稻米叶宽分子标记FLW7及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104004754 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 104004754 A (21)申请号 201410215059.2 (22)申请日 2014.05.20 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国水稻研究所 地址 310006 浙江省杭州市下城区体育场路 359 号 (72)发明人 张光恒 钱前 王莉 曾大力 胡江 朱丽 高振宇 徐杰 郭龙彪 董国军 任德勇 颜美仙 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 金祺 (54) 发明名称 稻米叶宽分子标记 FLW。

2、-7 及应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 水 稻 LOC_07g1200 的 核 苷 酸 序 列 的 分 子 标 记 FLW-7， 以 水 稻 作 为 物 种， 所 述 分 子 标 记 引 物 选 自 下 列 引 物 对，其 中 的 核 苷 酸 序 列 为 5 3 ， FLW-7，正 向 ： TGGGTGCTTCTTTTGTGGGA ；反 向 ： TGCAGTTGTGAAGAAGTGGAGA。本发明还同时提供了 上述分子标记 FLW-7 的开发方法。本发明的分子 标记 FLW-7 的用途是 ： 用于水稻上三叶叶片宽度 的鉴定和 / 或其后代宽叶植株的辅助选择育种。 具体为 。

3、： 当筛选培矮 64S 和扬稻 6 号的后代时， 选 择后代中带型与扬稻 6 号带型一致的单株用于宽 叶株型育种。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104004754 A CN 104004754 A 1/1 页 2 1. 水稻 LOC_07g1200 的核苷酸序列的分子标记 FLW-7， 以水稻作为物种， 其特征是 ： 所 述分子标记引物选自下列引物对， 其中的核苷酸序列为 5 3， FLW-7 正向。

4、 ： TGGGTGCTTCTTTTGTGGGA ； 反向 ： TGCAGTTGTGAAGAAGTGGAGA。 2. 如权利要求 1 所述的分子标记 FLW-7 的开发方法， 其特征是包括以下步骤 ： 1)、 以宽叶籼稻品种扬稻6号作为宽叶基因供体亲本与窄叶的籼稻培矮64S进行杂交、 回交和自交， 从而获得后代的宽叶水稻单株 ； 2)、 用 CTAB 法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗的基因组 DNA ； 3)、 采用 STS 分子标记方法进行水稻叶片宽度分子标记的筛选 ； 4)、 鉴定出一个 STS 分子标记 FLW-7。 3. 如权利要求 1 所述的分子标记 FLW-7 的用途， 其特征是 ： 用。

5、于水稻上三叶叶片宽度 的鉴定和 / 或其后代宽叶植株的辅助选择育种。 4. 根据权利要求 3 所述的分子标记 FLW-7 的用途， 其特征是 ： 当筛选培矮 64S 和扬稻 6 号的后代时， 选择后代中带型与扬稻 6 号带型一致的单株用于宽叶株型育种。 权 利 要 求 书 CN 104004754 A 2 1/9 页 3 稻米叶宽分子标记 FLW-7 及应用 技术领域 0001 本发明属于农业生物技术工程， 特别涉及与水稻叶片宽度有关的分子标记及其获 得方法和用途。 背景技术 0002 叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的直接器官。植物通过叶片进行光合作用， 把光能转变成植物生长发育所必须的化学。

6、能， 是地球上一切动物的生命源泉， 同时也是人 类社会的主要物质和能量的来源 1。叶片也可以通过蒸腾作用促进植物体中水分、 养分和 矿物质等的运输 2。水稻叶片是水稻生产和输出同化产物的 “源” 器官， 对生命活动的正常 运转有着重要的作用。叶片形态是影响株型的主要因素， 近年来， 在水稻育种领域， 先后有 多位育种家提出了水稻高产理论株型模式， 都提到了叶片形态的育种。水稻叶片形态是理 想株型育种的重要目标之一。因此， 水稻叶片形态直接影响到水稻产量的高低。 0003 在水稻的高产育种及株型改良中， 叶片形状一直是水稻遗传育种家关注的焦点之 一 3。水稻是一个多型性作物， 叶片的形态也极其多。

7、样。在一般的栽培品种中， 水稻叶片通 常为平展叶， 少数品种叶片为卷叶、 披叶、 窄叶等。 0004 前人对模式植物拟南芥和玉米的卷叶突变体研究发现， 叶片近轴 / 远轴面的发育 影响叶片的卷曲度。位于叶片上表皮泡状细胞形态是影响叶形的最主要细胞结构之一 ； 泡 状细胞的膨胀与渗透压， 也是影响叶片卷曲的重要因素。生理研究显示， 在水分胁迫下， 泡 状细胞失水收缩， 叶片卷曲 ； 当去除胁迫， 则泡状细胞吸水膨胀， 叶片恢复原状。 几乎所有涉 及叶片卷曲的基因都或多或少的影响泡状细胞的发育。 因此， 可以推测， 泡状细胞生长的状 况与叶片的卷曲也是密切相关的。在缺水、 干旱或重金属污染等外界环。

8、境因子影响下产生 的水稻叶片的卷曲， 最直接的反应也是泡状细胞的膨胀与渗透压两个方面受到了影响。而 目前科学家们普遍认可的细胞决定新理论认为， 自身基因水平的遗传因素是决定水稻叶片 形态建成的主要因素， 并开展了大量的水稻叶形分子调控层面的遗传与机理研究。借助水 稻卷叶的突变体分离克隆多个叶形基因， 至今已报道了 8 个影响叶片近轴 / 远轴面发育的 基因， 包括 SRL1、 SLL1、 RL9、 ACL1/ACL2、 ADL1 和 Roc5 等 4-9。水稻叶片中多个细胞类型、 组 织结构产生变异都可能导致叶片形态发生变化， 目前发现最常见的导致叶片发生卷曲的组 织细胞结构包括各级大小叶脉中。

9、的维管束组织、 角质层及维管束两侧的泡状细胞 10。 0005 生长素， 作为一种植物激素， 精密地调节着茎尖分生组织的叶原基分化和叶发育 的细胞生长， 与窄叶性状密切相关。在已克隆的 3 个窄叶基因 NAL7、 NAL1 及 NRL1 中， 基因 NAL7 与 NAL1 就分别涉及到生长素的生物合成与极性运输 ； 而 NRL1 则通过调控叶片维管组 织的发育， 影响叶片宽度。 0006 NAL7 编码的是 YUCCA 家族的一个含核黄素的单加氧酶， 参与生长素的生物合成。 该基因的突变， 引起生长素含量变化 ； 与野生型相比， 突变体在叶基部生长素含量下降， 而 在穗部及 4 日龄秧苗地上部。

10、中生长素含量上升。该突变体中生长素含量的变化最终导致窄 叶突变性状的出现 11。 NAL1编码一个植物特有的生物学功能未知的蛋白， 其主要在维管组 说 明 书 CN 104004754 A 3 2/9 页 4 织中表达。该基因的突变使得生长素的极性运输能力下降， 进而影响到维管组织的发育与 分布。突变体叶片中两条平行主脉之间的小脉数目比野生型明显减少， 造成窄叶表型 12。 NRL1 编码一个类纤维素合成酶蛋白 D4(OsCslD4)。在抽穗阶段， 该基因在生长旺盛的器官 中表达更高， 如根部、 叶鞘和穗 ； 而该基因的突变， 使其表达量下降， 叶片纵脉数减少， 表现 窄叶 13。 0007 。

11、培育高产超高产的水稻品种， 一直是水稻育种工作者的永恒目标。水稻叶片形态 作为理想株型的重要组成部分， 研究并筛选出生产上最有利用价值的叶形基因， 对水稻理 想株型育种具有十分重要的意义。 传统高产育种与栽培措施相结合已经对水稻产量的提高 做出了很大的贡献， 再提高的潜力已经非常小。 随着转基因技术的不断完善， 定点改造成为 可能。虽然当前水稻育种中叶片形态的优化主要还是通过传统的育种手段， 然而借助转基 因技术进行聚合育种， 将有利基因聚合到现有的优良水稻品种中， 更高效的完善株型结构。 0008 上文中涉及的参考文献如下 ： 0009 1 贺勇， 孙焕良， 孟桂元 . 水稻叶片形态研究进展。

12、 . 作物研究， 2008,22(5) ： 378-380。 0010 2 余琳 . 叶卷曲基因调控机制的研究 博士学位论文 . 上海 ： 上海生命科学研 究院， 2005。 0011 3高艳红， 吕川根.水稻卷叶性状的研究进展.金陵科技学院院报， 2006,20(1) ： 62-66。 0012 4Zou L P,Sun X H,Zhang Z G,Liu P,Wu J X,Tian C J,Qiu J L,Lu T G.Leaf rolling controlled by the homeodomain Leucine Zipper Class IV gene Roc5in rice. P。

13、lant Physiol,2011,156:1589-1602(Zou L P,Sun X H,Zhang Z G,Liu P,Wu J X,Tian C J,Qiu J L,Lu T G.2011. 水稻异亮氨酸拉链结构 IV 基因 Roc5 对卷叶调控。植物生理 学 ,156(3):1589-1602)。 0013 5Hibara K I,Obara M,Hayashida E,Abe M,Ishimaru T,Satoh H,Itoh J I,Nagato Y.The ADAXIALIZED LEAF1gene functions in leaf and embryonic patter。

14、n formation in rice.Developmental Biology,2009,334:345-354(Hibara K I,Obara M,Hayashida E,Abe M,Ishimaru T,Satoh H,Itoh J I,Nagato Y.近轴面基因ADL1基因在水稻叶片和胚胎模式形 成中的功能研究 .2009， 发育生物学 ,(334):345-354)。 0014 6Li L,Shi Z Y,Li L,Shen G Z,Wang X Q,An L S,Zhang J L.Overexpression of ACL1(abaxially curled leaf1)i。

15、ncreased bulliform cells and induced abaxial curling of leaf blades in rice.Molecular Plant,2010,3(5):807-817(Li L,Shi Z Y,Li L,Shen G Z,Wang X Q,An L S,Zhang J L.通过ACL1基因过表达增加水稻泡状细胞形成叶片反向卷曲。 分子植物， 2010， 3(5):807-817)。 0015 7Xiang J J,Zhang G H,Qian Q,Xue H W.SRL1encodes a putative GPI-anchored prot。

16、ein and modulates rice leaf rolling by regulating the formation of bulliform cells.Plant Physiol,2012,159:1-13(Xiang J J,Zhang G H,Qian Q,Xue H W.SRL1 通过 编码一个假定的 GPI 锚定蛋白调控泡状细胞的发育影响水稻叶片卷曲度。植物生理学， 2012,159:1-13)。 0016 8Zhang G H,Xu Q,Zhu X D,Qian Q,Xue H W.SHALLOT-LIKE1Is a KANADI 说 明 书 CN 104004754 。

17、A 4 3/9 页 5 transcription factor that modulates rice leaf rolling by regulating leaf abaxial cell development.Plant Cell,2009,21:719-735(Zhang G.H.,Xu Q.,Zhu X.D.,Qian Q.and Xue H.W.,2009, 转录因子 SLL1 通过水稻叶片近轴面细胞发育调节叶片卷曲度。植物细胞， 21:719-735)。 0017 9Fang L K,Zhao F M,Cong Y F,Sang X C,Du Q,Wang D Z,Li Y 。

18、F,Ling Y H,Yang Z L,He G H.Rolling-leaf14is a2OG-Fe(II)oxygenase family protein that modulates rice leaf rolling by affecting secondary cell wall formation in leaves.Plant Biotechnology J,2012,10:524-532(Fang L K,Zhao F M,Cong Y F,Sang X C,Du Q,Wang D Z,Li Y F,Ling Y H,Yang Z L,He G H.2012.卷叶14是一个编码。

19、2OG-Fe(II)氧化酶家族蛋白， 通过 影响次生细胞壁的形成来影响叶片卷曲度。植物生物技术 ,2012,10:524-532)。 0018 10 徐静， 王莉， 钱前， 张光恒。水稻叶片形态建成分子调控机制研究进展。作物 学报， 2013,39(5):767-774。 0019 11Fujino K,Matsuda Y,Ozawa K,Nishimura T,Koshiba T,W.Fraaije M,Sekiguchi H.NARROW LEAF7controls leaf shape mediated by auxin in rice.Mol Genet Genomics,2008,2。

20、79:499-507(Fujino K,Matsuda Y,Ozawa K,Nishimura T,Koshiba T,W. Fraaije M,Sekiguchi H. 水稻 NAL7 基因通过生长素调控控制水稻叶形发育。分子遗传基 因组学， 2008,279:499-507)。 0020 12Qi J,Qian Q,Bu Q Y,Li S Y,Chen Q,Sun J Q,Liang W X,Zhou Y H,Chu C C,Li X G,Ren F G,Palme K,Zhao B R,Chen J F,Chen M S,Li C Y.Mutation of rice Narrow le。

21、af1gene,which encodes a novel protein,affects vein patterning and polar auxin transport.Plant Physiol,2008,147:1947-1959(Qi J,Qian Q,Bu Q Y,Li S Y,Chen Q,Sun J Q,Liang W X,Zhou Y H,Chu C C,Li X G,Ren F G,Palme K,Zhao B R,Chen J F,Chen M S,Li C Y. 水稻窄叶突变基因 Nal1 通过编码主效蛋白影响叶脉发育和生长素极性运输。植物生理 学 ,2008,147。

22、(4):19471959)。 0021 13Hu J,Zhu L,Zeng D L,Gao Z Y,Guo L B,Fang Y X,Zhang G H,Dong G J,Yan M X,Liu J,Qian Q.Identification and characterization of NARROW AND ROLLED LEAF1,a novel gene regulating leaf morphology and plant architecture in rice.Plant Mol Biol,2010,73:283292(Hu J.,Zhu L.,Zeng D.L.i,Gao Z。

23、.Y.,et al.2010,1 个调控水稻叶 形和株型的重要基因 NAL1 的分离与鉴定 . 植物分子生物学 ,73:283292)。 发明内容 0022 本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶片宽度有关的分子标记及其开发 方法和用途， 本发明所得的分子标记 FLW-7 为水稻叶片宽度基因标记， 能用于水稻叶形的 辅助选择育种。 0023 为了解决上述技术问题， 本发明提供一种与水稻叶片宽度基因标记， 以水稻作为 物种， 该分子标记引物选自下列引物对， 其中的核苷酸序列为 5 3， 0024 FLW-7 正向 ： TGGGTGCTTCTTTTGTGGGA ； 0025 反向 ： TGCAG。

24、TTGTGAAGAAGTGGAGA。 0026 本发明还提供了上述分子标记的开发方法， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 104004754 A 5 4/9 页 6 0027 1)、 以宽叶籼稻品种扬稻 6 号 (93-11) 作为宽叶基因供体亲本与窄叶的籼稻培矮 64S(PA64S) 进行杂交、 回交和自交， 从而获得后代的宽叶水稻单株 ； 0028 2)、 用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵， Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法 提取水稻亲本幼苗及后代幼苗的基因组 DNA ； 0029 3)、 采用 STS( 插入 / 缺失片段， insertio。

25、n/deletions) 分子标记方法进行水稻叶 片宽度分子标记的筛选 ； 0030 4)、 鉴定出一个 STS 分子标记 FLW-7。 0031 本发明还同时提供了分子标记 FLW-7 的用途 ： 用于水稻上三叶叶片宽度的鉴定和 / 或其后代宽叶植株的辅助选择育种。 0032 作为本发明的分子标记FLW-7的用途的改进 ： 当筛选培矮64S(PA64S)和扬稻6号 (93-11) 的后代时， 选择后代中带型与扬稻 6 号 (93-11) 带型一致的单株用于宽叶株型育 种。 0033 与水稻叶片宽度相关的分子标记 FLW-7， 具体是用下述方法得到的 ： 0034 1)、 根 据 水 稻 基 。

26、因 注 释 网 站 (http:/rice.plantbiology.msu.edu) 公 布 的 LOC_07g1200 核苷酸序列， 设计、 发展 STS 分子标记， 用于检测窄叶亲本培矮 64S 和宽叶亲 本 93-11 的多态性 ； 通过测序以进一步确定引物 FLW-7 区间的序列在窄叶的培矮 64S 和宽 叶的 93-11 之间的差异 ； 通过杂交、 回交和自交结合标记辅助选择， 获得培矮 64S 背景的宽 叶的水稻新种质 ； 0035 2)、 用 CTAB 法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗基因组 DNA ； 0036 3)、 采用 STS 分子标记方法进行水稻叶片宽度分子标记筛选宽叶的。

27、水稻新种质 ； 0037 4)、 鉴定出一个 STS 分子标记 FLW-7， 经多态性检测， 发现其与水稻叶片宽度相关 联。 0038 采用 STS 分子标记 FLW-7 进行水稻叶片宽度筛选的方法具体是 ： 0039 (1)、 STS 标记在叶片宽度不同的培矮 64S 和 93-11 的 DNA 多态性分析 ： 0040 根据LOC_07g1200的核苷酸序列， 设计、 发展STS分子标记FLW-7， 用于检测窄叶培 矮 64S 和宽叶的 93-11 之间的多态性。引物委托上海申能博彩公司合成， 在 PTC-225PCR 仪 上进行PCR扩增， PCR反应体系为 ： 20ng/ul水稻基因组。

28、DNA1ul,10PCR Buffer2.0ul,25mM MgCl22.0ul,2mM dNTP2.0ul,10uM 引物 2.0ul( 正反向引物各 1.0ul),5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.2ul， ddH2O10.8ul， 总体系 20ul。反应程序 ： 95变性 5 分钟 ； 94变性 1 分钟， 55退火 1分钟， 72延伸1分钟， 40个循环 ； 72补齐10分钟 ； 产物检测 ： 在含有0.5ug/ul EB的 4.0的琼脂糖凝胶电泳， 紫外灯下观察并照相记录结果。 0041 (2)、 STS 标记 FLW-7 的序列区间在窄、 宽叶片品种培矮 64S 和 93-1。

29、1 间的基因组 序列差异 ： 0042 根据获得的 STS 分子标记 FLW-7， 用于 PCR 扩增窄叶品种培矮 64S 和宽叶品种 93-11 的基因组序列， PCR 扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序分析。PCR 扩 增参照上述 (1) 进行， PCR 产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的 PCR 产物 回收试剂盒 ( 离心柱型， 目录号 ： DP1403)。 0043 (3)、 利用 STS 标记 FLW-7 开展宽叶选择育种 ： 0044 宽叶基因供体亲本籼稻品种 93-11， 与窄叶品种培矮 64S 进行杂交， 通过回交、 自 说 明 书 CN 10400475。

30、4 A 6 5/9 页 7 交结合标记辅助选择， 将宽叶 93-11 中 LOC_07g1200 等位基因导入到窄叶培矮 64S 中， 选 择分离群体中带型与 93-11 带型一致的单株用于育种改良， 获得了若干份 PA64S 背景并带 93-11 的 LOC_07g1200 等位基因的材料 ； 收获这些植株上所结的种子， 检测其叶片宽度， 发 现其叶宽增加。 0045 水稻叶形是理想株型的重要组成部分。本发明采用分子生物学方法以宽叶的 93-11 为材料， 发展和筛选新的、 而且稳定的能增加叶片宽度的分子标记及其方法， 用于水 稻叶形的辅助选择育种 ； 由于研究所用的材料能有效增加叶片宽度，。

31、 其对水稻理想株型的 建成具有普遍性。 0046 本发明创造了水稻叶形建成相关 LOC_07g1200 的 STS 标记 FLW-7。利用这种 方法， 不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点， 可以有目标地将宽叶 93-11 的 LOC_07g1200 等位基因在实验室内选择获得并有目的地进行多个理想株型调控基因的聚 合， 从而培育出具水稻理想株型高产新品种。在本发明中， 当所得植株经检测出现培矮 64S 的条带或同时出现 93-11+ 培矮 64S 的条带时， 我们判定其属于窄叶的水稻 ； 当所得植株经 检测出现 93-11 的条带时， 我们判定其属于宽叶水稻。 0047 本发明可适用 。

32、93-11 和培矮 64S 之间的标记选择。因此， 本发明的结果在水稻理 想株型育种实践中具有重要意义。其优点具体归纳如下 ： 0048 (1)本发明的能调控水稻叶宽的分子标记， 是在通过窄叶培矮64S与宽叶的93-11 杂交、 回交和自交中筛选获得的， 能显著增加叶片宽度， 而且稳定存在， 可用于水稻理想株 型的辅助选择育种。 0049 (2) 本发明依据的是水稻叶形相关 LOC_07g1200 的核苷酸序列发展而获得的 STS 分子标记， 极大提高了辅助选择的效率。 附图说明 0050 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 0051 图 1 是 STS 标记 FLW-7 在。

33、窄叶品种培矮 64S(PA64S) 和宽叶品种 93-11 的电泳谱 带图 ； 0052 图 2 是引物 FLW-7 在 PA64S、 93-11 的 PCR 扩增片段序列及差异比较 ； 0053 图 2-1 为 STS 分子标记 FLW-7 在 PA64S 扩增片段序列 ； 0054 图 2-2 为 STS 分子标记 FLW-7 在 93-11 扩增片段序列 ； 0055 注 ： 带下划线的碱基为FLW-7标记前后引物 ； 带双下划线)的碱基为93-11中特有 插入序列 ； 方框内碱基为 PA64s 和 93-11 核苷酸差异。 0056 图 3 是亲本及不同叶片宽度的后代选择单株的 STS。

34、 标记 FLW-7 电泳谱带图 ； 0057 注 ： MMarker ； NL窄叶纯合单株 ； WL宽叶纯合单株 ； NF窄叶杂合单株。 0058 图 4 是 STS 分子标记 FLW-7 不同带型的后代单株上三叶宽度 ( 即， 标记 FLW-7 辅 助选育的 13 份材料的上三叶平均宽度 ) ； 0059 注 ： WL宽叶单株 ； NL窄叶纯合单株 ； NF窄叶杂合单株。 具体实施方式 0060 实施例1、 用STS标记FLW-7鉴定水稻叶片宽度的培矮64S和宽叶的籼稻93-11的 说 明 书 CN 104004754 A 7 6/9 页 8 多态性 0061 具体做法是 ： 从中国水稻研究。

35、所种质资源库中选取水稻材料培矮 64S 和宽叶 93-11， 用培矮 64S 和宽叶 93-11 杂交获得其 F1， 利用引物 FLW-7 鉴定其多态性 ( 图 1)。 0062 一、 提取 DNA 0063 1)、 配制 DNA 提取缓冲液 ： 0064 按顺序依次加1体积的DNA提取溶液(0.35M sorbitol ； 0.1M Tris,pH8.2 ； 0.005M EDTA ； 其余为水 )， 1 体积的核裂解液 (0.2M Tris,pH7.5 ； 0.05M EDTA ； 2M NaCl ； 0.055M CTAB ； 其余为水 ) 和 0.4 体积的 5 ( 质量浓度 )sar。

36、kosyl 溶液 ( 即十二酰 -N- 甲基甘氨 酸钠的水溶液 ) ； 最后加入亚硫酸氢钠， 配制成 DNA 提取缓冲液 ； 亚硫酸氢钠在 DNA 提取缓 冲液中的终浓度为 0.02M。 0065 上述 DNA 提取溶液的制备方法为 ： 在 0.35mol 的 sorbitol( 山梨糖醇 )、 0.1mol 的 Tris( 三羟甲基氨基甲烷， pH8.2)、 0.005mol 的 EDTA( 乙二胺四乙酸 ) 中加水定容至 1L。 0066 上述核裂解液的制备方法为 ： 在 0.2mol 的 Tris( 三羟甲基氨基甲烷， pH7.5)、 0.05mol 的 EDTA( 乙二胺四乙酸 )、 。

37、2mol 的 NaCl( 氯化钠 )、 0.055mol 的 CTAB( 十六烷基三 甲基溴化铵 ) 中加水定容至 1L。 0067 2)、 对上述培矮 64S、 宽叶 93-11、 F1 的水稻叶片分别进行如下处理 ： 0068 、 称取 0.1g 的水稻叶片用液氮研磨成粉状， 然后加入 700l 的上述步骤 1) 配 制的 DNA 提取缓冲液， 65水浴 40 分钟。再加 700l 的氯仿 : 异戊醇 (24:1 的体积比 )， 并混匀。10,000rpm 离心 5 分钟， 将上清液转移到新的离心管中。 0069 、 在上述步骤离心后所得的上清液中加2/31倍体积预冷(至4)的异丙 醇， 。

38、轻轻混匀至 DNA 沉淀。13,000rpm 离心 8 分钟， 倒出上清液。 0070 、 再用 70 ( 体积浓度 ) 的乙醇 200l 洗涤上述步骤所得的 DNA 沉淀物。 0071 、 将上述洗涤后的 DNA 晾干并溶于 100l TE 缓冲液或纯水中。 0072 、 紫外分光光度法检测上述步骤所得的 DNA 样品的浓度， 0.7的琼脂糖凝胶 电泳检测 DNA 的完整性。完整合适的 DNA 用于 PCR 扩增， 不完整的 DNA 则重新提取， 直至获 得完整的 DNA。 0073 二、 PCR 扩增 0074 1)、 反应体系 ： 0075 水 稻 基 因 组 DNA20ng/ul1ul。

39、， 10PCR Buffer2.0ul， 25mM MgCl2 2.0ul， 2mM dNTP2.0ul， 10uM 正反向引物各 1.0ul， 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.2ul， ddH2O10.8ul， 总体系 20ul。 0076 所述引物为 ： FLW-7 正向 ： TGGGTGCTTCTTTTGTGGGA ； 0077 反向 ： TGCAGTTGTGAAGAAGTGGAGA。 0078 2)、 反应程序 ： 0079 95变性 5 分钟 ； 94变性 1 分钟， 55退火 1 分钟， 72延伸 1 分钟， 40 个循环 ； 72补齐 10 分钟。 0080 三、 电泳检。

40、测 ： 0081 取扩增产物 20ul， 用 4.0的琼脂糖凝胶 ( 含有 0.5 ug/ul EB) 电泳， 紫外灯下 观察并照相记录结果。如图 1 所示。 说 明 书 CN 104004754 A 8 7/9 页 9 0082 在图 1 中， 培矮 64S 为 201bp 的条带， 93-11 为 232bp 的条带，“F1” 为 201bp+232bp 的条带。 0083 根据图 1， 我们能得出下述结论 ： STS 分子标记 FLW-7 能够检测 93-11 和培矮 64S 之间的多态性， 且培矮64S的PCR扩增产物片段要小于93-11， 由此表明FLW-7能用于93-11 和培矮 。

41、64S 之间的分子检测及其后代的标记辅助选择。 0084 实施例2、 用STS分子标记FLW-7鉴定窄叶品种培矮64S和宽叶籼稻93-11的序列 差异 0085 具体做法是 ： 应用STS分子标记FLW-7对培矮64S和93-11的基因组DNA进行PCR 扩增， 扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序， 比较其序列的差异 ( 图 2)。 0086 一、 提取 DNA 0087 同实施例 1。 0088 二、 PCR 扩增 0089 同实施例 1。 0090 三、 PCR 产物的回收 0091 PCR 产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的 PCR 产物回收试剂盒 ( 离心柱型， 。

42、目录号 ： DP1403)， 参照产品说明要求进行， 回收的 PCR 产物委托上海英骏生物 技术有限公司进行测序。 0092 根据图 2， 我们能得出以下结论 ： 培矮 64S 和宽叶 93-11 的 FLW-7 扩增产物存在 31 个碱基大小差异 ( 如图 2 中双下划线标记的碱基序列 )。这是我们能够使用 STS 分子标记 FLW-7 检测出其多态性的原因所在， 也是我们能用于其后代标记辅助选择的遗传基础。 0093 实施例 3、 利用 STS 标记 FLW-7 开展宽叶水稻的辅助选择育种 0094 具体做法是 ： 宽叶供体亲本品种93-11与窄叶亲本培矮64S依次进行杂交、 回交和 自交。

43、， 对所得后代结合分子标记FLW-7的辅助选择， 选择分离群体中带型与93-11带型一致 的单株用于育种改良。 0095 一、 提取 DNA 0096 同实施例 1。 0097 二、 STS 标记检测 0098 1)、 PCR 扩增 0099 同实施例 1 的步骤二。 0100 2)、 电泳检测 0101 同实施例 1 的步骤三。 0102 三、 STS 分子标记 FLW-7 开展水稻叶形的辅助选择育种 0103 宽叶供体亲本籼稻品种93-11与窄叶品种培矮64S进行杂交、 回交和自交， 结合分 子标记 FLW-7 的辅助选择， 选择分离群体中带型与 93-11 带型一致的单株进一步用于育种 。

44、改良 ( 图 3)， 淘汰带型与窄叶品种培矮 64S 的带型一致和杂合带型 ( 同时具有培矮 64S 和 93-11 带型 ) 的个体， 育种材料的上三叶宽度根据齐穗期的平均宽度进行检测。分析表明， 所选择的带 93-11 带型的 5 个单株的叶片宽度均比轮回亲本培矮 64S 明显增加 ( 图 4)。该 实验结果表明 ： STS 标记 FLW-7 可以用于水稻叶片宽度的辅助选择育种。 0104 备注说明 ： 说 明 书 CN 104004754 A 9 8/9 页 10 0105 图 3 和图 4 中的 “WL1 WL5” 均为 93-11 和培矮 64S 依次进行杂交、 回交和自交 获得的，。

45、 且是选择了 “带型与 93-11 带型一致” 的单株。 0106 对比例 1、 利用 STS 标记 FLW-7 判别水稻上三叶宽度。 0107 具体做法是 ： 将实施例3的步骤三中被淘汰的带型， 即与培矮64S的带型一致以及 杂合带型 ( 同时具有培矮 64S 和 93-11 带型 ) 的个体继续进行种植， 通过对其后代水稻单 株上三叶宽度进行测定， 进一步分析分子标记 FLW-7 辅助选择的可靠性。 0108 一、 提取 DNA 0109 同实施例 1。 0110 二、 STS 标记检测 0111 1)、 PCR 扩增 0112 同实施例 1。 0113 2)、 电泳检测 0114 同实施。

46、例 1。 0115 三、 STS 标记 FLW-7 判别上三叶平均宽度 ： 0116 随机选择了在实施例 3 的步骤三中被淘汰的 5 个带型与培矮 64S 一致的单株继续 种植， 经 STS 分子标记 FLW-7 检测， 其后代均表现与培矮 64S 一致的带型， 分别在成熟期检 测这些单株上三叶的平均宽度。另外， 随机选择其中 1 个杂合带型 ( 同时具有培矮 64S 和 93-11 带型 ) 的个体用于继续种植， 在其后代中随机选取 20 个单株， STS 分子标记 FLW-7 检 测表明， 该 20 个单株中有 5 个单株表现 93-11 带型， 10 个单株表现杂合带型， 5 个表现培矮。

47、 64S带型， 符合1:2:1的分离关系 ； 在成熟期， 分别检测这些单株上三叶的平均宽度。 表1是 这 20 个单株 ( 株系 ) 的上三叶平均宽度， 5 个与 93-11 带型一致的单株叶宽显著的高于培 矮64S的宽叶 ； 而在带型杂合10个后代单株的上三叶叶片宽度均小于与93-11带型一致的 单株 ； 5 个呈培矮 64S 带型的单株， 其上三叶叶片平均宽度类似亲本培矮 64S。该实验结果 表明 ： STS 分子标记 FLW-7 可以用于判别水稻上三叶的叶片宽度。 0117 表 1. 水稻叶片上三叶平均宽度及其对应的基因型 0118 选择的植株及其基因型后代单株及其基因型上三叶平均 (c。

48、m) NL-1(P)NL-1-3(P)1.290.027 NL-2(P)NL-2-4(P)1.320.022 NL-3(P)NL-3-2(P)1.330.034 NL-4(P)NL-4-6(P)1.320.019 NL-5(P)NL-5-3(P)1.360.026 NF-2(H) NF-2-2(Y)1.560.037 说 明 书 CN 104004754 A 10 9/9 页 11 NF-2-3(H)1.390.029 NF-2-5(P)1.280.035 NF-2-7(Y)1.580.036 NF-2-8(Y)1.660.021 NF-2-10(H)1.330.023 NF-2-11(P)1.350.037 NF-2-12(H)1.390.034 NF-2-15(H)1.320.031 NF-2-17(P)1.290.038 NF-2-18(H)1.390.041 NF-2-19(Y)1.580.025 NF-2-20(P)1.300.028 NF-2-24(Y)1.560.032 NF-2-26(H)1.330.027 NF-2-27(H)1.390.019 NF-2-28(H)1.420.033 NF-2-31(P)1.320.037 NF-2-34。