用于溶酶体病基因筛查的引物组合物及试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104131094 A (43)申请公布日 2014.11.05 CN 104131094 A (21)申请号 201410359940.X (22)申请日 2014.07.25 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 封志纯 地址 100700 北京市东城区东四十条南门仓 5 号 (72)发明人 封志纯 王艳 杨尧 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 用于溶酶体病基因筛查的引物组合物及试剂 盒 (57) 摘要 本发明提供了一种用于溶酶体病基因筛查的。

2、 引物组合物及试剂盒， 所述引物组合物包括分别 针对 IDUA、 ARSB、 MAN2B1、 ST3GAL5、 SMPD1、 CTNS、 MFSD8、 IDS、 GUSB、 GBA、 ARSA、 GNPTAB、 SLC17A5、 CLN8、 SGSH、 HYAL1、 PSAP、 GNPTAG、 PPT1、 CTSD、 NAGLU、 FUCA1、 GLB1、 SUMF1、 MCOLN1、 TPP1、 HGSNAT、 NAGA、 GM2A、 GALC、 LIPA、 CLN3、 GALNS、 NEU1、 HEXA、 GLA、 NPC1、 CLN5、 MANBA、 HEXB、 ASAH1、 NPC2 。

3、和 CLN6 基因的非重复区域的多个引物序列。 (51)Int.Cl. 权利要求书 18 页 说明书 29 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书18页 说明书29页 (10)申请公布号 CN 104131094 A CN 104131094 A 1/18 页 2 1. 用于溶酶体病基因筛查的引物组合物， 其特征在于， 所述引物组合物包括分别针对 IDUA、 ARSB、 MAN2B1、 ST3GAL5、 SMPD1、 CTNS、 MFSD8、 IDS、 GUSB、 GBA、 ARSA、 GNPTAB、 SLC17A5、 CLN8、 SGSH、 HYAL1、 。

4、PSAP、 GNPTAG、 PPT1、 CTSD、 NAGLU、 FUCA1、 GLB1、 SUMF1、 MCOLN1、 TPP1、 HGSNAT、 NAGA、 GM2A、 GALC、 LIPA、 CLN3、 GALNS、 NEU1、 HEXA、 GLA、 NPC1、 CLN5、 MANBA、 HEXB、 ASAH1、 NPC2 和 CLN6 基因的非重复区域的多个引物序列。 2. 根据权利要求 1 所述的引物组合物， 其特征在于， 所述引物组合物具体包括如下引 物序列 ： 1) 针对 IDUA 基因的引物序列 2) 针对 ARSB 基因的引物序列 3) 针对 MAN2B1 基因的引物序列 权。

5、 利 要 求 书 CN 104131094 A 2 2/18 页 3 4) 针对 ST3GAL5 基因的引物序列 5) 针对 SMPD1 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 3 3/18 页 4 6) 针对 CTNS 基因的引物序列 7) 针对 MFSD8 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 4 4/18 页 5 8) 针对 IDS 基因的引物序列 9) 针对 GUSB 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 5 5/18 页 6 10) 针对 GBA 基因的引物序列 11) 针对 ARSA 基因的引物序列 。

6、12) 针对 GNPTAB 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 6 6/18 页 7 13) 针对 SLC17A5 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 7 7/18 页 8 14) 针对 CLN8 基因的引物序列 15) 针对 SGSH 基因的引物序列 16) 针对 HYAL1 基因的引物序列 17) 针对 PSAP 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 8 8/18 页 9 18) 针对 GNPTAG 基因的引物序列 19) 针对 PPT1 基因的引物序列 20) 针对 CTSD 基因的引物序列 权 利 。

7、要 求 书 CN 104131094 A 9 9/18 页 10 21) 针对 NAGLU 基因的引物序列 22) 针对 FUCA1 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 10 10/18 页 11 23) 针对 GLB1 基因的引物序列 24) 针对 SUMF1 基因的引物序列 25) 针对 MCOLN1 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 11 11/18 页 12 26) 针对 TPP1 基因的引物序列 27) 针对 HGSNAT 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 12 12/18 页 13 28)。

8、 针对 NAGA 基因的引物序列 29) 针对 GM2A 基因的引物序列 30) 针对 GALC 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 13 13/18 页 14 31) 针对 LIPA 基因的引物序列 32) 针对 CLN3 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 14 14/18 页 15 33) 针对 GALNS 基因的引物序列 34) 针对 NEU1 基因的引物序列 35) 针对 HEXA 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 15 15/18 页 16 36) 针对 GLA 基因的引物序列 37) 针对。

9、 NPC1 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 16 16/18 页 17 38) 针对 CLN5 基因的引物序列 39) 针对 MANBA 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 17 17/18 页 18 40) 针对 HEXB 基因的引物序列 41) 针对 ASAH1 基因的引物序列 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 18 18/18 页 19 42) 针对 NPC2 基因的引物序列 43) 针对 CLN6 基因的引物序列 3.用于溶酶体病基因筛查的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1或2所述 的引物组合。

10、物。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 ： 5x PCR离子扩增mix、 96 孔板和 96 孔板封口膜。 权 利 要 求 书 CN 104131094 A 19 1/29 页 20 用于溶酶体病基因筛查的引物组合物及试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及检测试剂盒领域， 具体地说， 涉及一种用于溶酶体病基因筛查的引物 组合物及试剂盒。 背景技术 0002 溶酶体病是由于基因缺陷使溶酶体中缺乏某种水解酶， 致使相应的作用底物不能 被降解而积蓄在溶酶体内， 造成细胞代谢障碍而导致疾病。溶酶体病是一类包含近 50 种 酶缺陷的疾病。单个溶酶体病的发病率较低， 但作为一。

11、类疾病其在人群中的发病率约为 1:6000-7000。据统计中国每年 1600 万新生儿中大约有 2700 人患有溶酶体病。溶酶体病 大多在婴幼儿和青少年时期起病， 明确致病原因和致病基因， 以及早期诊断和产前诊断对 于后续治疗和病人生活质量具有至关重要的意义。 0003 目前， 诊断溶酶体病多采用酶活性分析的方法， 筛查基因点突变常常采用以 PCR 为基础的聚丙烯酰胺凝胶电泳与各种基因突变检测技术相结合的方法， 多为一个技术方案 诊断一种疾病， 通量较低。由于溶酶体病涉及多种疾病， 且这些疾病临床表现大多相同， 鉴 别诊断困难， 这些方法在满足临床检测基因突变的需要时往往存在一定的局限性。 。

12、因此， 寻 找有效、 快速、 经济、 简单的溶酶体病诊断技术， 降低儿童 / 人类死亡率和致残率， 已成为保 障儿童健康中亟待解决的难题。 发明内容 0004 为了解决现有技术中存在的问题， 本发明的目的是提供一种用于溶酶体病基因筛 查的引物组合物及试剂盒。 0005 为了实现本发明目的， 本发明首先提供一种用于溶酶体病基因筛查的引物组合 物， 所述引物组合物包括分别针对 IDUA(ID:3425)、 ARSB(ID:411)、 MAN2B1(ID:4125)、 ST3GAL5(ID:8869)、 SMPD1(ID:6609)、 CTNS(ID:1497)、 MFSD8(ID:256471)、。

13、 IDS(ID:3423)、 GUSB(ID:2990)、 GBA(ID:2629)、 ARSA(ID:410)、 GNPTAB(ID:79158)、 SLC17A5(ID:26503)、 CLN8(ID:2055)、 SGSH(ID:6448)、 HYAL1(ID:3373)、 PSAP(ID:5660)、 GNPTAG(ID:2795)、 PPT1(ID:5538)、 CTSD(ID:1509)、 NAGLU(ID:4669)、 FUCA1(ID:2517)、 GLB1(ID:2720)、 SUMF1(ID:285362)、MCOLN1(ID:57192)、TPP1(ID:1200)、HG。

14、SNAT(ID:138050)、 NAGA(ID:4668)、 GM2A(ID:2760)、 GALC(ID:2581)、 LIPA(ID:3988)、 CLN3(ID:1201)、 GALNS(ID:2588)、 NEU1(ID:4758)、 HEXA(ID:3073)、 GLA(ID:2717)、 NPC1(ID:4864)、 CLN5(ID:1203)、 、 MANBA(ID:4126)、 HEXB(ID:3074)、 ASAH1(ID:427)、 NPC2(ID:10577) 和 CLN6(ID:54982) 基因非重复区域的多个引物序列。 0006 进一步地， 所述引物组合物具体包括。

15、如下引物序列 ： 0007 1) 针对 IDUA 基因的引物序列 0008 说 明 书 CN 104131094 A 20 2/29 页 21 0009 2) 针对 ARSB 基因的引物序列 0010 0011 0012 3) 针对 MAN2B1 基因的引物序列 0013 说 明 书 CN 104131094 A 21 3/29 页 22 0014 4) 针对 ST3GAL5 基因的引物序列 0015 0016 5) 针对 SMPD1 基因的引物序列 0017 说 明 书 CN 104131094 A 22 4/29 页 23 0018 6) 针对 CTNS 基因的引物序列 0019 0020。

16、 0021 7) 针对 MFSD8 基因的引物序列 0022 说 明 书 CN 104131094 A 23 5/29 页 24 0023 8) 针对 IDS 基因的引物序列 0024 0025 9) 针对 GUSB 基因的引物序列 0026 0027 说 明 书 CN 104131094 A 24 6/29 页 25 0028 10) 针对 GBA 基因的引物序列 0029 0030 11) 针对 ARSA 基因的引物序列 0031 说 明 书 CN 104131094 A 25 7/29 页 26 0032 0033 12) 针对 GNPTAB 基因的引物序列 0034 说 明 书 CN 。

17、104131094 A 26 8/29 页 27 0035 13) 针对 SLC17A5 基因的引物序列 0036 0037 说 明 书 CN 104131094 A 27 9/29 页 28 0038 14) 针对 CLN8 基因的引物序列 0039 0040 15) 针对 SGSH 基因的引物序列 0041 0042 16) 针对 HYAL1 基因的引物序列 0043 说 明 书 CN 104131094 A 28 10/29 页 29 0044 0045 17) 针对 PSAP 基因的引物序列 0046 0047 18) 针对 GNPTAG 基因的引物序列 0048 说 明 书 CN 1。

18、04131094 A 29 11/29 页 30 0049 19) 针对 PPT1 基因的引物序列 0050 0051 0052 20) 针对 CTSD 基因的引物序列 0053 0054 21) 针对 NAGLU 基因的引物序列 0055 说 明 书 CN 104131094 A 30 12/29 页 31 0056 22) 针对 FUCA1 基因的引物序列 0057 0058 23) 针对 GLB1 基因的引物序列 0059 说 明 书 CN 104131094 A 31 13/29 页 32 0060 24) 针对 SUMF1 基因的引物序列 0061 0062 0063 25) 针对 。

19、MCOLN1 基因的引物序列 0064 说 明 书 CN 104131094 A 32 14/29 页 33 0065 26) 针对 TPP1 基因的引物序列 0066 0067 27) 针对 HGSNAT 基因的引物序列 0068 说 明 书 CN 104131094 A 33 15/29 页 34 0069 28) 针对 NAGA 基因的引物序列 0070 0071 29) 针对 GM2A 基因的引物序列 0072 0073 30) 针对 GALC 基因的引物序列 说 明 书 CN 104131094 A 34 16/29 页 35 0074 0075 31) 针对 LIPA 基因的引物序。

20、列 0076 0077 32) 针对 CLN3 基因的引物序列 0078 说 明 书 CN 104131094 A 35 17/29 页 36 0079 0080 33) 针对 GALNS 基因的引物序列 0081 0082 34) 针对 NEU1 基因的引物序列 0083 说 明 书 CN 104131094 A 36 18/29 页 37 0084 35) 针对 HEXA 基因的引物序列 0085 0086 36) 针对 GLA 基因的引物序列 0087 0088 37) 针对 NPC1 基因的引物序列 0089 说 明 书 CN 104131094 A 37 19/29 页 38 009。

21、0 0091 38) 针对 CLN5 基因的引物序列 0092 说 明 书 CN 104131094 A 38 20/29 页 39 0093 39) 针对 MANBA 基因的引物序列 0094 0095 0096 40) 针对 HEXB 基因的引物序列 0097 说 明 书 CN 104131094 A 39 21/29 页 40 0098 41) 针对 ASAH1 基因的引物序列 0099 0100 0101 42) 针对 NPC2 基因的引物序列 0102 说 明 书 CN 104131094 A 40 22/29 页 41 0103 43) 针对 CLN6 基因的引物序列 0104 0。

22、105 本发明还提供了用于溶酶体病基因筛查的试剂盒， 所述试剂盒包括前述引物组合 物。 0106 进一步地， 所述试剂盒还包括 ： 5x PCR 离子扩增 mix(0.1U TagPolymerase/l， 500M dNTP， 20mM Tris-HCl(PH8.3)， 100mM KCl， 3mM MgCl2)， 96 孔板， 96 孔板封口膜。 0107 本发明的有益效果在于 ： 0108 本发明引物组合物和试剂盒可一次性地对粘多糖贮积症 (10 种类型 )、 寡糖贮积 症 (5 种类型 )、 鞘脂代谢障碍 (15 种类型 )、 黏脂病 (4 种类型 )、 脂质贮积症 (3 种类型 )、。

23、 溶酶体转运障碍 (3 种类型 ) 和神经元蜡样质脂褐素沉积病 (9 种类型 ) 等 49 种溶酶体病 进行基因诊断 ( 具体诊断的疾病见表 1)， 对溶酶体病的分子诊断覆盖率达到 90以上， 特 异性好， 灵敏度高。 很好的改变了以往一次实验只能检测一种类型疾病的现状， 大大提高了 检测效率， 可明确致病原因和致病基因， 对于后续的治疗也有重要的意义。 0109 表 1 49 种溶酶体病及相应基因 0110 说 明 书 CN 104131094 A 41 23/29 页 42 0111 说 明 书 CN 104131094 A 42 24/29 页 43 具体实施方式 0112 以下实施例用。

24、于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0113 实施例 1 用于溶酶体病基因筛查的引物组合物 0114 根 据 Genbank 中 公 开 的 IDUA(ID:3425)、 ARSB(ID:411)、 MAN2B1(ID:4125)、 说 明 书 CN 104131094 A 43 25/29 页 44 ST3GAL5(ID:8869)、 SMPD1(ID:6609)、 CTNS(ID:1497)、 MFSD8(ID:256471)、 IDS(ID:3423)、 GUSB(ID:2990)、 GBA(ID:2629)、 ARSA(ID:410)、 GNPTAB(ID:79158)、 SL。

25、C17A5(ID:26503)、 CLN8(ID:2055)、 SGSH(ID:6448)、 HYAL1(ID:3373)、 PSAP(ID:5660)、 GNPTAG(ID:2795)、 PPT1(ID:5538)、 CTSD(ID:1509)、 NAGLU(ID:4669)、 FUCA1(ID:2517)、 GLB1(ID:2720)、 SUMF1(ID:285362)、MCOLN1(ID:57192)、TPP1(ID:1200)、HGSNAT(ID:138050)、 NAGA(ID:4668)、 GM2A(ID:2760)、 GALC(ID:2581)、 LIPA(ID:3988)、 C。

26、LN3(ID:1201)、 GALNS(ID:2588)、 NEU1(ID:4758)、 HEXA(ID:3073)、 GLA(ID:2717)、 NPC1(ID:4864)、 CLN5(ID:1203)、 、 MANBA(ID:4126)、 HEXB(ID:3074)、 ASAH1(ID:427)、 NPC2(ID:10577) 和 CLN6(ID:54982) 基因序列， 针对上述基因序列注释的外显子及外显子和内含子交界的区域 设计 18-40bp 长度的引物序列 ； 得到的扩增产物长度为 125-175bp 之间。得到说明书中所 述序列组合物。 0115 实施例 2 用于溶酶体病基因筛查。

27、的试剂盒 0116 本实施例所述试剂盒主要包括 ： 2x引物组合物， 5x PCR离子扩增mix(PCR缓冲液、 dNTPs、 Taq 酶等 )， 96 孔板和 96 孔板封口膜。 0117 所述试剂盒还包括如下成分 ( 由 Life technologies 公司提供 ) ： 0118 Ion Xpress Barcode Adaptors 1-16 Kit(Cat.no.4471250) ； 0119 MyOneTM Streptavidin C1 beads(Cat.no.IVGN65001) ； 0120 Ion PITM Template OT2 200 Kit v3(Cat.no.。

28、4488318) ； 0121 Ion Library Quantitation Kit(Cat.no.4468802)。 0122 实施例 3 用于溶酶体病基因筛查的试剂盒的应用 0123 1. 样本要求 0124 要求 DNA 样品 30ng 以上。 0125 2.DNA 文库的构建 0126 2.1 PCR 扩增基因组 DNA 的目标区域 0127 2.1.1 将每一个 DNA 和引物组合物混合， 并 5XPCR 离子扩增 mix(PCR 缓冲液、 dNTPs、 Taq 酶等 ) 和去离子水加入 PCR96 孔板的每个反应孔内。如扩增 20ul 体系， 5X PCR 离子扩增 mix 加。

29、 4ul， 引物组合物加 10ul， 去离子水加 5ul， DNA 样本加 10ng。 0128 2.1.2 用 96 孔板封口膜密封 PCR 板， 充分震荡， 简单离心 PCR 板尽可能回收样本 到管底部。然后置于 PCR 仪内， 运行一下程序以扩增基因组上目标区域。 0129 2.2 消化部分引物序列 0130 2.2.1 轻度离心 PCR 板将反应后溶液收集到管底。慢慢揭掉 96 孔板的封膜。往 每个混合反应液中加入 2 微升 FuPa Reagent(Life technologies)， 总体系达到 22 微升。 0131 2.2.2 使用96孔板封口膜将96孔板封紧， 充分振荡混匀。

30、， 轻度离心将液体收集到 管底 ( 也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少 5 次来混匀 )。 0132 2.2.3 将 96 孔版放入 PCR 仪， 按以下程序运行。 0133 说 明 书 CN 104131094 A 44 26/29 页 45 0134 2.3 将接头连接至扩增产物并纯化 0135 2.3.1 如果有可见的沉淀物在 Switch(Life technologies) 溶液中， 通过室温下 震荡或上下吹吸来溶解并重悬。 0136 2.3.2 小心去除 PCR 板上的封膜并加入以下成分到每个反应孔内消化样本。在加 入之前可先混合 Switch 溶液和接头。 0137 0。

31、138 2.3.3 在每个反应孔内加入 2 微升 DNA 连接酶。 0139 2.3.4 使用96孔板封口膜将96孔板封紧， 充分振荡混匀， 轻度离心将液体收集到 管底 ( 也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少 5 次来混匀 )。 0140 2.3.5 将 96 孔版放入 PCR 仪， 按以下程序运行。 0141 0142 2.4 纯化未扩增的文库 0143 使用XP 试剂 1.5x 样本体积。 0144 2.4.1 小心地揭去封板膜并向每个文库中加入 45 微升 (1.5x 样本体积 ) 的 XP 试剂。用枪吹打 5 次使 DNA 与磁珠悬浮液充分混匀。 0145 2.4.2 将混合。

32、液置于室温 5 分钟。 0146 2.4.3 将 96 孔板置于磁力架上， 静置 2 分钟或者等溶液变清澈。小心地吸走并弃 掉上清， 不要扰动磁珠。 0147 2.4.4 向孔中加入 150L 新鲜配制的 70乙醇， 在磁力上来回移动 96 孔板来洗 涤磁珠， 然后小心地弃去上清， 不要扰动磁珠。 说 明 书 CN 104131094 A 45 27/29 页 46 0148 2.4.5 重复第 4 步， 进行第二次洗涤。 0149 2.4.6 确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。将板放置于磁力架上， 室温空气干燥 5 分钟， 注意不要过度干燥。 0150 2.4.7 将96孔板从磁力架上拿开， 在。

33、每孔中加入50L Low TE充分浸润磁珠。 使 用 96 孔板封口膜将 96 孔板封紧， 充分振荡混匀， 轻度离心将液体收集到管底 ( 也可以选择 用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少 5 次来混匀 )。 0151 2.4.8 将 96 孔板置于磁力架上 2 分钟。上清液中含有文库。取出 5L 上清， 结 合 495L 无核酸水， 用于文库定量。 0152 2.5 文库定量和稀释 0153 通过 qPCR 试剂盒 Ion Library Quantitation Kit(Cat.no.4468802) 来确定 Ion Ampliseq library的浓度。 每个样本， 标准文库和阴性对照必须。

34、在20微升反应体系内做两 次技术重复。 0154 外显子文库通常产量在 100-500pM。 0155 2.5.1 准备 3 个连续 10 倍稀释的 E.coli DH10B 标准文库 ( 原始浓度 68Pm, 该文 库来至于Ion Library Quantitation Kit)分别浓度为6.8pM， 0.68pM， 0.068pM。 标记这些 作为标准文库和在定量 PCR 仪器软件内记录这些浓度。 0156 2.5.2 准备反应混合溶液。对每一个样本， 对照和标准文库， 都混合 20 微升 2XMasterMix 和 2 微升的 20X IonAssay 并混合均匀。分装 11 微 升的。

35、混合液到每个 PCR 反应孔内。 0157 2.5.3 加 9 微升的稀释 100 倍的 Ion AmpliSeq library 或 9 微升的每个已稀 释好的标准文库到每个 PCR 反应孔内 ( 每个样两个 PCR 孔做重复 )。总反应体系 20 微升。 0158 2.5.4 编辑定量 PCR 仪的反应程序如下 ： 0159 输入已稀释好的标准文库的浓度 ； 0160 ROXTM参考荧光作为背景参考荧光 ； 0161 选择反应体系 20 微升 ； 0162 TaqMan 探针报告子和淬灭子 ： FAM dye/MGB 0163 Ion Library TaqMan qPCR Mix 能被应。

36、用在多种定量 PCR 仪器上。下表的循环程 序可作为应用该试剂盒的通用守则。快速循环模式是 StepOnePlusTM系统的推荐模式。 0164 说 明 书 CN 104131094 A 46 28/29 页 47 0165 2.5.5 qPCR反应结束后， 计算未稀释过的Ion AmpliSeq library的平均浓度通 过将 qPCR 的定量结果乘以 100 的稀释倍数。 0166 2.5.6 基于以上计算的文库浓度， 确认稀释倍数将文库稀释到 100pM。 0167 例如 ： 0168 未稀释的文库浓度时 300pM， 那 library 的稀释因子应该是 300pM/100pM 3。。

37、 0169 因此， 1 微升的文库混合 2 微升的 Low TE(1 比 3 稀释 ) 得到 100pM。 0170 2.5.7 稀释文库到 100pM 后， 接下来进行多个文库混合或模板制备。 0171 2.6 储存文库 0172 文库可以被保存在 48最多一个月， 也可以在 20条件下储存更长的时间。 0173 构建好的文库进行二代测序。 0174 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 说 明 书 CN 104131094 A 47 29/29 页 48 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 104131094 A 48 。