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1、(10)申请公布号 CN 104053766 A (43)申请公布日 2014.09.17 CN 104053766 A (21)申请号 201180075190.8 (22)申请日 2011.11.30 CNCM I-4431 2011.02.03 C12N 1/20(2006.01) C12P 7/24(2006.01) A23C 9/123(2006.01) A23C 9/127(2006.01) A61K 35/74(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12R 1/24(2006.01) (71)申请人 热尔韦达诺尼公司 地址 法国巴黎 (72)发明人 佩吉加罗。
2、 加埃勒凯雷 R布拉特 - 锡卡尔 (74)专利代理机构 隆天国际知识产权代理有限 公司 72003 代理人 王芝艳 吴小瑛 (54) 发明名称 产生罗伊氏菌素的短乳杆菌 (57) 摘要 本发明涉及产生罗伊氏菌素的短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) 的菌株。这些菌株可用 于， 特别是幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) 感染导致的病症的治疗或预防。 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.05.30 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/IB2011/055391 2011.11.30 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/07999。
3、2 EN 2013.06.06 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104053766 A CN 104053766 A 1/1 页 2 1. 积累罗伊氏菌素的短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) 菌株， 所述菌株选自 ： - 短乳杆菌菌株 CNCM I-4431 ； - 通过菌株 CNCM I-4431 的诱变或基因转化而衍生的短乳杆菌菌株。 2. 权利要求 1 的。
4、短乳杆菌菌株用于产生罗伊氏菌素的用途。 3. 含有权利要求 1 的短乳杆菌菌株的组合物。 4. 根据权利要求 3 的组合物， 其特征在于， 所述组合物每克干重含有至少 105cfu， 优选 至少 106cfu 的所述短乳杆菌菌株。 5. 根据权利要求 3 或 4 的组合物， 其特征在于， 所述组合物是营养组合物。 6. 根据权利要求 5 的组合物， 其特征在于， 所述组合物是乳制品。 7. 用作药物的权利要求 1 的短乳杆菌菌株或权利要求 3-6 任一项的组合物。 8. 根据权利要求 7 的用作药物的短乳杆菌菌株或组合物， 其特征在于， 所述药物用于 治疗或预防幽门螺杆菌感染。 权 利 要 求。
5、 书 CN 104053766 A 2 1/7 页 3 产生罗伊氏菌素的短乳杆菌 0001 本发明涉及产生罗伊氏菌素 (reuterin) 的短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) 的 菌株及其用途， 特别是用于治疗或预防幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) 感染及其导致 的病症。 0002 罗伊氏菌素 (3- 羟基丙醛， 3-HPA) 是一种抗菌化合物， 其最初被鉴定为在存在 甘油的厌氧条件下培养时， 由罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri) 的一些菌株产生 (TALARICO&DOBROGOSZ,Antimicrob Agents C。
6、hemother,33,674-9,1989)。甘油向罗伊斯菌 素的转化由钴胺素依赖性甘油脱水酶(Gld ； EC4.2.1.30)催化， 该酶包含三个亚基(分别为 C、 D 和 E， 或 、 和 )。在除了例如丘状乳杆菌 (Lactobacillus collinoides)、 短乳杆 菌和希氏乳杆菌 (Lactobacillus hilgardii) 之外的乳杆菌菌种中也报道存在甘油脱水酶 (GDA) 通路。对于所有菌种， 根据编码甘油脱水酶或二醇脱水酶的基因的存在， 该通路的存 在似乎随菌株而不同 (CADIEUX 等 ,Appl Environ Microbiol,74,4645-9,。
7、2008 ； SAUVAGEOT 等 ,FEMS Microbiology Letters,209,69-74,2002 ； CLAISSE 和 LONVAUD-FUNEL,Journal of Food Protection,64,833-837,2001)。在大多数通过 GDA 通路代谢甘油的细菌中， 罗伊氏菌素通常是代谢中间体， 其随后在细胞内还原成 1,3- 丙二醇 (1,3-PD)， 分泌到 胞外基质中。只有一些具有甘油或二醇脱水酶的菌株能够在培养基质中积累罗伊氏菌 素。这些积累罗伊氏菌素的菌株大多数属于罗伊氏乳杆菌。但是， 已经报道在其它乳 杆菌菌种中也有一些菌株能够胞外积累罗伊氏。
8、菌素， 且程度通常低于罗伊氏乳杆菌， 所 述乳杆菌菌种为 ： 棒状乳杆菌 (Lactobacillus coryniformis)(MARTIN 等 ,Int J Food Microbiol,104,267-77,2005)， 丘状乳杆菌 (Garai-Ibabe 等 ,International Journal of Food Microbiology121,253-261,2008 ； Sauvageot 等 ,International Journal of Food Microbiology,55,167-170,2000)和希氏乳杆菌(Pasteris和Strasser de Sa。
9、ad,J.Agric. Food Chem.,57(9),38533858,2009)。最近， 发现了短乳杆菌的一个菌株和戊糖乳杆菌 (Lactobacillus pentosus)的一个菌株能够胞外积累罗伊氏菌素(但其浓度比罗伊氏乳杆 菌低 10 倍 )(Bauer 等 ,International Journal of Food Microbiology,137,28-31,2010)。 0003 罗伊氏菌素对潜在有害的微生物具有广谱的抗微生物活性。 罗伊氏菌素能够抑制 酵母、 真菌、 原生动物和多种有害细菌的生长， 其所需浓度比抑制乳酸细菌生长所需浓度低 四到五倍。 由于罗伊氏菌素的这种。
10、选择性抗微生物活性使得它能够破坏多种病原性微生物 而同时对肠道菌群的有益乳酸细菌无害， 它已被提议用于治疗各种消化系统疾病。 0004 一些罗伊氏乳杆菌菌株已被视为候选益生菌， 原因尤其在于它们对抗病原体如沙 门氏菌 (Salmonella enterica)、 大肠杆菌 (Escherichia coli)、 难辨梭菌 (Clostridium diffi cile) 和幽门螺杆菌的保护作用 (CLEUSIX 等 ,BMC Microbiol,7,101,2007 ； SPINLER 等 ,Anaerobe,14,166-71,2008 ； FRANCAVILLA 等 ,Helicobact。
11、er,13,127-34,2008 ； PCT WO2004/031368)。这些作用至少部分地与罗伊氏菌素的产生有关。 0005 在胃肠道的病原微生物中， 幽门螺杆菌在过去数年已经成为关注日益增加的焦 点。它是一种革兰氏阴性螺旋形细菌， 定殖于世界人口的 50以上的人的胃黏液层中。虽 然感染幽门螺杆菌的大部分个体是无症状的， 但他们的胃上皮显示炎症迹象， 15至 20 说 明 书 CN 104053766 A 3 2/7 页 4 的幽门螺杆菌感染者会发展成疾病。幽门螺杆菌是消化性溃疡、 慢性活动性胃炎、 萎缩症、 组织转化、 发育异常、 胃癌和胃黏膜相关淋巴组织 (MALT) 淋巴瘤的主要致。
12、病因子 ( 综述参 见 (FOX&WANG,J Clin Invest,117,60-9,2007 ； POLK&PEEK,Nat Rev Cancer,10,403-14)。 0006 感染幽门螺杆菌的患者的标准治疗是两种抗生素加上PPI(质子泵抑制剂)治疗， 即所谓的三联疗法。 然而， 因为抗生素耐药性或依从性差， 三联疗法的幽门螺杆菌根除率在 下降。此外， 除了一些测试， 目前市场上还没有有效的疫苗。 0007 已经提议使用益生菌去替代或补充用于治疗或预防幽门螺杆菌的三联疗法。 正如 上文所指出的， 这些益生菌尤其包括罗伊氏乳杆菌， 原因特别是由于罗伊氏乳杆菌的抗微 生物性质。其它乳杆菌。
13、菌种中的一些菌株也被提议可能用于幽门螺杆菌感染的处理。例 如， SIMOVA 等 (J Appl Microbiol,106,692-701,2009) 公开了德氏乳杆菌 (Lactobacillus delbrueckii)菌株(BB18)， 其产生抑制性肽(细菌素)并强烈抑制幽门螺杆菌。 LINSALATA 等 (Helicobacter,9,165-72,2004) 研究了具有高精氨酸脱亚氨酶活性的一个短乳杆菌具 体菌株 (CD2) 对幽门螺杆菌在人胃黏膜中存活的影响。他们发现胃内幽门螺杆菌的量降 低， 并认为这可能是由于升高的精氨酸脱亚氨酶活性， 其夺去幽门螺杆菌的精氨酸， 并抑制 它。
14、们的生长和增殖。 0008 发明人现已分离出了短乳杆菌的菌株， 该菌株能够产生罗伊氏菌素并以足以对多 种幽门螺杆菌菌株产生抗微生物活性的量积累罗伊氏菌素。 0009 本发明所定义的 “能够积累罗伊氏菌素” 的菌株或 “积累罗伊氏菌素” 的菌株是指 能够产生罗伊氏菌素并将其分泌至胞外的菌株。 0010 因此， 本发明的一个目的是短乳杆菌的这个菌株， 其已根据布达佩斯条约于 2011 年 2 月 3 日保藏于 CNCM( 法国国家微生物保藏中心 ,25rue du Docteur Roux, 巴黎 )， 保藏 编号为 CNCM I-4431。 0011 除了具有产生并积累罗伊氏菌素的能力外， 该菌。
15、株还具有如下特点 ： 0012 - 形态学 ： 杆状细菌， 均色， 以小链分组 ； 0013 - 代谢 ： 异型发酵 ； 0014 - 以下列糖发酵 ( 在 Api50CH strip-API MRS 培养基上 37、 48h 获得的结果 ) ： L- 阿拉伯糖、 D- 核糖、 D- 木糖、 D- 葡萄糖、 D- 果糖、 D- 麦芽糖、 D- 蜜二糖、 葡萄糖酸钾、 5- 酮 基葡糖酸钾。 0015 本发明还包括通过 CNCM I-4431 菌株的诱变或基因转化而衍生的积累罗伊氏菌素 的短乳杆菌菌株， 条件是它们保留了母本菌株的抗微生物性质和产生罗伊氏菌素的能力。 它们可以是， 例如 CNCM。
16、 I-4431 菌株的一个或多个内源性基因已被突变的菌株， 从而改变它 的一些代谢性质 ( 例如该菌株的糖代谢能力、 对肠道转运的抗性、 耐酸性或后酸化 )。它们 还可以是利用一个或多个感兴趣的基因经过基因转化 CNCM I-4431 菌株而得到的菌株， 通 过转化使得以下成为可能 ： 例如， 赋予了所述菌株额外的生理特性， 或使其表达治疗或疫苗 目的的蛋白， 其通过所述菌株进行施用。 0016 这些菌株可通过乳杆菌的随机或定点诱变和基因转化的常规技术从 CNCM I4431 菌 株 获 得， 如 GURY 等 (Arch Microbiol.,182,337-45,2004) 或 VELEZ。
17、 等 (Appl Environ Microbiol.,73,35953604,2007) 的描述， 或由已知的 “基因组重排” 技术 (Patnaik 等， Nat Biotechnol,20,707-12,2002 ； Wang Y. 等， JBiotechnol.,129,510-15,2007) 获得。 说 明 书 CN 104053766 A 4 3/7 页 5 0017 本发明目的还在于获得积累罗伊氏菌素的短乳杆菌菌株的方法， 所述方法包括菌 株 CNCM I-4431 的诱变或基因转化步骤。 0018 本发明的短乳杆菌菌株可用于生产罗伊氏菌素。因此， 本发明的又一个目的是生 产罗。
18、伊氏菌素的方法， 所述方法包括以下步骤 ： 0019 - 在甘油存在下， 培养如上所定义的本发明的短乳杆菌菌株， 优选菌株 CNCM I-4431， 以及 0020 - 回收培养物所生产的罗伊氏菌素。 0021 本发明的目的还在于含有本发明的短乳杆菌菌株， 优选菌株 CNCM I-4431 的组合 物。 0022 在本发明的组合物中， 所述菌株可以采用全菌的形式， 优选活细菌的形式。 0023 本发明的组合物可以是适于施用， 特别是口服施用的任何形式。 这包括例如固体、 半固体、 液体和粉末形式。液体组合物由于易于施用而是通常优选， 例如作为饮料。 0024 所述组合物可以每克干重含有至少 1。
19、05cfu， 优选至少 106cfu 的本发明的短乳杆菌 菌株。 0025 所述组合物可以进一步含有其它细菌菌株， 特别是益生菌菌株， 例如乳杆菌 (Lactobacillus)、 双 歧 杆 菌 (Bifi dobacterium)、 链 球 菌 (Streptococcus) 或 乳 球 菌 (Lactococcus) 的菌株。 0026 典型地， 所述组合物以每克组合物干重可以含有 105至 1013菌落形成单位 (cfu)， 优选至少 106cfu， 更优选至少 107cfu， 还更优选至少 108cfu， 最优选至少 109cfu 的本发明的 短乳杆菌菌株。在液体组合物的情况下， 这。
20、通常相当于 104至 1012菌落形成单位 (cfu)， 优 选至少 105cfu， 更优选至少 106cfu， 还更优选至少 107cfu， 最优选至少 108cfu/ml。 0027 组合物可以是营养组合物， 包括食品、 食品补充品 (food supplement) 和功能食 品。 “食品补充品” 是指通常用在食物中的化合物制得的产品， 但其形式为片剂、 粉剂、 胶囊 剂、 药水 (potion) 或通常不与养料 (aliment) 相关的其它形式， 并且其对人的健康有益。 “功能食品” 是也对人的健康有益的养料。特别地， 食品补充品和功能食品可以具有生理作 用 - 针对疾病的， 例如针。
21、对慢性疾病的预防或治疗性作用。 0028 根据本发明的营养组合物还包括婴儿食品、 婴儿配方奶或婴儿后续配方奶 (infant follow-on formula)。 优选本发明的组合物是营养产品或药物产品， 营养补充品或 医疗食物。 0029 所述组合物可以是乳制品， 优选发酵乳制品。发酵产品可以以液体形式存在或以 通过干燥发酵液体获得的干粉的形式存在。 乳制品的例子包括凝结的(set)、 搅拌的或可饮 用的形式的发酵乳和 / 或发酵乳清， 奶酪和酸奶。 0030 发酵产品还可以是发酵植物， 例如发酵大豆、 谷物和 / 或水果， 形式为凝结的 (set)、 搅拌的或可饮用的形式。 0031 在。
22、优选的实施方案中， 发酵产品是新鲜产品。新鲜产品没有经历严格的热处理步 骤， 优势是细菌菌株以活的形式存在。 0032 本发明的目的还在于本发明的短乳杆菌菌株， 优选菌株 CNCM I-4431， 或本发明的 组合物， 用作药物。本发明的短乳杆菌菌株和组合物尤其可用于治疗或预防幽门螺杆菌感 染。 说 明 书 CN 104053766 A 5 4/7 页 6 0033 本发明的目的还在于本发明的短乳杆菌菌株， 优选菌株 CNCM I-4431， 或本发明的 组合物， 用作药物或在制备药物中的用途， 所述药物优选用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。 0034 本发明的目的还在于治疗或预防有此需要的受试者。
23、中的幽门螺杆菌感染的方 法， 所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的本发明的短乳杆菌菌株， 优选菌株 CNCM I-4431， 或本发明的组合物。 0035 本发明还包括用于生产药物， 优选治疗或预防幽门螺杆菌感染的药物的方法， 所 述方法包括将如上所定义的短乳杆菌菌株， 优选菌株 CNCM I-4431， 加入到至少一种药物学 可接受的稀释剂、 载体或赋形剂中。 0036 用于诊断幽门螺杆菌感染的方法是本领域已知的。通过举例的方式， 幽门螺杆菌 感染的诊断可通过血液抗体检测、 粪便抗原检测或碳尿素呼吸实验的检查进行。也可以通 过内窥镜下活检和随后的尿素酶检测、 组织学检查或微生物培养进行。。
24、 0037 特别的， 与幽门螺杆菌感染有关的症状或疾病有胃痛、 烧心、 反酸、 腹痛、 反胃， 呕 吐、 打嗝、 胀气、 恶心、 食管炎、 胃炎例如慢性活动性胃炎、 消化性溃疡、 萎缩症、 组织转化、 发 育异常、 胃癌和胃黏膜相关的淋巴组织 (MALT) 淋巴瘤。 0038 从以下进一步的描述可以更清楚的理解本发明， 所述表述包括示例 CNCM I-4431 菌株的抗微生物免疫调节和抗感染特性的实施例和附图。 0039 图 1 显示短乳杆菌菌株的 gldC 序列的 PCR 反应结果。位于 728bp 的较高的条带 表示采用 gldC 基因特异性引物的预期产物。位于 201bp 的较低的条带表。
25、示采用 16S rRNA 基因特异性引物的预期产物 ( 阳性 PCR 对照 ) ； Smart ： DNA SMART 梯 (Eurogentec) ； C+ ： 从 阳性 gldC 菌株罗伊氏乳杆菌 ATCC55730 的 DNA 对照获得的 PCR 结果 ； I-4431 ： 从短乳杆菌 菌株 CNCM I-4431 的 DNA 获得的 PCR 结果 ； L.brevis80 ： 从短乳杆菌 80 的 DNA 获得的 PCR 结果 ； C- ： 从 gldC 阴性菌株嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 的 DNA 对照获得的 PCR 结果 ； H2O ： 。
26、从无菌水获得的 PCR 结果。 0040 图 2 显示单独摄入幽门螺杆菌后秀丽隐杆线虫中幽门螺杆菌 ( 菌株 NTCTC11637) ( 黑色条 )、 MRS 中生长的幽门螺杆菌 + 短乳杆菌菌株 ( 暗灰色条 )、 含有甘油的 MRS 中生长 的幽门螺杆菌 + 短乳杆菌菌株 ( 白色条 ) 或幽门螺杆菌 + 含有甘油的 MRS 的定量结果。 0041 实施例 1 ： 短乳杆菌菌株 CNCM I-4431 对幽门螺杆菌生长的体外抑制 0042 材料与方法 0043 短乳杆菌菌株 ： 0044 - 短乳杆菌 CNCM I-4431 0045 - 短乳杆菌 80 ： 短乳杆菌的常规菌株 0046 。
27、幽门螺杆菌菌株 ： 0047 采用了三株幽门螺杆菌参考菌株和五株临床分离物。 0048 参考菌株 ： 0049 -26695 ： 描述于 TOMBS 等 (Nature388,539547,1997) ； 0050 -HPAG1 ： 描述于 OH 等 (Proc Natl Acad Sci U S A.,103,9999-10004,2006) ； 0051 -TN2GF4 ： 分离自日本的胃溃疡患者并适应于蒙古沙鼠(Mongolian gerbil)(菌株 描述于 WATANABE 等， Gastroenterol1998 ； vol115,pp642-648) 0052 临床分离物 ： 说。
28、 明 书 CN 104053766 A 6 5/7 页 7 0053 -CR113 和 CR114 ： 菌株分离自人胃癌前病变活检 ； 0054 -Axcan342 和 Axcan374 ： 菌 株 分 别 分 离 自 胃 炎 患 者 和 食 管 炎 患 者， 所 述 患 者 参 与 测 试 四 联 疗 法 根 除 幽 门 螺 杆 菌 的 临 床 研 究 (Malfertheiner 等， Lancet,377,905-913,2011)。 0055 -GC3C ： 菌株分离自胃癌患者。 0056 方法 ： 0057 短乳杆菌在 MRS 肉汤 (pH6.2) 中生长 17h。细菌悬液用 KOH。
29、 溶液中和至 pH6.8。 0058 幽门螺杆菌菌株在布氏肉汤中生长48h直到获得相当于麦克法兰(Mac Farland)4 标准的浑浊度。将细菌悬液铺到补充有 10 (v/v) 羊血、 富集有 1 (v/v)Polyvitex 补充 物 (Biomerieux) 且在同一介质中含有终浓度 100mM 甘油的 Mueller Hinton 琼脂平板的表 面， 以产生罗伊氏菌素。 0059 将无菌纸圆片加到平板表面。然后， 将 5L 中和的短乳杆菌悬液加到每个纸圆片 上。平板于 37在微需氧气氛 (Ruskin 微需氧气体分拣机， 产生 5 O2、 10 CO2和 85 N2) 中孵育 72h 。
30、至 96h。 0060 为了评估短乳杆菌悬液对幽门螺杆菌菌株生长的影响， 测量了纸圆片周围生长抑 制环的宽度。 0061 结果 0062 结果显示于下表 I。 0063 0064 这些结果显示， 短乳杆菌 80 仅对测试的两种幽门螺杆菌有抑制作用， 而短乳杆菌 I-4431抑制了测试的8株幽门螺杆菌中的8株的生长。 这些抑制作用似乎与罗伊氏菌素的 积累有关， 原因是它们仅在存在甘油的短乳杆菌培养物中观察到。 0065 实施例 2 ： GLDC 基因的 PCR 筛选 0066 材料与方法 0067 按照 CADIEUX 等 (2008， 如上所引用 ) 描述的方法， 检测了编码甘油脱水酶 说 明。
31、 书 CN 104053766 A 7 6/7 页 8 (GldC)负责罗伊氏菌素生产的酶大亚基的基因在短乳杆菌 CNCM I-4431 中的存在。 0068 简言之， 从每个测试的细菌菌株中分离总 DNA。 0069 采用罗伊氏菌素生产菌株罗伊氏乳杆菌 (L.reuterii)ATCC55730 作为阳性对照 (C+)。采用非罗伊氏菌素生产菌株 ( 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 作为阴 性对照 (C-)。 0070 采用以下简并引物扩增编码 Gld 大亚基的基因 (gldC) 的片段 ： 0071 GDCRev:GCRGCYTTSATATCTKSAAC。
32、CAT(SEQ ID NO:1) 和 0072 GDCFor:GCMTAYGCWGAAACCATTTCAGTTTA(SEQ ID NO:2)， 均描述于CADIEUX等。 扩增 的 gldC 片段的预期大小为 728bp。 0073 作为阳性 PCR 反应对照， 还通过以下真细菌引物扩增了所有样品的 16S rRNA 基因 的片段 ： 0074 16SFor:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG(SEQ ID NO:3) 和 0075 16SRev:GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC(SEQ ID NO:4)， 也均描述于 CADIEUX 等。 0076 扩增的 16S rRNA。
33、 片段的预期大小为 201bp。 0077 结果 0078 PCR 反应的结果显示于图 1。短乳杆菌菌株 CNCM I-4431、 短乳杆菌菌株 80 和产生 罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌 ATCC55730(C+) 产生了预期的 728-bp 的产物。因此， 短乳杆菌 菌株 CNCM I-4431 含有 gldC 基因， 使其能够产生罗伊氏菌素。 0079 实施例 3 ： 短乳杆菌 CNCM I-4431 对感染幽门螺杆菌的秀丽隐杆线虫模型的影响 0080 短乳杆菌和幽门螺杆菌的培养 0081 如实施例 1 所公开的在 MRS 肉汤中培养短乳杆菌菌株 CNCM I-4431。 0082 在含有 。
34、5 (v/v) 马血 (Oxoid) 的 BHI 培养基 (Oxoid) 中培养幽门螺杆菌菌株 NCTC11637(ATCC43504T)。 0083 通过离心从细胞分离上清并用 NaOH(1M) 中和。然后， 过滤上清 (0.22m) 并加入 到细胞沉淀中。 0084 在幽门螺杆菌培养物的情况下， 通过离心去除含有马血 (Oxoid) 的 BHI 培养基并 且用生理盐水溶液洗涤细胞。 0085 用于秀丽隐杆线虫感染分析的 NG 琼脂平板通过加入以下 100L 混合物来制备 ： 所述混合物含有 O.D. 2.22( 包括细胞和上清 ) 的每个 LAB 培养物和幽门螺杆菌菌株的 相应细胞 (O.。
35、D. 0.022)。在参考条件下， 线虫不给予 LAB， 幽门螺杆菌细胞悬浮于生理盐 水溶液中并加入到平板。 0086 秀丽隐杆线虫感染实验 0087 感染实验采用野生型秀丽隐杆线虫株 (N2) 进行。幽门螺杆菌的菌株 NCTC11637 用于线虫感染。实验以同步化年轻成虫 ( 三天的线虫 ) 开始， 将其转到不同的培养条件 ： 0088 -NG 培养基 + 大肠杆菌 E.coli OP50( 对照 ) 0089 -NG 培养基 + 大肠杆菌 E.coli OP50+100L LAB 培养基 ( 培养基对照 ) 0090 -NG 培养基 + 大肠杆菌 E.coli OP50+100L( 幽门螺。
36、杆菌 NCTC 11637T+LAB)。 0091 25孵育虫 8 天， 每两天将它们转到新的平板。对每个培养条件下线虫的存活进 行打分。 孵育期后， 每个条件取15条虫样品， 用含有0.1Triton X-100的M9缓冲液洗涤。 说 明 书 CN 104053766 A 8 7/7 页 9 采用 0.4g 碳化硅珠和漩涡振荡破碎虫。 0092 用商业化试剂盒 “高纯度 PCR 模板制备试剂盒” (Roche) 分离被感染虫的 DNA， 然 后通过无水乙醇和 5M 醋酸钾沉淀和洗涤。DNA 样品稀释用于通过 RT-PCR 定量幽门螺杆菌 在样品中的存在。 0093 RT-PCR 0094 本。
37、 研 究 中 使 用 的 引 物 是 针 对 vacA 基 因 的 (NAYAK & ROSE,J Appl Microbiol,103,1931-41,2007)。它们被命名为 HpylF(5 CAA TAG CAA TCA AGT GGC TTT G3 ,SEQ ID NO:5) 和 HpylR(5 GCG CGC TTC CAC ATT AGC3 ； SEQ ID NO:6)。之前通过电脑 BLAST 在线工具和对幽门螺杆菌的不同菌株、 不同的益生菌菌株和饲喂秀丽隐杆线虫的大 肠杆菌 OP50 进行体外 Q-PCR 对特异性进行了确认 ( 见优化以前的报告 )。采用 “ Green PC。
38、R Master Mix” (Applied Biosystem)和StepOne Real-Time thermocycler(Applied Biosystem)。下表 2 概括了幽门螺杆菌 Q-PCR 反应的优化条件。 0095 表 2 0096 0097 通过分光光度法 (A260) 对幽门螺杆菌 DNA 定量， 来制备 DNA 标准曲线。 0098 相应基因组的数量计算如下 ： 0099 - 基因组的数量 DNA(g)xNA/Mm 0100 - 幽门螺杆菌基因组大小 1.6Mpb 0101 -NA 6.023x1023 0102 - 基因组的数量 DNA(g)x6.023x1023/。
39、1.6x106x2x309 0103 采用四个十倍稀释的 DNA 进行标准曲线。 0104 利用在 MRS 中生长的或在 MRS+ 甘油中生长的菌株 I-4431 所获得的结果显示于图 2。这些结果显示， 菌株 CNCM I-4431 降低了秀丽隐杆线虫中幽门螺杆菌 NCTC 11637T的量。 菌株CNCM I-4431在MRS+甘油中培养时， 感染的降低更重要， 这表明该菌株的至少部分抗感 染作用是罗伊氏菌素产生的结果。 说 明 书 CN 104053766 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 104053766 A 10 2/2 页 11 序 列 表 CN 104053766 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104053766 A 12 。