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1、(10)申请公布号 CN 104031897 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104031897 A (21)申请号 201410260801.1 (22)申请日 2014.06.12 C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 17/12(2006.01) (71)申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 2 号 (72)发明人 王国栋 迟光红 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 。
2、11245 代理人 关畅 陈晓庆 (54) 发明名称 大豆葫芦巴碱合成酶及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种大豆葫芦巴碱合成酶 (Trigonelline synthase,GmTS) 及其编码基因 与应用， 本发明公开的蛋白作为葫芦巴碱合成酶 底物特异性高， Na+、 K+、 NH4+、 Mg2+、 Mn2+、 Ca2+对其 酶活没有显著影响， 而重金属离子如 Zn2+、 Cu2+、 Fe2+、 Fe3+却可以显著抑制其酶活， 并且该蛋白在 pH6.0-7.0 时葫芦巴碱合成酶的酶活性较高。本 发明公开的一种蛋白， 为如下 (1) 或 (2) 所示 ： (1)SEQ ID N。
3、o.6所示的蛋白 ； (2)将SEQ ID No.6 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。 本发明公开的葫芦巴碱合成酶及其编码基因在大 豆分子辅助育种， 人类健康保健等领域有广泛的 应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104031897 A CN 104031897 A 1/1 页 2 1. 一种蛋白， 为如下 (1) 或 (2) 所示 ： (。
4、1)SEQ ID No.6 所示的蛋白 ； (2) 将 SEQ ID No.6 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失 和 / 或添加且功能相同的蛋白质。 2. 权利要求 1 所述蛋白的编码基因。 3. 根据权利要求 2 所述的编码基因， 其特征在于 ： 所述编码基因为如下中至少一种 ： 1)SEQ ID No.5 所示的 DNA 分子 ； 2)SEQ ID No.5 中自 5 末端起第 10 位至第 1077 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 3) 在严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 分子杂交且编码权利要求 1 所述蛋白质的 DNA 分子 ； 4) 与 1)。
5、 或 2) 或 3) 限定的 DNA 分子具有 90以上的同一性且编码权利要求 1 所述蛋 白质的 DNA 分子。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述编码基因的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌。 5. 一种制备葫芦巴碱合成酶的方法， 包括如下步骤 ： 将含有权利要求 2 或 3 所述编码 基因的重组载体导入大肠杆菌中， 得到重组菌 ； 将重组菌在含有氨苄青霉素的 LB Rich 液 体培养基中培养， 再加入 IPTG 诱导蛋白表达， 得到培养液 ； 将培养液离心收集细胞， 破碎细 胞， 亲和层析纯化蛋白即得。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述重组载体是将 。
6、SEQ ID No.5 所示的 DNA 分子插入 pMal-c2x 载体的多克隆位点得到的 ； 所述多克隆位点具体为 EcoR I 和 Xba I 酶切位点。 7.根据权利要求5或6所述的方法， 其特征在于 ： 所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3) pLysS ； 所述氨苄青霉素在所述 LB Rich 液体培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL， 具体为 100g/mL ； 所述培养的条件为 37， 振荡培养至 OD600 0.6-0.8， 具体为 OD600 0.8 ； 所述 IPTG 在所述培养液中的浓度为 0.2g/L-0.5g/L， 具体为 0.2g/L ； 所述诱导蛋白表。
7、达时的培养条件为 16， 振荡培养 ； 所述 LB Rich 液体培养基的配制方法如下 ： 10g 蛋白胨 ,5g 酵母提取物 ,5g NaCl,2g 葡 萄糖， 溶解在 ddH2O 中， 再用 ddH2O 定容至 1L， 灭菌。 8. 根据权利要求 5-7 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述亲和层析纯化蛋白所用的树 脂为可以结合 MBP 标签蛋白的树脂 ； 所述树脂具体为 Amylose 树脂。 9. 权利要求 1 所述的蛋白、 权利要求 2 或 3 所述的编码基因在制备葫芦巴碱合成酶中 的应用。 10. 权利要求 1 所述的蛋白、 权利要求 2 或 3 所述的编码基因在制备葫芦巴碱中的。
8、应 用。 权 利 要 求 书 CN 104031897 A 2 1/6 页 3 大豆葫芦巴碱合成酶及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种葫芦巴碱合成酶及其编码基因与应用 ； 特别涉及一种大豆葫芦巴 碱合成酶及其编码基因与应用， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 葫芦巴碱 (Trigonelline) 是尼克酸 (Nicotinate,NA)N 位甲基化的产物， 属于生 物碱类化合物。先前的同位素示踪表明 ( 主要利用 14C 标记的尼克酰胺， 即14C-NIM)， 葫芦 巴碱在高等植物中广泛存在， 尤其是在豆科植物的种子中大量积累， 此外， 黑麦、 莴苣、 向日 葵和番茄。
9、等作物的种子中也发现葫芦巴碱的积累。研究表明在三叶草和苜蓿 ( 豆科植物 ) 的子叶和胚轴中 14C-NIM 饲喂的主要产物是葫芦巴碱和部分的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)补偿合成途径代谢产物， 没有其它类型的尼克 酸衍生物。即使是在种子中无葫芦巴碱积累的菊花的子叶和胚轴中， 也发现有葫芦巴碱和 尼克酸的糖基化产物产生， 而在萝卜的子叶和胚轴中却只有葫芦巴碱的产生。研究人员通 过对绿豆种子进行更为详细的研究， 结果表明有 96葫芦巴碱存在于绿豆的子叶中， 这些 储存在子叶中的葫芦巴碱在萌发过程中会逐渐转移到胚轴中， 但葫芦。
10、巴碱非常稳定在萌发 过程中并不降解。 0003 关于葫芦巴碱在植物中的生理功能， 人们最早发现葫芦巴碱能够在 S 期阻止复制 子的结束， 从而阻止细胞并进入 G2 期， 后来的研究逐渐揭示葫芦巴碱不仅能调节细胞循 环， 还能调节植物的其他生理功能， 在咖啡和绿豆中均发现葫芦巴碱在幼嫩组织中的含量 远大于成熟组织， 进一步的研究表明葫芦巴碱具有促进幼芽生长的效果。在田皂角 ( 一种 豆科合萌属植物， Aeschynomene indica) 中人们研究发现葫芦巴碱与根瘤菌与植物的共 生过程相关。同时人们还发现葫芦巴碱参与多种植物的逆境应答过程， 如葫芦巴碱能够在 UV-B 照射中的大量积累， 进。
11、而增强植物的抗逆能力， 葫芦巴碱还参与盐胁迫， 干旱胁迫， 甚 至光合作用等一系列生理过程。 0004 在人们的日常生活中， 葫芦巴碱同样具有重要作用， 首先它是咖啡提取物中的一 种重要香料， 同时还是中药葫芦巴的主要活性成分之一。病理学研究表明其与多种疾病的 治疗密切相关 ： 葫芦巴碱含量在癌细胞和正常细胞中差异显著， 是癌细胞的重要生物标记， 研究还证明葫芦巴碱能够显著抑制癌细胞的存活， 12.5mg/kg 能使 P388 白血病小鼠生命延 长 31 ； 在对糖尿病的致病机理研究中， 人们发现葫芦巴碱可以改善二型糖尿病形成的氧 化胁迫。葫芦巴碱的药理功效还包括保护因为肾上腺素引起的心肌损伤。
12、， 和防治龋齿等。 0005 根据传统的生化知识， 催化尼克酸生成葫芦巴碱的应该是尼克酸 N- 甲基转移 酶 (NaNMT， EC2.1.1.7)， 属于甲基转移酶大类 (EC2.1.1 ； 该酶类可被细分 165 个小类 )， 相关催化反应如图 1 所示 ( 图 1 中， SAM 是作为甲基的供体， 反应生成产物葫芦巴碱 (Tg) 的同时， SAM(S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸 ) 生成 SAH(S-adenosyl-L-homocysteine， S- 腺 苷 -L- 高半胱氨酸 )。关于尼克酸 N- 甲基转移酶在分子层面的研究进展缓慢， 尽管早在 2004 年研究人员就从咖啡和大豆中纯化。
13、过葫芦巴碱合成酶 ( 又名尼克酸 -N- 甲基转移酶， 说 明 书 CN 104031897 A 3 2/6 页 4 Nicotinate-N-methyltransferase)， 并对蛋白生化活性进行了初步研究， 但到目前为止尚 未在任何物种中有其 cDNA 序列信息的报道。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种大豆葫芦巴碱合成酶 (Trigonelline synthase,GmTS) 及其编码基因与应用， 本发明提供的蛋白作为葫芦巴碱合成酶底物特异性高， Na+、 K+、 NH4+、 Mg2+、 Mn2+、 Ca2+对其酶活没有显著影响， 而重金属离子如 Zn2+、 Cu2+、 。
14、Fe2+、 Fe3+却可以显著抑制 其酶活， 并且该蛋白在 pH6.0-7.0 时葫芦巴碱合成酶的酶活性较高。 0007 本发明提供一种蛋白， 为如下 (1) 或 (2) 所示 ： 0008 (1)SEQ ID No.6 所示的蛋白 ； 0009 (2) 将 SEQ ID No.6 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加且功能相同的蛋白质。 0010 上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。 0011 上述编码基因中， 所述编码基因为如下中至少一种 ： 0012 1)SEQ ID No.5 所示的 DNA 分子 ； 0013 2)SEQ ID No.5 。
15、中自 5 末端起第 10 位至第 1077 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0014 3) 在严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 分子杂交且编码所述蛋白质的 DNA 分子 ； 0015 4) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 分子具有 90以上的同一性且编码所述蛋白质的 DNA 分子。 0016 含有上述任一所述编码基因的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。 0017 一种制备葫芦巴碱合成酶的方法也属于本发明的保护范围， 包括如下步骤 ： 将含 有上述任一所述编码基因的重组载体导入大肠杆菌中， 得到重组菌 ； 将重组菌在含有氨苄 青霉素的。
16、 LB Rich 液体培养基中培养， 再加入 IPTG 诱导蛋白表达， 得到培养液 ； 将培养液离 心收集细胞， 破碎细胞， 亲和层析纯化蛋白即得。 0018 上述方法中， 所述重组载体是将 SEQ ID No.5 所示的 DNA 分子插入 pMal-c2x 载体 的多克隆位点得到的 ； 0019 所述多克隆位点具体为 EcoR I 和 Xba I 酶切位点。 0020 上述任一所述的方法中， 所述大肠杆菌为大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS ； 0021 所述氨苄青霉素在所述 LB Rich 液体培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL， 具 体为 100g/mL ； 0022 所。
17、述培养的条件为 37， 振荡培养至 OD600 0.6-0.8， 具体为 OD600 0.8 ； 0023 所述 IPTG 在所述培养液中的浓度为 0.2g/L-0.5g/L， 具体为 0.2g/L ； 0024 所述诱导蛋白表达时的培养条件为 16， 振荡培养。 0025 所述 LB Rich 液体培养基的配制方法如下 ： 10g 蛋白胨 ,5g 酵母提取物 ,5g NaCl,2g 葡萄糖， 溶解在 ddH2O 中， 再用 ddH2O 定容至 1L， 灭菌。 0026 上述任一所述的方法中， 所述亲和层析纯化蛋白所用的树脂为可以结合 MBP 标签 蛋白的树脂 ； 0027 所述树脂具体为 A。
18、mylose 树脂。 说 明 书 CN 104031897 A 4 3/6 页 5 0028 上述蛋白、 上述任一所述的编码基因在制备葫芦巴碱合成酶中的应用也属于本发 明的保护范围。 0029 上述蛋白、 上述任一所述的编码基因在制备葫芦巴碱中的应用也属于本发明的保 护范围。 0030 上述蛋白在催化 SAM(S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸 ) 和 NA( 尼克酸 ) 生成 Tg( 葫芦巴碱 ) 和 SAH(S- 腺苷 -L- 高半胱氨酸 ) 中的应用也属于本发明的保护范围。 0031 本发明提供的葫芦巴碱合成酶及其编码基因在大豆分子辅助育种， 人类健康保健 等领域有广泛的应用前景。 附图说明 。
19、0032 图 1 为 NaNMT 催化的生化反应。 0033 图 2 为 GmTS 基因在大豆各组织中的相对表达丰度。 0034 图 3 为大豆 GmTS 蛋白的 SDS-PAGE 电泳。 0035 图 4 为大豆 GmTS 蛋白的葫芦巴碱合成酶酶活分析。 0036 图 5 为金属离子对大豆 GmTS 蛋白酶活的影响。 0037 图 6 为 pH 值对大豆 GmTS 蛋白酶活的影响。 0038 图 7 为大豆 GmTS 蛋白的底物特异性分析。 具体实施方式 0039 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0040 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从。
20、商业途径得到。 0041 下述实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值。 0042 大豆 (Glycine max cv Williams82) 在文献 “Shen et al.,(2014).Global Dissection of Alternative Splicing in Paleopolyploid Soybean.Plant Cell doi/10.1105/tpc.114.122739” 中公开过， 公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所 获得。 0043 pMal-c2x 载体购自 NEB， 产品目录号为 N8076。 0044 GoScriptTMReve。
21、rse Transcription System 反转录试剂盒购自 Promega 公司， 产品 目录号为 A5001。 0045 BL21(DE3)pLysS 菌株购自 Invitrogen 公司， 产品目录号为 C6060-03。 0046 LB Rich(1L)配制方法如下 ： 10g蛋白胨,5g酵母提取物,5g NaCl,2g葡萄糖， 溶解 在 ddH2O 中， 再用 ddH2O 定容至 1L， 高温高压灭菌。 0047 Amylose 树脂购自 NEB， 产品目录号为 E8021L。 0048 SAM(S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸 ) 购自 NEB， 产品目录号为 B9003S。 0。
22、049 14C-NA(羧酸位14C-标记的尼克酸)购自ARC(American Radiolabeled Chemicals) 公司， 产品目录号为 ARC0728。 0050 14C-NIM(14C- 标记的尼克酰胺 ) 购自 ARC 公司， 产品目录号为 ARC0794。 0051 实施例 1、 GmTS 蛋白及其编码基因的获得 0052 一、 Trizol 法提取大豆 (Glycine max cv Williams82) 的根、 子叶、 茎、 分生组织、 说 明 书 CN 104031897 A 5 4/6 页 6 叶芽、 叶、 花、 豆荚、 豆荚和籽粒、 籽粒的总 RNA， 并用 G。
23、oScriptTM Reverse Transcription System 反转录试剂盒分别反转录成 cDNA。 0053 二、 设计并合成如下序列 ： 0054 GmTS F:5 -CCGGAATTCATGGAGAAAGAGGAGAGCACGG-3 (SEQ ID No.1) 0055 ( 下划线所示序列为 EcoR I 酶切识别位点 ) 0056 GmTS R:5 -GCTCTAGATCATTTCTGAAACTCAAGGACAGTGT-3 (SEQ ID No.2) 0057 ( 下划线所示序列为 Xba I 酶切识别位点 ) 0058 Actin F:5-ATCTTGACTGAGCGT。
24、GGTTATTCC-3(SEQ ID No.3) 0059 Actin R:5-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3(SEQ ID No.4) 0060 三、 以步骤一中的大豆各组织的 cDNA 为模板， 以 Acitin F 和 Actin R 为引物进行 PCR 扩增， 调整模板浓度和循环数， 至在各模板下 PCR 扩增均未达到平台期且产物在 1琼 脂糖电泳后条带亮度一致， 使用此时的模板浓度和循环数， 以 GmTS F 和 GmTSR 为引物进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物， 将其进行 1琼脂糖凝胶电泳， 得到的电泳图使用 ImageJ 软 件进行定量分析， 并对各组织。
25、定量结果作图， 结果如图 2 所示。 0061 图 2 表明， GmTS 基因在大豆各组织中均有表达。 0062 四、 以花的 cDNA 为模板， 以 GmTS F 和 GmTS R 为引物进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增 产物如 SEQ ID No.5 所示。 0063 GmTS 基因的开放阅读框如 SEQ ID No.5 中自 5 末端起第 10 位至第 1077 位核苷 酸所示， GmTS 蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.6 所示。 0064 实施例 2、 重组质粒 pMal-GmTS 的构建 0065 EcoR I和Xba I双酶切SEQ ID No.5所示的DNA分子。
26、， 得到基因片段 ； EcoR I和Xba I 双酶切 pMal-c2x 载体， 得到载体大片段 ； 将基因片段与载体大片段连接， 得到重组质粒， 将其命名为 pMal-GmTS， 将 pMal-GmTS 送测序， 结果正确。 0066 对重组质粒pMal-GmTS进行结构描述如下 ： 在pMal-c2x载体的EcoR I和Xba I酶 切位点之间插入了SEQ ID No.5中自5 末端起第10位至第1077位核苷酸所示的DNA分子， 该质粒表达 GmTS-MBP 融合蛋白， 预期分子量约为 80KD。 0067 实施例 3、 GmTS 蛋白的制备以及酶活分析 0068 一、 重组菌和对照菌的。
27、构建 0069 将重组质粒 pMal-GmTS 导入大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 得到重组菌， 同时将 pMal-c2x 空载体导入大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS， 得到对照菌。 0070 二、 制备 GmTS 蛋白 0071 ( 一 ) 将 pMal-GmTS 重组菌接种至 LB Rich 液体培养基 ( 含 100g/mL 氨苄青霉 素 )， 37、 200rpm 振荡培养至 OD600 0.8， 然后加入 IPTG( 使其在培养体系中的终浓度为 0.2g/L) 同时振荡培养条件改为 16， 200rpm 振荡培养 16 小时， 得培养液。 0072 ( 二 ) 将培养液。
28、离心收集菌体。 0073 ( 三 ) 超声破碎细胞， 并采用 Amylose 树脂进行亲和层析纯化 ( 按照说明书操作 ) 蛋白， 最终得到 GmTS 蛋白液 ( 蛋白浓度为 0.6g/L)。GmTS 蛋白液的 SDS-PAGE 电泳图 如图 3 所示， 目的条带为 GmTS-MBP 融合蛋白 ( 其中 MBP 为标签蛋白， 用于纯化 )， 其大小与 预期分子量一致。 说 明 书 CN 104031897 A 6 5/6 页 7 0074 采用对照菌进行以上步骤 ( 一 ) 至 ( 三 ) 的操作， 可以得到纯化的 MBP 标签蛋白， 作为负对照。 0075 三、 GmTS 蛋白的酶活分析 0。
29、076 GmTS 酶促反应体系 ( 总体积 20 微升 ) ： 0.05mol/L 的 Tris-HCl(pH6.5),0.04mol/ L 的 SAM(S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸 ),0.05mmol/L 的 14C-NA( 羧酸位14C- 标记的尼克酸 ) 和 5ul 步骤二制备的 GmTS 纯化蛋白 (GmTS-MBP 融合蛋白 )， 余量为水。 0077 GmTS 酶促反应条件 ： 25反应 20 分钟。 0078 相关催化反应如图 1 所示。 0079 纯化的 MBP 标签蛋白替代步骤二制备的 GmTS 纯化蛋白进行上述反应， 作为负对 照。 0080 将GmTS催化反应产物、 负。
30、对照和标准品(Tg， 溶于水， 中文名葫芦巴碱)于高10厘 米TLC板离下沿2厘米处点样， 置于正丁醇 ： 乙酸 ： 水体积比为2:1:1的层析液中进行层析， 层析结束后晾干， 保鲜膜包裹后在磷屏中显像， 结果如图 4 所示。 0081 图 4 表明， SAM 和 14C-NA 经过步骤二制备的 GmTS 蛋白催化生成的反应产物 ( 图 4 中的 GmTS) 中含有 Tg， 而负对照组没有 Tg， 说明 GmTS-MBP 融合蛋中的 MBP 标签蛋白没有葫 芦巴碱合成酶的功能， 其中的 GmTS 蛋白具有葫芦巴碱合成酶的功能。 0082 四、 利用 ImageJ 软件， 对不同时间、 不同底物。
31、浓度的步骤二制备的 GmTS 纯化蛋白 酶促反应结果进行定量分析计算， 利用Hyper32软件根据米氏方程计算得到GmTS体外生化 参数， 结果如表 1 所示。 0083 表 1 GmTS 体外生化参数 0084 底物Km(M)Kcat(s-1)Kcat/Km(s-1M-1) 14C-NA 52.114.826.61.96(5.461.33)105 SAM45.512.418.53.75(4.501.94)105 0085 表 1 中的数值是三次独立试验的平均值 标准方差。 0086 实施例 4、 金属离子与 pH 值对大豆 GmTS 蛋白酶活的影响 ： 0087 一、 按照实施例 3 中步骤。
32、三 GmTS 蛋白的酶活分析步骤， 在 GmTS 酶促反应体系中加 入终浓度为 5mmol/L 的 NaCl、 KCl、 NH4Cl、 ZnSO4、 MgCl2、 CaCl2、 CuSO4、 MnSO4、 FeSO4、 FeCl3溶 液， 以不加其他离子的反应体系作为对照 (Ctrl)， 检测大豆 GmTS 纯化蛋白在 Na+、 K+、 NH4+、 Zn2+、 Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Fe2+、 Fe3+存在的条件下作为葫芦巴碱合成酶的酶活情况， GmTS 酶促反应条件与实施例 3 中步骤三相同。磷屏显像所得到的图， 以 Ctrl 组的 Tg 生成量为 100， 通过I。
33、mageJ软件定量分析Tg在各离子存在下的生成量， 对所得定量数据作图， 结果 如图 5 所示。 0088 图 5 表明， Na+、 K+、 NH4+、 Mg2+、 Mn2+、 Ca2+对大豆 GmTS 蛋白活性并没有显著影响， 但 重金属离子如 Zn2+、 Cu2+、 Fe2+、 Fe3+却可以显著抑制大豆 GmTS 蛋白的酶活性。 0089 二、 按照实施例 3 中步骤三 GmTS 蛋白的酶活分析步骤， 改变酶活分析体系中 Tris-HCl 的 pH 值分别为 5、 5.5、 6、 6.5、 7、 7.5、 8、 8.5、 9， 检测大豆 GmTS 纯化蛋白作为葫芦 说 明 书 CN 10。
34、4031897 A 7 6/6 页 8 巴碱合成酶的酶活性， GmTS酶促反应条件与实施例3中步骤三相同。 磷屏显像所得到的图， 以 pH6.5 组的 Tg 生成量为 100， 通过 ImageJ 软件定量分析 Tg 在 pH 值条件下的生成量， 对所得定量数据作图， 结果如图 6 所示。 0090 图 6 表明， 大豆 GmTS 纯化蛋白在 pH6.0-7.0 时作为葫芦巴碱合成酶的酶活性较 高。 0091 实施例 5、 GmTS 蛋白的底物特异性 0092 按照实施例 3 中步骤三 GmTS 蛋白的酶活分析步骤， 将 GmTS 酶促反应体系中 0.05mmol/L的 14C-NA置换成0.。
35、05mmol/L的14C-NIM(14C-标记的尼克酰胺)， 同时设置14C-NA 为对照， GmTS酶促反应条件与实施例3中步骤三相同， 得到两组反应产物(分别为图7中的 NIM 和 NA)。将两组反应产物于高 10 厘米 TLC 板离下沿 2 厘米处点样， 置于正丁醇 ： 乙酸 ： 水体积比为 2:1:1 的层析液中进行层析， 层析结束后晾干， 保鲜膜包裹后在磷屏中显像， 结 果如图 7 所示。 0093 图 7 表明， GmTS 蛋白作为葫芦巴碱合成酶的底物特异性高， 在催化 SAM 和 14C-NA 生成的产物中具有 Tg， 而不能催化 NA 的结构类似物 NIM 与 SAM 生成相应。
36、的甲基化产物。 说 明 书 CN 104031897 A 8 1/5 页 9 0001 序 列 表 CN 104031897 A 9 2/5 页 10 0002 0003 序 列 表 CN 104031897 A 10 3/5 页 11 0004 序 列 表 CN 104031897 A 11 4/5 页 12 0005 序 列 表 CN 104031897 A 12 5/5 页 13 序 列 表 CN 104031897 A 13 1/2 页 14 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104031897 A 14 2/2 页 15 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 104031897 A 15 。