盐旱处理 SR3 幼 苗构建的 cDNA 芯片显示其中的 TaMsrB3.1 有显著响应。Msr 在拟南芥、 水稻以及一些其他 植物中抗胁迫方面的作用。
6、已有初步结果， 但在主要粮食作物小麦中该基因的克隆、 功能验 证尚未见报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种抗盐和抗旱相关基因小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基 因 TaMsrB3.1， 以及利用该基因在提高植株抗盐 / 耐旱性中的应用。 0005 本发明的技术方案是 ： 从小麦山融 3 号 (SR3) 中分离得到小麦甲硫氨酸亚砜还原 酶基因 TaMsrB3.1， 在植物真核系统拟南芥中验证其功能， 再在转化小麦实验中验证其提高 抗盐和抗旱性。 0006 本发明所述的小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3.1， 其特征在于 ： 所述基因 cDNA 序列如 SEQ ID No.1 所示。其。
7、中， 所述小麦是山融 3 号小麦。 0007 本发明在小麦中克隆的甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3.1 与其他物种中的类 似基因相比同源性在4075之间。 对其保守区分析发现， 小麦中甲硫氨酸亚砜还原酶基 因 TaMsrB3.1 推导的氨基酸序列含有两个保守的 CxxC， 这两个 CxxC 用于结合 Zn2+， 为酶的 热稳定性和催化活性所必须。 和其它同类基因相比， 也存在保守序列的多态性， 比如在除了 以上两个功能相关的保守序列外， TaMsrB3.1 存在其它位点保守序列的差异， 这暗示在小麦 中该基因功能上的分化。 0008 本发明所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1。
8、在提高植株抗盐/耐旱性中 的应用。 0009 实验证实 ： 在逆境处理的条件下， 无论是盐还是旱处理， 转入本发明所述基因 说 明 书 CN 104046639 A 3 2/11 页 4 TaMsrB3.1 的植株过表达系的根长相比于野生型差异明显， 在逆境下生长良好， 说明该基因 的转化的确增强了植株 ( 小麦 ) 抗盐 / 旱的能力。 0010 本发明的有益效果 ： 利用现有的植物基因工程技术， 本发明首次克隆得到了小麦 SR3 甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3.1 并进行了功能验证。通过不同诱导子处理显示该 基因与抗盐和抗旱密切相关。故对于该基因 TaMsrB3.1 的研究具有重要。
9、理论意义和应用前 景。 附图说明 0011 图1 ： TaMsrA2.1基因的cDNA电泳图， 其中 ： M为DNA Marker， 泳道1-3为TaMsrB3.1 的 cDNA。 0012 图 2 ： 转 TaMsrB3.1 基因的拟南芥转基因植株筛选， 绿苗为转基因植株。 0013 图 3 ： 甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3.1 在转基因拟南芥中 RealTime-PCR 表达 分析， Clo-0 为野生型拟南芥， OE1 和 2 为不同转基因纯系。 0014 图 4 ： 转 基 因 的 拟 南 芥 中 甘 露 醇 处 理 分 析， WT 为 野 生 型， OE1 和 OE2 为 。
10、RealTime-PCR 分析的过表达系。 0015 图 5 ： 转基因的拟南芥中 NaCl 处理分析， WT 为野生型， OE1 和 OE2 为过表达系。 0016 图 6 ： 转基因的拟南芥中控水试验的析， WT 为野生型， OE1 和 OE2 为过表达系。 0017 图 7 ： 转基因小麦 PCR 筛选电泳结果， 1-22 为不同转基因植株， PC 为阳性对照， NC 为阴性对照， M 为 DNA Marker。 具体实施方式 0018 实施例 1、 TaMsrB3.1 的克隆 0019 1.1 提取小麦 SR3 总 RNA 0020 (1) 将 SR3 植物材料放入研钵中， 加入液氮将。
11、其研磨成粉 ； 0021 (2) 待液氮挥发后， 取约 100-200mg 粉末转入到 1.5ml 离心管中， 加入 1ml Trizol 提取液， 涡旋震荡使样品充分溶入提取液中， 室温静置 5min ； 0022 (3)4， 12,000rpm， 离心 10min 后， 取 0.9ml 上清液转移到新的 1.5ml 离心管中， 再加入 0.2ml 氯仿剧烈振荡混匀 15sec， 室温静置 2-5min ； 0023 (4)4， 12,000rpm， 离心 10min 后， 取 0.4ml 上清液转移到新的 1.5ml 离心管中， 加入 0.4ml 异丙醇后混匀， 室温静置 15mim ； 。
12、0024 (5)4， 12,000rpm， 离心 10min， 弃上清， 用 1ml75的乙醇洗涤沉淀两次后， 于 4， 8,000rpm， 离心 5min ； 0025 (6) 弃上清， 开盖于超净工作台中上干燥 RNA 约 2-5min， 加入 40l RNase-Free 水， 在 60中充分溶解 RNA10min ； 0026 (7) 用紫外分光光度计测 RNA 样品的 OD 值和浓度， A260/A280达到 1.7-2.0 为佳 ； 琼 脂糖凝胶电泳检测的质量。 0027 1.2cDNA 第一链的合成 0028 (1) 向离心管中依次加入下列物质 (40l 反应体系 ) ： 002。
13、9 说 明 书 CN 104046639 A 4 3/11 页 5 0030 0031 (2) 轻轻混匀后， 65变性 5min， 立即插到冰上， 冰浴至少 1min ； 0032 (3) 向离心管中依次加入下列物质 0033 0034 (4) 轻轻混匀后， 42恒温水浴 1h， 65变性 10min， -20保存备用。 0035 1.3PCR 反应 0036 TaMsrB3-F ： (1)-5 GCACGAGCCTGAAAAGGAG3 -(19) 0037 TaMsrB3-R ： (801)-5 GCGAGCATCGGTACTTGGG3 -(783) 0038 (1)Trans HiFi T。
14、aq 高保真酶扩增的反应体系如下 (50l 体系 ) ： 0039 0040 扩增条件如下 ： 0041 0042 反应结束后， 反应液于 0.8 TAE 琼脂糖凝胶电泳检测， 电泳结果如图 1 所示。 0043 (2) 克隆基因片段的纯化回收 (DP209 试剂盒 ) 0044 1) 将切下带有目的片段的凝胶放入 1.5ml 离心管并称凝胶重量， 加入 3 倍体积的 说 明 书 CN 104046639 A 5 4/11 页 6 溶胶液， 60溶胶 10min， 溶胶期间不断的翻转 ； 0045 2) 凝胶完全融化后， 全部吸取到回收柱中， 放置片刻 ； 0046 3) 室温， 12000r。
15、pm， 离心 30Sec， 弃溶液 ； 0047 4) 在柱中加入 700l 的漂洗液， 12000rpm， 离心 1min， 弃漂洗液 ； 0048 5) 在柱中加入 500l 的漂洗液， 12000rpm， 离心 1min， 弃漂洗液 ； 0049 6) 空柱， 12000rpm， 离心 2min ； 0050 7) 回收柱开盖晾干 1-2min， 放入新的干净的 1.5ml 离心管， 加入 60预热的 40l 灭菌水或者 EB 缓冲液， 放置 2min ； 0051 8)12000rpm 离心 1min， 所得溶液即为回收片段。 0052 1.4 连接目的片段与质粒 0053 用上述的回。
16、收目的片段与 pEasy-T1simple 载体， 25-30连接 10-20min。连接体 系如下 ： 0054 pEasy-T1simple 1l 0055 PCR 回收产物 100 200ng 0056 混匀并短暂离心， 25-30连接 10-20min。得到重组质粒 pEasy-T1simple， 用于后 面的反应。 0057 1.5 重组体转化 0058 首先用 CaCl2法制备感 E.coli DH10B 受态细胞。 0059 (1) 挑取单菌落接种于 5ml LB 液体培养基中， 37振荡培养过夜。 0060 (2) 按 1 ： 100-1 ： 50 的比例， 取 1ml 菌液接。
17、种于 100ml LB 液体培养基中， 37振荡 培养至菌液 OD600为 0.3-0.6。 0061 (3) 将菌液冰浴 10min， 4 4000rpm 离心 10min， 收集菌体。 0062 (4) 沉淀加 10ml 预冷的 0.1M CaCl2悬浮后， 冰浴 30min。 0063 (5)4 4000rpm 离心 10min。沉淀重悬浮于 1ml 预冷的 0.1M CaCl2， 混匀并冰水浴 中保存， 备用或加入 15的甘油置于 -70中保存。 0064 热击法转化 E.coli DH10B 0065 (1) 在无菌条件下吸取 100l 感受态细胞， 加入 1.5ml 预冷的无菌 E。
18、ppendorf 管 中， 加入 10l 连接产物 (1.4 中的重组质粒 )， 轻轻混匀， 立即置于冰上 30min。 0066 (2) 在 42恒温水浴中热激 90sec。 0067 (3) 冰浴 3-5min。 0068 (4) 加入 800l 不含抗生素的 LB 液体培养基， 混匀， 37振荡培养 45-60min。 0069 (5) 短暂离心收集菌体， 用 150l LB 液体培养基重悬菌体， 转至含抗生素 Amp、 X-gal、 IPTG 的 LB 固体平板上， 用无菌涂布棒涂布。 0070 (6) 将平板于 37正向放置 15-30min 至液体被吸收， 倒置平板， 于 37培养。
19、 12-16h， 观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。 0071 1.6 阳性重组子的鉴定 0072 首先利用碱裂解法提取含有重组子的大肠杆菌质粒 0073 (1)挑取白色单菌落， 接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中， 同时也 要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素 Amp 的固体 LB 平板中， 37震荡培养 12-16h ； 说 明 书 CN 104046639 A 6 5/11 页 7 0074 (2)12000rpm 离心 30sec， 收集培养物中的菌体， 尽量弃尽上清 ； 0075 (3) 加入 100l 冰预冷的溶液 I， 在涡旋器上使菌体充分重悬 。
20、； 0076 (4) 加入 200l 溶液 II， 立即将离心管缓缓颠倒数次， 冰浴 5-10min ； 0077 (5) 加入 150l 冰预冷的溶液， 缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成， 冰浴 5-10min ； 0078 (6)12000rpm 离心 3min， 取上清转入另一微量离心管中， 加入 2 倍体积 95乙醇， 混匀后， 室温静置 3min ； 12000rpm 离心 3min， 使质粒 DNA 沉淀 ； 0079 (7) 弃尽上清， 取 200l TE 溶液溶解沉淀 ； 0080 (8) 加入等体积冰预冷的 5mol/L LiCl 溶液， 冰浴 5min， 沉淀大量的 。
21、RNA ； 0081 (9)12000rpm， 离心 3min ； 0082 (10) 转移上清到另一离心管中， 加入 2 倍体积的 95乙醇， 混匀后于室温静置 3min， 12000rpm 离心 3min 使质粒沉淀 ； 0083 (11) 弃上清后用 1ml70乙醇洗涤沉淀， 弃尽液体 ； 0084 (12) 室温干燥后， 取 20l 含 RNaseA(20g/ml) 的 TE 溶液溶解沉淀， 37水浴 30 60min 消化 RNA。 0085 (13) 为减少损失， 可先用 TE 将总体积补充至 200l， 加入等体积的酚 - 氯仿 - 异 戊醇， 充分振荡 5-10min， 120。
22、00rpm 离心 5min ； 0086 (14) 取上清， 加入等体积的氯仿 - 异戊醇， 重复以上操作 ； 0087 (15) 取上清， 加入 1/10 体积的 3mol/L 醋酸钠 (pH5.3) 和 2 倍体积的无水乙醇 , 混匀后 -20放置 15min,12000rpm 离心 3min 使质粒沉淀 ； 0088 (16) 弃上清用 1ml70乙醇洗涤沉淀， 弃液体 , 用 40l TE 或无菌水溶解沉淀。 质粒用于后面的反应。 0089 提出质粒后进行酶切验证， 酶切反应体系如下表所示 ： 0090 重组质粒 16l 0091 EcoRI 限制性内切酶 2l 0092 10Buff。
23、er 2l 0093 将上述反应体系混匀并 5000rpm 离心 1min， 37水浴反应过夜， 然后进行 1的 TAE 琼脂糖凝胶电泳检测。 0094 1.7DNA 测序和基因命名 0095 挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜， 然后送上 海博亚生物技术有限公司测序， 得到测序结果 ： 全长基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所 示。 0096 经过 NCBI blast 分析， 初步确定为甲硫氨酸亚砜还原酶基因， 命名 TaMsrB3.1。 0097 实施例 2、 在拟南芥中对 TaMsrB3.1 进行功能验证 0098 2.1 植物过表达载。
24、体的构建 0099 (1) 设计引物 ： pSTART 载体是常用的过表达双元载体， 设计添加有合适酶切位点 ( 正向引物添加 Xba I， 反向引物添加 Sac I) 的引物 ： 0100 TaMsrB3.1-F-PSTART ： GCTCTAGAGCACGAGCCTGAAAAGGAG 0101 Xba I 说 明 书 CN 104046639 A 7 6/11 页 8 0102 TaMsrB3.1-R-PSTART ： TCGAGCTCGCGAGCATCGGTACTTGGG 0103 Sac I 0104 (2)PCR 反应 ： Trans HiFi Taq 高保真酶 PCR 扩增目的基因。
25、， 反应体系和条件同 1.3(1) ； 电泳回收目的片段的方法同 1.3(2)。 0105 (3)3连入pEasy-T1载体后转化大肠杆菌， 阳性重组子鉴定并提取质粒。 连接方法 同 1.4， 转化方法同 1.5， 阳性重组子鉴定和质粒提取方法同 1.6 ； 0106 (4) 克隆质粒和 pSTART 空载体质粒用相应合适的内切酶进行酶切 ( 引物上引入 的 )， 电泳后回收载体线性片段和目的片段 ； 酶切方法同 1.6， 片段的回收同 1.3(2)。 0107 (5) 使用 T4DNA ligase 把目的基因连入切好的 pSTART 空载体 ； 连接方法同 1.4。 0108 (6) 连接。
26、产物热激法转化 E.Coli DH10B 感受态细胞 ； 感受态的制备和转化方法同 1.5。 0109 (7) 阳性重组子的酶切验证方法同 1.6。 0110 2.2 植物表达载体转化农杆菌 0111 2.2.1 农杆菌感受态的制备 ( 无菌操作 ) 0112 (1) 取农杆菌 GV3101 接种于 10ml YEP 液体培养基中， 28摇床过夜 ； 0113 (2) 按 1 50 接种于 50ml YEP 液体培养基中， 28振荡培养 3-4 小时， 至 OD600值 为 0.4-0.6 ； 0114 (3)4， 4200rpm， 离心 10min， 收集菌体 ； 0115 (4) 弃上清，。
27、 加入 10ml 预冷的 0.15M 的 NaCl 悬浮菌体 ； 0116 (5) 重复步骤 3 ； 0117 (6) 弃上清， 加入 2ml 预冷的 20mM 的 CaCl2悬浮菌体， 分装于 1.5ml 离心管中， 现 用或加入终体积 7 DMSO 经液氮速冻后 -80保存备用。 0118 2.2.2 农杆菌的转化 ( 无菌操作 ) 0119 (1) 将 10l 植物表达载体质粒 DNA 加入 50l 的感受态细胞中， 轻弹离心管混 匀， 冰浴 30min ； 0120 (2) 液氮速冻 1min ； 然后 37水浴 5min， 立即冰浴 2-3min ； 0121 (3) 加入 1ml 。
28、YEP 培养基， 28培养 2-4h ； 0122 (4) 室温， 4000rpm， 离心 3min， 收集菌体 ； 0123 (5) 将菌涂布于含有相应抗生素的 YEP 培养平板上， 28倒置培养 48h。 0124 2.2.3 转化农杆菌的 PCR 验证 0125 对阳性农杆菌菌落进一步鉴定， 所用方法为菌落 PCR 技术， 反应体系如下 (20l 体系 ) ： 0126 说 明 书 CN 104046639 A 8 7/11 页 9 0127 PCR 扩增条件如下 ： 0128 0129 反应结束后， 反应液于 0.8 TAE 琼脂糖凝胶电泳检测。 0130 2.3 花侵染法转化拟南芥 。
29、0131 (1) 将适量待灭菌的拟南芥 (Col-0 野生型 ) 种子放入 1.5ml 离心管中， 加入 1ml75的乙醇 ( 含有 0.03体积比的 TritonX-100) 震荡消毒 1min， 再用 70的乙醇震 荡消毒 1min( 两次 )， 最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干， 然后用无菌的牙签将其点入 1/2MS 培养基中。 0132 (2) 生长至抽苔 1cm 时， 将顶端减掉以诱导侧生花序的生成 ； 0133 (3) 在转化前一天， 取 1ml 活化过的含有表达载体质粒的农杆菌 GV3101 加到含相 应抗生素及 50g/ml 利福平的 40ml YEP 培养基中， 28震荡培。
30、养至 OD600约为 1.0-1.2 ； 0134 (4) 室温， 4200rpm, 离心 10min， 收集菌体， 用浸染液 (5蔗糖， 0.05 Silwet L-77) 重悬菌体， 使 OD600约为 0.8 ； 0135 (5) 用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染， 待所有花序都被侵染后， 将拟南芥放 入真空干燥器中抽真空 1min ； 0136 (6) 用保鲜袋覆盖花序， 至于 20-22避光培养一天剪开顶部露出花序， 再培养一 天后揭去保鲜袋， 培养至种子成熟。 0137 2.4 转基因纯系的获得 0138 对收获的 T0 代种子进行表面消毒， 然后后均匀涂布于 1/2MS 平板上。
31、 ( 含相应的抗 生素卡那霉素 )。春化处理 3 天后移入人工气候室生长。萌发约 10 天， 子叶深绿色的植株 为转基因植株， 而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株(如图2所示)。 将转基因植 株转入土中生长直至收获得到 T1 代转基因种子， T1 代植株单株收种子， 每株收取的种子继 说 明 书 CN 104046639 A 9 8/11 页 10 续筛选， 将后代分离比为 3 1( 阳性阴性 ) 的阳性植株移栽后生长至收获 T2 代转基因 种子， 单株收种后， 每株收取的种子经筛选可以得到纯系 T2 代转基因种子。 0139 2.5 转基因植株的 RT-PCR 检测 0140 (1) 。
32、植株总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成方法参照 1.1 和 1.2. 0141 (2)TaMsrB3.1 基因 RT 引物序列 ： 0142 TaMsrB3.1-RT-F ： 5 GCACCGAGTATCCTGGAACA3 0143 TaMsrB3.1-RT-R ： 5 TTAGCAGCGAGCATCGGTAC3 0144 将逆转录得到的 cDNA 进行适当稀释并作为模板进行 PCR 反应， 用单拷贝基因 TaActin 作为内参， 先对其进行扩增， 在 200l 离心管中加入反应体系 ： 0145 0146 混匀体系并离心， 放入 PCR 仪中进行 PCR 反应。 0147 PCR。
33、 反应程序 ： 0148 0149 之后利用琼脂糖电泳分析PCR结果， 检测结果如图(3)所示， 表明成功获得了转基 因株系。 0150 2.6 不同浓度盐和甘露醇处理拟南芥 0151 (1) 将灭菌后的野生型拟南芥 (WT) 及转 TaMsrB3.1 过表达系 (OE) 的种子分别点 到 1/2MS 固体培养基上， 4下无光培养 3-4d， 后转移至到光照培养箱 22竖直培养 3d ； 0152 (2) 制备加有不同浓度的 NaCl(0,80mM,100mM,120mM)、 甘露醇 (0,200mM,300mM) 的 1/2MS 固体培养基 ； 0153 (3)将根长0.81cm且生长一致的。
34、幼苗移入各种1/2MS固体培养基中竖直培养， 要求每个培养皿中包括对照野生型和两个独立的过表达系幼苗， 培养 10d 后拍照并统计根 长。实验重复 3 次。 0154 结果表明， 过表达系和野生型相比， 在 300mM 甘露醇 ( 图 4) 和 80mM NaCl 下 ( 图 说 明 书 CN 104046639 A 10 9/11 页 11 5) 显著增强了对盐和胁迫渗透 ( 甘露醇模拟 ) 的抗性。 0155 2.7 控水实验 0156 将过表达系和野生型对照种子点到土中， 待长到 5-7 叶 ( 大约五到六周 ) 时， 控水 3 周， 之后再复水 3d。照相统计植株存活率 ( 存活率复水。
35、后叶片反绿的植株数 / 总植株 数， 实验重复 3 次。 0157 当结束控水并复水一段时间后， 过表达系恢复了正常的生长状态， 野生型仍然处 于枯死状态。结果显示了 TaMSRB3.1 的过表达使拟南芥对干旱的耐受性增强 ( 见图 6)。 0158 实施例 3、 在小麦济南 17 中过表达甲硫氨酸亚砜还原酶 TaMsrB3.1 0159 3.1 种子灭菌 0160 取济南 17 种子， 在超净工作台上以 75乙醇浸泡 1min， 无菌水洗 3 4 次， 接着 用 0.1的升汞浸泡 10min， 无菌水洗 3 4 次。 0161 3.2 春化处理 0162 灭菌后的种子置于含有适量无菌水的10。
36、0mL无菌三角瓶中， 在28100rpm摇床过 夜， 将露白的种子置于培养皿底用超纯水饱和的滤纸上 ； 之后放入 4冰箱暗培养四周， 待 胚芽鞘长到 1 3cm 即可切苗侵染。 0163 3.3 表达载体的构建和转化农杆菌 0164 利用 pSTART 构建载体， 方法同 2.1， 只是用 ubiquitin 启动子替换了 35S 启动子。 转化农杆菌及阳性菌的鉴定同 2.2。 0165 3.4 转化小麦 0166 (1) 含有植物表达载体的农杆菌活化 ： 切苗前 3 4 天活化菌种 ( 培养基 ： 10mL YEP+5L Kan+50L 利福平 ) ： 第一次活化用 20mL 培养基 +50。
37、 100L 菌液保菌 ( 浓 白 ) ； 第二次活化在切苗前一天晚上， 用 100mL 三角瓶将第一次活化后菌液 450L+40 60mL 培养基过夜摇至 OD 略大于 1.0。 0167 (2) 取 1ml 活化至 OD6oo达 1.0 的农杆菌菌液 ,10000rpm 离心 30s, 弃上清后加入 乙酰丁香酮使其终浓度达到 200M, 加入无菌水 10ml, 置于冰上备用。 0168 (3) 切苗和农杆菌转化 : 首先将胚芽鞘长至 1 3cm 的幼苗从根部开始下刀 , 斜 切暴露幼苗茎端生长点 ； 接着用微量注射器吸取 4L 菌液 , 滴于暴露的生长点 ； 将处理后 的幼苗置于己灭菌的培养。
38、皿中 , 室温培养至小麦健壮后移栽于土壤中 ； 在植株开花前将每 株麦穗进行套袋隔离。 0169 3.5 转基因小麦阳性株系的确定 0170 (1)基因组DNA的提取 ： T1T2代转化小麦长至34叶时,剪取3-5cm叶片,CTAB 法提取小麦叶片基因组 DNA ： 具体是剪碎叶片后用液氮研磨， 将粉末转移至 1.5ml 离心管 中， 然后加入 700l 预热至 65的 CTAB 提取缓冲液 ( 含 0.1的疏基乙醇 ) 混匀后置于 65水浴保温2h， 不时颠倒混匀。 之后加入等体积的酚氛仿异戊醇(25241)， 4 下10000g离心10min。 将液相转移至一干净离心管中， 加入等体积的氯。
39、仿:异戊醇(24:1)， 4下 10000g 离心 10min。将上清转移至一干净离心管中， 加入两倍体积无水乙醇， 温和混 匀， -20放置 30min 沉淀 DNA。4下 10000g 离心 10min， 弃去液体， 并用 70乙醇洗涤两 次， 室温干燥 DNA 后， 加入 100l RNA 酶液， 37水浴 30min。加入 200l 无水乙醇， 温和 混匀， -20放置 30min 沉淀 DNA。4 10000rpm 离心 10min， 弃去液体， 并用 70乙醇洗涤 说 明 书 CN 104046639 A 11 10/11 页 12 两次， 室温干燥 DNA 后， 加入 40l 无。
40、菌水溶解 DNA， 4保存待用。 0171 (2)PCR 法检测阳性转基因植株， 釆用 GUS 引物进行筛选 : 0172 GUSr:GACAGCAGCAGTTTCATCAATC 0173 GUSf:ATCCCACTATCCTTCGCAAG 0174 反应体系如下 (20l 体系 ) ： 0175 0176 扩增条件如下 ： 0177 0178 反应结束后， 反应液于 1 TAE 琼脂糖凝胶电泳检测 ( 图 7)， 依据电泳结果进行了 相关遗传分析， 获得了阳性小麦纯系。 0179 3.6 转基因小麦的耐盐 / 抗旱性分析 0180 小麦材料(对照JN17， 两个不同的转基因纯系)于1/2Ho。
41、agland液体培养基,22 长日照 ( 光照 16h/ 黑暗 18h) 条件下培养， 待材料生长到两叶一心时选择生长一致的进行 逆境处理 ： NaCl 的浓度分别为 0,100mM， 150mM ； PEG( 模拟抗旱 ) 的浓度分别为 0,10 (v/ v)， 15。处理 2 周后统计根长 , 三次重复。结果如表 1， 可以看出在没有逆境处理的条 件下， 对照和两个过表达系根长没有显著差异， 而在逆境处理的条件下， 无论是盐还是旱处 理， 过表达系的根长相比于野生型差异明显， 在逆境下生长良好， 说明该基因的转化的确增 强了小麦抗盐 / 旱的能力。 0181 表 1 转基因小麦逆境处理下根。
42、长分析 0182 说 明 书 CN 104046639 A 12 11/11 页 13 0183 1/2Hogland 液体培养基配方 ： 0184 说 明 书 CN 104046639 A 13 1/1 页 14 0001 序 列 表 CN 104046639 A 14 1/4 页 15 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104046639 A 15 2/4 页 16 图 4 说 明 书 附 图 CN 104046639 A 16 3/4 页 17 图 5 说 明 书 附 图 CN 104046639 A 17 4/4 页 18 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 104046639 A 18 。