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1、(10)申请公布号 CN 104120120 A (43)申请公布日 2014.10.29 CN 104120120 A (21)申请号 201410301057.5 (22)申请日 2014.06.27 C12N 11/08(2006.01) C12P 13/04(2006.01) C12P 35/04(2006.01) (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18 号 (72)发明人 薛亚平 郑裕国 柳志强 侯鹏云 刘学 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 李世玉 (54) 发明名称 固定化重组青霉素 G 酰化。
2、酶及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种固定化青霉素 G 酰化酶及 制备 (S)-2- 芳基 - 氨基酸和头孢类抗生素的应 用， 本发明构建的固定化重组青霉素 G 酰化酶可 以在更短的时间内将 S 型底物转化为 S 型产物， 底物耐受性高， 对底物及其结构类似物都有同样 严格的 S 选择性 ； 通过添加钴离子及苯乙酸和甘 油作为酶活性中心的保护剂， 在避免固定化过程 中酶分子严重失活的情况下成功将本发明的重组 青霉素 G 酰化酶多点共价固定在环氧树脂载体表 面， 固定化方法简单易行， 原料便宜， 适合大规模 操作 ； 用固定化重组青霉素 G 酰化酶可以用于合 成头孢类抗生素及拆分制备 (S。
3、)-2- 芳基 - 氨基 酸， 在固定化酶活力没有出现明显下降前可以连 续使用 50 批次以上。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 14 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书14页 序列表4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104120120 A CN 104120120 A 1/2 页 2 1.一种固定化重组青霉素G酰化酶， 其特征在于所述固定化酶按如下方法制备 ： (1)将 含重组青霉素 G 酰化酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的发酵液离心， 取上清 液为酶源， 向酶源中添加终浓。
4、度 0.5-5.0mM 的氯化钴， 再加入 pH 7.0 的盐溶液， 混匀， 形 成待固定酶液 ； 所述重组青霉素 G 酰化酶的氨基酸序列为 SEQ ID NO.1 所示 ； 所述盐溶液 与酶源的体积比为 1 ： 1 ； 所述盐溶液为 3.0M 的磷酸缓冲液或 3.0M 硫酸铵水溶液 ； (2) 将待 固定酶液与载体混合， 25下搅拌 6-24h， 取出载体用蒸馏水冲洗后放入 pH 为 9.5-10.5 的 100mM 的磷酸缓冲液中， 再加入苯乙酸和甘油， 25下保温 1-4 天， 获得保温后的载体 ； 所述 待固定酶液的体积用量以载体质量计为510ml/g ； 所述苯乙酸加入的终浓度为10。
5、0mM， 所 述甘油加入的终浓度为 200g/L ； 所述载体为环氧树脂 ； (3) 将步骤 (2) 保温后的载体浸入 pH8.5， 1.0-3.0M 的甘氨酸水溶液中， 25保存 24h， 最后再用蒸馏水冲洗， 得到固定化重组 青霉素 G 酰化酶。 2. 如权利要求 1 所述固定化重组青霉素 G 酰化酶， 其特征在于所述载体为环氧树脂 C、 环氧树脂 Sepabeads EC-EP 或环氧树脂 LX-1000EP。 3. 如权利要求 1 所述固定化重组青霉素 G 酰化酶， 其特征在于所述酶源按如下步骤获 得 ： (1) 斜面培养 ： 将含重组青霉素 G 酰化酶编码基因的基因工程菌接种至含终浓。
6、度 50g/mL 卡那霉素的斜面培养基， 37培养 12h， 获得斜面菌体 ； 斜面培养基终浓度组成 为 ： 蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl10g/L， 琼脂 20g/L， pH 自然， 溶剂为水 ； (2) 种子培养 ： 挑取斜面菌种接入含终浓度 50g/mL 的卡那霉素的种子培养基， 装液 量为 25， 37、 150rpm 培养 10-12 小时， 获得种子液 ； 种子培养基终浓度组成为 ： 蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl10g/L， pH 自然， 溶剂为水 ； (3) 发酵培养 ： 按体积浓度 2的接种量， 将种子液接入装有 100mL 含终浓度。
7、 50g/mL 的卡那霉素的发酵培养基的500mL三角瓶中， 37、 150rpm培养28h， 将发酵液离心， 收集上 清液， 即获得酶源 ； 发酵培养基终浓度组成为 ： 可溶性淀粉10g/L、 蛋白胨12g/L、 酵母粉3g/ L、 NaCl10g/L， pH 自然， 溶剂为水。 4. 一种权利要求 1 所述固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备 (S)-2- 芳基 - 氨基酸中 的应用， 其特征在于所述的应用为 ： 以固定化重组青霉素 G 酰化酶为催化剂， 以 N- 苯乙 酰-(R,S)-2-芳基-氨基酸为底物， 于pH值为8.0-11.0的氨水溶液中， 在25-60、 180rpm 条件下反。
8、应完全后， 获得含 (S)-2- 芳基 - 氨基酸的混合液， 将混合液分离纯化， 获得所述 (S)-2- 芳基 - 氨基酸 ； 所述底物初始浓度为 0.05 0.3M， 所述催化剂的添加终浓度为 0.01 0.2g/ml。 5. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于所述底物为 N- 苯乙酰 -(R,S)- 苯甘氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)- 邻氯苯甘氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)- 间氯苯甘氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)- 对 氯苯甘氨酸或 N- 苯乙酰 -(R,S)- 对羟基苯甘氨酸。 6. 一种权利要求 1 所述固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备头孢氨苄中的应用， 其特征。
9、 在于所述的应用为 ： 以固定化重组青霉素G酰化酶为催化剂， 以7-氨基3-去乙酰氧基头孢 烷酸和苯甘氨酸甲酯盐酸盐为底物， 调节 pH 值为 6.0-8.0， 在 15-30、 180rpm 条件下反应 完全后， 获得含头孢氨苄的混合液， 将混合液分离纯化， 获得所述头孢氨苄 ； 所述底物 7- 氨 基 3- 去乙酰氧基头孢烷酸初始浓度为 0.01-0.3M， 所述底物苯甘氨酸甲酯盐酸盐初始浓度 权 利 要 求 书 CN 104120120 A 2 2/2 页 3 为 0.05-0.3M， 所述催化剂的添加终浓度为 0.01 0.2g/mL。 7. 一种权利要求 1 所述固定化重组青霉素 G。
10、 酰化酶在制备头孢羟氨苄中的应用， 其特 征在于所述的应用为 ： 以固定化重组青霉素G酰化酶为催化剂， 以7-氨基3-去乙酰氧基头 孢烷酸和对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐为底物， 调节 pH 值为 6.0-8.0， 在 15-30、 180rpm 条 件下反应完全后， 获得含头孢羟氨苄的混合液， 将混合液分离纯化， 获得所述头孢羟氨苄 ； 所述底物7-氨基3-去乙酰氧基头孢烷酸初始浓度为0.01-0.3M， 所述底物对羟基苯甘氨酸 甲酯盐酸盐初始浓度为 0.05-0.3M， 所述催化剂的添加终浓度为 0.01 0.2g/mL。 8. 一种权利要求 1 所述固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备头孢克洛中。
11、的应用， 其特 征在于所述的应用为 ： 以固定化重组青霉素 G 酰化酶为催化剂， 以 7- 氨基 -3- 氯 -3- 头孢 烯 -4- 酸和苯甘氨酸甲酯盐酸盐为底物， 调节 pH 值为 6.0-8.0， 在 15-30、 180rpm 条件下 反应完全后， 获得含头孢克洛的混合液， 将混合液分离纯化， 获得所述头孢克洛 ； 所述底物 7- 氨基 -3- 氯 -3- 头孢烯 -4- 酸初始浓度为 0.01-0.3M， 所述底物苯甘氨酸甲酯盐酸盐初 始浓度为 0.05-0.3M， 所述催化剂的添加终浓度为 0.01 0.2g/mL。 9. 一种权利要求 1 所述固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备头。
12、孢拉丁中的应用， 其特征 在于所述的应用为 ： 以固定化重组青霉素G酰化酶为催化剂， 以7-氨基3-去乙酰氧基头孢 烷酸和 2， 5- 二氢基苯甘氨酸甲酯盐酸盐为底物， 调节 pH 值为 6.0-8.0， 在 15-30、 180rpm 条件下反应完全后， 获得含头孢拉丁的混合液， 将混合液分离纯化， 获得所述头孢拉丁 ； 所 述底物 7- 氨基 3- 去乙酰氧基头孢烷酸初始浓度为 0.01-0.3M， 所述底物 2， 5- 二氢基苯甘 氨酸甲酯盐酸盐初始浓度为 0.05-0.3M， 所述催化剂的添加终浓度为 0.01 0.2g/mL。 权 利 要 求 书 CN 104120120 A 3 1。
13、/14 页 4 固定化重组青霉素 G 酰化酶及其应用 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一种固定化酶及应用， 特别涉及一种制备高操作稳定性的固定化重组 青霉素 G 酰化酶的方法， 以及利用固定化重组青霉素 G 酰化酶催化制备 (S)-2- 芳基 - 氨基 酸和头孢类抗生素的方法。 ( 二 ) 背景技术 0002 非天然的 (S)-2- 芳基 - 氨基酸是一类重要的医药中间体， (S)- 苯甘氨酸用于合 成催乳素类似物、 艾滋病蛋白酶抑制剂及紫杉酚。(S)- 邻氯苯甘氨酸， 其化学名为 2- 氨 基 -(2- 氯苯基 ) 乙酸， 分子式为 C8H8NO2Cl， 其最重要的一个用途就是合成。
14、新型抗血小板凝 聚药物氯苯格雷 (Clopidogrel)。氯吡格雷最早由法国的 Sanifi 公司于 1986 年开发出来， 临床上一般使用形态为其硫酸盐， 其商品名称为波利维 (Plavix)。 0003 (S)- 邻氯苯甘氨酸的制备方法包括 ： 1) 化学拆分法， 以樟脑磺酸为拆分剂， 拆分 外消旋的邻氯苯甘氨酸， 实际收率约为 31 (US 5204469A) ； 或者先用甲醇将邻氯苯甘 氨酸甲酯化生成外消旋的邻氯苯甘氨酸甲酯， 最后利用酒石酸作为拆分剂制备 (S)- 邻氯 苯甘氨酸 (US 5204469A,1991 ； US 6812363B,2004 ； WO 200600367。
15、1A,2004)。化学法制备 (S)- 邻氯苯甘氨酸存在许多缺点， 比如理论收率不高， 拆分过程需要高温操作且反应时间 漫长等， 最重要的是化学法生产的 (S)- 邻氯苯甘氨酸光学纯度较差 (e.e.98 )， 在合成 产物氯比格雷后需要进行多次重结晶才能得到药品的纯度要求， 重结晶的过程大大增加了 药物的生产成本。2) 生物酶法， 利用固定化青霉素酰化酶对底物 S 型单体的特异选择性在 水相介质中催化 N-(R,S)- 苯乙酰邻氯苯甘氨酸制备 (S)- 邻氯苯甘氨酸 (Fadnavis,et a l.Tetrahedron:Asymmetry,2008.19(20):2363-2366 ； 。
16、CN101864464A,2010)。酶法制备的 (S)- 邻氯苯甘氨酸光学纯度一般大于 99.9， 用固定化酶作为催化剂也可以避免传统化 学催化剂有限使用次数的缺点。 0004 头孢菌素类抗生素是一大类主要的半合成类 - 内酰胺类抗生素， 它们具有毒性 低、 抗菌谱广、 耐 - 内酰胺酶等一些优点。各种具有新抗菌活性和抗菌谱的半合成抗生素 可以用 7-ADCA、 6-APA 等母核与各种 D- 氨基酸类侧链在酸性条件下被催化合成。用固定化 青霉素酰化酶催化的酶法合成这些抗生素具有反应条件温和、 操作工艺简单、 不需要特殊 基团保护等优势。 已经被报道的酶法合成的半合成类抗生素产品有阿莫西林、。
17、 氨苄西林、 头 孢克洛、 头孢拉丁、 头孢氨苄、 头孢羟氨苄等。 0005 鉴于青霉素酰化酶的上述的对底物具有的立体选择性， 将具有立体选择性的青霉 素酰化酶制成固定化酶来催化合成 (S)- 邻氯苯甘氨酸具有重要工业化应用价值。传统的 酶的固定化方法包括吸附法、 包埋法、 交联法和共价结合法， 几种方法各有优缺点。在工业 化应用中， 为了降低固定化酶的成本， 要求制备的固定化酶具有良好的操作稳定性， 可以反 复多次使用， 因此选用共价结合法制备成结合牢固的固定化酶比其他方法而言具有很大优 势。环氧类树脂是一种表面含有环氧基的合成树脂， 该类载体表面的环氧基与酶分子表面 的氨基、 羧基等基团可。
18、以在很温和的条件下开环共价结合， 从而将酶分子固定在载体表面。 说 明 书 CN 104120120 A 4 2/14 页 5 环氧基与氨基的反应条件温和， 结合后酶分子一般不会被破坏， 经过适当处理后可以得到 稳定性良好的固定化酶。 一些合成树脂载体在较长的周期内具有很强的耐微生物和酸碱腐 蚀作用及较强的机械性能， 通过控制合成工艺容易合成具有粒度可调的微球状多孔材料， 非常符合作为工业化酶制剂的载体。 其中最具代表性的就是Eupergit C和Sepbeads EC-EP 两种合成大分子环氧树脂。Janssen 等 (Janeeen,et al.Biotechnology and Bioe。
19、ngineer ing,2002,78(4):425-432) 用 Eupergit C 作为载体固定青霉素 G 酰化酶， 每克载体最多可 以固定1300单位青霉素G酰化酶 ； 徐冠珠等(徐冠珠.微生物学报,2001.41(2):204-208) 将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶直接结合到该载体上， 制成了颗粒状固定化青霉素酰化 酶， 其表观活性可达 1400U/g。用来催化浓度为 8的青霉素钾盐， 在连续使用 20 批次后活 力可以保存初始活力的 80。我国的固定化技术研究起步较晚， 经过多年研究随意开发了 多种多样的载体和方法， 但仍然没有研究出和国外一流固定化载体可以媲美的载体， 真正 能。
20、投入工业应用的更是不多， 主要原因是固定化所使用的试剂和载体成本高， 固定化效率 低， 稳定性差， 另外出于商业保密， 很多工艺过程细节都没有公开， 因此研究高效的固定化 青霉素酰化酶具有重要意义。 ( 三 ) 发明内容 0006 本发明目的是提供一种将青霉素 G 酰化酶 (PGA) 固定在载体上的方法。本发明的 再一目的在于利用所制备的固定化重组青霉素 G 酰化酶作为催化剂， 用于制备 (S)-2- 芳 基 - 氨基酸和头孢类抗生素的方法。 0007 本发明采用的技术方案是 ： 0008 本发明涉及一种固定化重组青霉素 G 酰化酶， 所述固定化酶按如下方法制备 ： (1) 将含重组青霉素 G。
21、 酰化酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得发酵液， 离心， 取上 清液为酶源， 向酶源中添加终浓度为0.5-5.0mM的氯化钴， 再加入pH7.0的盐溶液(优选 3.0M的磷酸缓冲液或3.0M硫酸铵水溶液)， 混匀， 形成待固定酶液 ； 所述重组青霉素G酰化 酶的氨基酸序列为 SEQ ID NO.1 所示 ； 所述盐溶液与酶源的体积比为 1 ： 1 ； (2) 将待固定酶 液与载体混合， 25下搅拌 6-24h， 取出载体用蒸馏水冲洗后放入 pH 为 9.5-10.5 的 100mM 的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的体积以能够浸没载体为宜)中， 再加入苯乙酸和甘油， 25下 保温1-4天， 获得。
22、保温后的载体 ； 待固定酶液的体积用量以载体质量计为510mL/g(优选 5mL/g) ； 所述苯乙酸加入的终浓度为 100mM， 所述甘油加入的终浓度为 200g/L ； 所述载体为 环氧树脂 ； (3) 将步骤 (2) 保温后的载体浸入 pH8.5， 1.0-3.0M 的甘氨酸水溶液中， 25保 存 24h， 最后再用蒸馏水冲洗， 得到固定化重组青霉素 G 酰化酶。 0009 本发明所述载体表面含有的官能团为环氧基， 优选但不限于所述载体为环氧树脂 C(购自德国罗姆(Roehm)公司)、 环氧树脂Spebeads EC-EP(购自日本三菱化学 公司 ) 或环氧树脂 LX-1000EP( 购。
23、自西安蓝晓科技有限公司 )。 0010 本发明青霉素 G 酰化酶固定化的方法中所使用的磷酸盐和硫酸铵盐是为了利用 盐溶液对酶蛋白分子的 “盐析” 作用降低酶分子在溶液体系中溶解度， 促进其在载体表面的 吸附速率。一些公知且传统使用的沉淀剂包括季铵盐、 聚乙二醇等以及用来控制 pH 的磷酸 盐都可以使用， 其选择是根据作用的酶来选择的， 并且沉淀不能对酶的活性和稳定性产生 负面影响。硫酸铵价格便宜且对本发明所述青霉素 G 酰化酶 “盐析” 作用最好， 本发明优选 说 明 书 CN 104120120 A 5 3/14 页 6 使用硫酸铵。 0011 本发明青霉素 G 酰化酶固定化的方法中硫酸铵用。
24、量的选择根据作用的酶和特定 的固定化进程选择。低浓度的硫酸铵对作用对象的损害作用较小， 但是吸附固定化进程比 较漫长 ； 相对较高浓度的硫酸铵对作用对象有不同程度的失活作用， 但是可以大大减短固 定化进程。本发明优选待固定酶液中终浓度为 1.5M 的硫酸铵水溶液。 0012 本发明青霉素 G 酰化酶固定化的方法中， 向青霉素 G 酰化酶溶液中添加氯化钴 (CoCl2) 时， 是为了利用一些金属离子和酶分子结合后， 可以影响酶分子表面的电荷在某一 特定 pH 环境时的分布情况。青霉素 G 酰化酶在其等电点 (pH 6.7) 时其活性中心周围有 大量携带正电荷的氨基酸， 静电吸附作用导致位于这些区。
25、域的氨基酸可以优先和带微弱负 电势的载体发生共价反应， 从而导致酶的活性中心被破坏掉或者活性中心周围的氨基酸被 反应掉后导致底物无法接近活性中心， 最终影响固定化酶的活性。添加的钴离子 (Co2+) 在 和酶分子结合后可以避免或者减弱出现这种不利情况对最终固定化酶活的影响。 0013 本发明青霉素 G 酰化酶固定化的方法， 通过控制固定化过程保温阶段保护液的 pH 条件诱使酶分子表面的氨基和载体表面的环氧基发生超过单个共价键的链接作用， 使青霉 素 G 酰化酶自身通过氢键链接的 、 两个亚基都被多点共价固定在载体表面， 最终得到 的固定化酶具有优异的操作稳定性。 0014 本发明还提供一种所述。
26、固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备 (S)-2- 芳基 - 氨 基酸中的应用， 所述的应用为 ： 以固定化重组青霉素 G 酰化酶为催化剂， 以 N- 苯乙 酰 -(R,S)-2- 芳基 - 氨基酸为底物， 于 pH 值为 8.0-11.0( 优选 8.0) 的氨水溶液中， 在 25-60 ( 优选 30 )、 180rpm 条件下反应完全后， 获得含 (S)-2- 芳基 - 氨基酸的混合液， 将混合液分离纯化， 获得所述 (S)-2- 芳基 - 氨基酸 ； 所述底物初始浓度为 0.05-0.3M( 优 选 0.1M)， 所述催化剂的用量为 0.01 0.2g/mL( 优选催化剂用量为每毫升反应。
27、体系添加 0.02g 固定化酶 )。 0015 进一步， 优选所述底物为 N- 苯乙酰 -(R,S)- 苯甘氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)- 邻氯 苯甘氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)- 间氯苯甘氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)- 对氯苯甘氨酸或 N- 苯乙 酰 -(R,S)- 对羟基苯甘氨酸。 0016 本发明还提供一种所述固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备头孢氨苄中的应用， 所 述的应用为 ： 以固定化重组青霉素 G 酰化酶为催化剂， 以 7- 氨基 3- 去乙酰氧基头孢烷酸 (7-ADCA) 和苯甘氨酸甲酯盐酸盐 (PGME) 为底物， 于 pH 值为 6.0-8.0( 优选 6。
28、.0) 的缓冲溶 液中， 在 15-30 ( 优选 20 )、 180rpm 条件下反应完全后， 获得含头孢氨苄的混合液， 将 混合液分离纯化， 获得所述头孢氨苄 ； 所述底物 7- 氨基 3- 去乙酰氧基头孢烷酸 (7-ADCA) 初始浓度为 0.01-0.3M( 优选 0.03M)， 所述底物苯甘氨酸甲酯盐酸盐 (PGME) 初始浓度为 0.05-0.3M( 优选 0.06M) 所述催化剂的添加终浓度为 0.01 0.2g/mL( 优选 0.02g/mL)。 0017 本发明还提供一种所述固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备头孢羟氨苄中的应用， 所述的应用为 ： 以固定化重组青霉素 G 酰化。
29、酶为催化剂， 以 7- 氨基 3- 去乙酰氧基头孢烷 酸(7-ADCA)和对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐(HPGME)为底物， 于pH值为6.0-8.0(优选7.0) 的缓冲溶液， 在 15-30 ( 优选 20 )、 180rpm 条件下反应完全后， 获得含头孢羟氨苄的混 合液， 将混合液分离纯化， 获得所述头孢羟氨苄 ； 所述底物 7- 氨基 3- 去乙酰氧基头孢烷 酸 (7-ADCA) 初始浓度为 0.01-0.3M( 优选 0.03M)， 所述底物对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐 说 明 书 CN 104120120 A 6 4/14 页 7 (HPGME) 初始浓度为 0.05-0.3M( 优选 。
30、0.06M) 所述催化剂的添加终浓度为 0.01 0.2g/ mL( 优选 0.02g/mL)。 0018 本发明还提供一种所述固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备头孢克洛中的应用， 所 述的应用为 ： 以固定化重组青霉素 G 酰化酶为催化剂， 以 7- 氨基 -3- 氯 -3- 头孢烯 -4- 酸 (7-ACCA)和苯甘氨酸甲酯盐酸盐(PGME)为底物， 于pH值为6.0-8.0(优选8.0的氨水缓冲 液)的缓冲溶液中， 在15-30(优选20)、 180rpm条件下反应完全后， 获得含头孢克洛的 混合液， 将混合液分离纯化， 获得所述头孢克洛 ； 所述底物 7- 氨基 -3- 氯 -3- 头。
31、孢烯 -4- 酸 (7-ACCA) 初始浓度为 0.01-0.3M( 优选 0.03M)， 所述底物苯甘氨酸甲酯盐酸盐 (PGME) 初始 浓度为0.05-0.3M(优选0.06M)， 所述催化剂的添加终浓度为0.010.2g/mL(优选0.02g/ mL)。 0019 本发明还提供一种所述固定化重组青霉素 G 酰化酶在制备头孢拉丁中的应用， 所 述的应用为 ： 以固定化重组青霉素 G 酰化酶为催化剂， 以 7- 氨基 3- 去乙酰氧基头孢烷酸 (7-ADCA) 和 2， 5- 二氢基苯甘氨酸甲酯盐酸盐为底物， 于 pH 值为 6.0-8.0( 优选 8.0) 的 缓冲溶液， 在 15-30 。
32、( 优选 20 )、 180rpm 条件下反应完全后， 获得含头孢拉丁的混合 液， 将混合液分离纯化， 获得所述头孢拉丁 ； 所述底物 - 氨基 3- 去乙酰氧基头孢烷酸初始 浓度为 0.01-0.3M( 优选 0.03M)， 所述底物 2， 5- 二氢基苯甘氨酸甲酯盐酸盐初始浓度为 0.05-0.3M( 优选 0.06M) 所述催化剂的添加终浓度为 0.01 0.2g/mL( 优选 0.02g/mL)。 0020 本发明重组青霉素 G 酰化酶是由含有质粒 pPZW103-PGA 的枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)WB800表达到细胞外的酶。 宿主菌B.subtilis WB800特点是。
33、缺失了8种蛋白 酶的表达宿主， 当 PGA 在 B.subtilis WB800 表达时， 其对 PGA 的降解更少， 从而使 PGA 在发 酵液中逐步积累， 因此 PGA 的表达量大大提高。由所述编码基因构建的重组基因工程菌， 该 工程菌在培养时候不需要添加诱导剂即可以在胞外表达重组青霉素 G 酰化酶。 0021 本发明编码重组青霉素 G 酰化酶的基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO.2 所示。 0022 本发明所述编码基因在制备重组青霉素 G 酰化酶中的应用， 所述的应用为 ： 构建 含有所述重组青霉素 G 酰化酶的重组载体， 将所述重组载体转化至枯草芽孢杆菌 ( 优选枯 草芽孢杆菌 (。
34、B.subtilis)WB800) 中， 得到含有重组青霉素 G 酰化酶的菌体细胞， 该菌体细 胞在培养时候不需要添加诱导剂即可以在胞外表达重组青霉素 G 酰化酶。 0023 本发明中含重组青霉素 G 酰化酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得发 酵液按如下步骤获得 ： 0024 (1) 斜面培养 ： 将含重组青霉素 G 酰化酶编码基因的基因工程菌接种至含终浓度 为 50g/mL 卡那霉素的斜面培养基， 37培养 12h， 获得斜面菌体 ； 斜面培养基终浓度组成 为 ： 蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl10g/L， 琼脂 20g/L， pH 自然， 溶剂为水， 培养基灭菌后。
35、 补加终浓度为 50g/mL 卡那霉素后静置制成试管斜面培养基 ； 0025 (2) 种子培养 ： 挑取斜面菌种接入含终浓度 50g/mL 的卡那霉素的种子培养基， 装液量为 25， 37、 150rpm 培养 10-12 小时， 获得种子液 ； 种子培养基终浓度组成为 ： 蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl10g/L， pH 自然， 溶剂为水， 培养基灭菌后补加终浓度为 50g/mL 卡那霉素 ； 0026 (3) 发酵培养 ： 按体积浓度 2的接种量， 将种子液接入装有 100mL 含终浓度 50g/mL 的卡那霉素的发酵培养基的 500mL 三角瓶中， 37、 150rp。
36、m 培养 28h， 将发酵液离 说 明 书 CN 104120120 A 7 5/14 页 8 心， 收集上清液， 即获得酶源 ； 0027 或者将种子液直接接种 5L 发酵罐培养 ： 将种子液以体积浓度 2接种量接种到装 液 3L 发酵培养基的 5L 发酵罐中。发酵培养基终浓度组成为 ： 可溶性淀粉 10g/L、 蛋白胨 12g/L、 酵母粉 3g/L、 NaCl10g/L， pH 自然， 溶剂为水。在发酵罐操作过程中， 转速为 150rpm， 通气量为 0.5vvm， 温度保持 37， 加入泡敌 (0.03， v/v) 防止泡沫产生。在上述条件下培 养 26h 后将发酵液离心 (10000。
37、rpm， 10min) 收集上清液， 即为本发明所述的含重组青霉素 G 酰化酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的发酵液， -4保存备用。 0028 本发明所述 N- 苯乙酰 -(R,S)-2- 芳基 - 氨基酸按如下方法制备 ： 0029 (1) 分别称取 0.1mol(R,S)- 苯甘氨酸、 (R,S)- 邻氯苯甘氨酸、 (R,S)- 间氯苯甘 氨酸、 (R,S)- 对氯苯甘氨酸、 (R,S)- 对羟基苯甘氨酸放入 250mL 的三口烧瓶中， 分别加入 100mL4M NaOH 水溶液， 在冰浴条件下搅拌使其完全溶解， 待温度冷却至 0左右， 缓慢滴加 14.56mL(0.11mol)。
38、 苯乙酰氯， 滴毕， 室温下搅拌反应过夜 ； 0030 (2)对于(R,S)-对氯苯甘氨酸、 (R,S)-对羟基苯甘氨酸的反应液， 直接进行抽滤， 分别得到白色粉末状固体和灰色粉末状固体 ； 对于 (R,S)- 苯甘氨酸、 (R,S)- 邻氯苯甘氨 酸、 (R,S)- 间氯苯甘氨酸的反应液， 用二氯甲烷萃取， 收集水层置于冰浴中， 用 6M 的盐酸水 溶液调节 pH1 2， 搅拌下析出粉末状固体， 抽滤得到白色粉末状固体 ； 0031 (3) 将抽滤得到固体在 50干燥后得底物 N- 苯乙酰 -(R,S)- 苯甘氨酸、 N- 苯乙 酰 -(R,S)- 邻氯苯甘氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)。
39、- 间氯苯甘氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)- 对氯苯甘 氨酸、 N- 苯乙酰 -(R,S)- 对羟基苯甘氨酸。 0032 本发明中 N- 苯乙酰 -(R,S)-2- 芳基 - 氨基酸及其酶解产物采用高效液相色谱 仪 (Dionex UltiMate3000,USA) 进行检测。检测条件 ： 色谱柱为反相手性柱 Chirobiotic R(4.6mm250mm,5m,Sigma,USA)， 流动相为 0.5乙酸 - 乙腈 (20:80,V/V)， 流速为 1mL/ min， 检测波长为 220nm， 进样量 ： 3L ； 柱温 ： 30。 0033 底物及产物的光学纯度通过计算对映体过量值 。
40、(e.e.) 来评价， 公式 ： e.e. cS-cR/cS+cR100， 其中， cS和 cR为产物 S 型和 R 型异构体的浓度。 0034 本发明中头孢氨苄、 头孢羟氨苄、 头孢克洛、 头孢拉丁、 7-ADCA、 7-ACCA 的液相检测 方法 ： 色谱柱 ： Hypersil ODS2-C18柱(4.6mm250mm,5m,Elite,China) ； 流动相 ： 甲醇 ： 磷 酸盐缓冲液 (10mM pH7.0) 30:70(V/V) ； 检测条件 ： 流速 ： 0.7mL/min ； 波长 ： 214nm ； 进样 量 ： 10L ； 柱温 ： 40。 0035 与现有技术相比， 。
41、本发明的有益效果主要体现在 ： 0036 当前制备(S)-2-芳基-氨基酸及其结构类似物的主要生产方法仍然是化学法。 青 霉素 G 酰化酶利用其对含有苯环的酰基侧链的高度立体选择性可以制备得到高光学纯度 的 (S)-2- 芳基 - 氨基酸。酶法拆分具有催化效率高、 立体选择性强、 反应条件温和等特点， 且青霉素酰化酶来源广泛， 发酵成本低， 是制备高手性纯度 (S)-2- 芳基 - 氨基酸的理想催 化剂。本发明构建的固定化重组青霉素 G 酰化酶可以在更短的时间内将 S 型底物转化为 S 型产物， 底物耐受性高， 对底物及其结构类似物都有同样严格的 S 选择性。另外， 还可以用 于生产头孢氨苄、。
42、 头孢羟氨苄、 头孢克洛、 头孢拉丁等头孢类抗生素。 0037 本发明通过添加钴离子及苯乙酸和甘油作为酶活性中心的保护剂， 在避免固定化 过程中酶分子严重失活的情况下成功将本发明的重组青霉素 G 酰化酶多点共价固定在环 说 明 书 CN 104120120 A 8 6/14 页 9 氧树脂载体表面。固定化方法简单易行， 原料便宜， 适合大规模操作。大大提高了酶作为催 化剂的使用次数， 在固定化酶活力没有出现明显下降前可以连续使用 50 批次以上。 ( 四 ) 附图说明 0038 图 1 为重组菌 B.subtilis WB800/pPZW103-PGA 发酵离心上清液 SDS-PAGE 分析 。
43、结果， ( 泳道 1 ： 标准蛋白 ； 泳道 2 ： B.subtilis WB800 菌发酵液离心上清液 ； 泳道 3 ： 重组 B.subtilis WB800/pPZW103-PGA 菌发酵液离心上清液 ； -PGA 蛋白的 亚基 ； -PGA 蛋 白的 亚基 )。 0039 图 2 不同钴离子浓度对固定化结果的影响柱形图。 0040 图 3 为固定化重组青霉素 G 酰化酶在填充床中的操作稳定性曲线图。 ( 五 ) 具体实施方式 0041 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0042 实施例 1 基因工程菌 Bacillus subtilis。
44、 WB800/pPZW103-PGA 的构建 0043 1.1 重组青霉素 G 酰化酶编码基因 0044 合成来源于 B.megaterium CA4098 的青霉素 G 酰化酶 (PGA) (GenBank:AF161313.1) 的 基 因 序 列 ( 合 成 方 法 参 考 文 献 ： Nucleic.Acids. Res.2005,33,W521-W525)， 全长为 2046bp(SEQ ID NO.2 所示 )， 编码 802 个氨基酸， 其中编 码信号肽 26 个氨基酸残基、 编码 亚基 208 个氨基酸残基、 编码间隔肽 31 个氨基酸残基、 编码亚基537个氨基酸残基(SEQ。
45、 ID NO.1所示)。 合成的基因连入PES质粒(上海旭冠 生物科技发展有限公司提供)， 获得重组质粒PES-PGA， 转化至克隆宿主大肠杆菌JM109(北 京天根生化科技公司提供)中， 获得重组菌JM109/PES-PGA。 本实验目的是将PGA基因连接 到 pPZW103 质粒， 转化至枯草芽孢杆菌 WB800， 获得表达青霉素 G 酰化酶的重组菌 Bacillus subtilis WB800/pPZW103-PGA。具体操作过程如下 ： 0045 1.2 酶切 0046 培养携带质粒的重组菌， 用质粒提取试剂盒抽提对应的质粒 PES-PGA 和 pPZW103。 用限制性内切酶 Sm。
46、a I 和 BamH1 分别双酶切 PES-PGA 和 pPZWl03 质粒。酶切体系组成见表 1 ： 0047 表 1 酶切反应体系 0048 0049 37水浴反应 6h， 65水浴灭火 15min， 终止酶切反应。 说 明 书 CN 104120120 A 9 7/14 页 10 0050 1.3 基因的连接 0051 使用胶回收试剂盒 ( 购自爱思进生物技术有限公司 ) 分别回收质粒 PGA 目的基因 片段和质粒 pPZW103 的酶切产物， 获得胶回收产物。将质粒载体 pPZW103 酶切产物和目的 PGA 基因片段进行连接， 连接体系组成见表 2。 0052 表 2 连接反应体系 。
47、0053 0054 16连接 16h， 65水浴 15min 终止反应， -20贮存备用。 0055 1.4 宿主枯草芽孢杆菌感受态制备 0056 需准备的溶液 : 0057 MgCl2母液 ： 2.033g MgCl2与 100mL 去离子水配制成 100mM 的 MgCl2水溶液。 0058 HEPES(4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 ) 母液 ： 2.383g HEPES 与 100mL 去离子水配制成 100mM 的 HEPES 母液。 0059 SHMG 的配制 ： 蔗糖 85.575g、 100mM 的 MgCl2母液 5mL、 100mM 的 HEPES 母液 10mL、 甘油 100m。
48、L， 去离子水定容至 1000mL。 0060 (1) 从 -80取出枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)WB800， 接种到 LB 平板上， 37培养 20h， 获得菌体斜面。LB 平板终浓度组成为 ： 蛋白胨 10g/L ； 酵母提取物 5g/L ； 氯化钠 10g/ L ； 琼脂 20g/L ； pH 自然， 溶剂为水。 0061 (2)从菌体斜面挑取单菌落， 接种到50mL LB液体培养基， 37， 150rpm培养过夜， 获得种子液。LB 液体培养基终浓度组成为 ： 蛋白胨 10g/L ； 酵母提取物 5g/L ； 氯化钠 10g/ L ； 琼脂 20g/L ； pH 自然， 溶剂。
49、为水。 0062 (3) 取 4mL 种子液接种于 400mL LB 液体培养基， 37， 150rpm 培养约 2-3h， 直到 OD600值达到 1.0 左右， 获得发酵培养液。 0063 (4) 发酵培养液转入两个 0冰预冷 0.5h 的 400mL 的 Falcon 管中， 冰上放置 10min， 使培养物冷却至 0。 0064 (5)4， 5000rpm， 10min， 弃上清， 将管倒置 1min， 使残留液体流尽。 0065 (6) 每瓶用 400mL， 0冰浴中冰冻 0.5h 的 SHMG 洗三次， 5000rpm， 0离心 10min。 0066 (7) 倒掉上清后， 加入 0冰浴中冰冻 0.5h 的 SHMG 至 2mL， 获得菌悬液， 即为枯草 芽孢。