修饰的肠激酶轻链.pdf

本发明涉及新的哺乳动物肠激酶类似物例如哺乳动物肠激酶轻链类似物和制备其的方法。本文还描述了用于切割具有肠激酶切割位点的蛋白质的方法。

权利要求书
1.  一种牛肠激酶轻链类似物，其包含在位置134和/或135上的至少一个替换，所述替换是疏水氨基酸被亲水带电荷氨基酸替换。

2.  根据权利要求1的牛肠激酶轻链类似物，其进一步包含在位置112上的替换。

3.  根据前述权利要求任一项的牛肠激酶轻链类似物，其中所述一个或多个亲水带电荷氨基酸是选自赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的一个或多个氨基酸。

4.  根据前述权利要求任一项的牛肠激酶轻链类似物，其中被突变的肠激酶轻链是SEQ ID NO:1。

5.  在肠激酶轻链类似物的复性过程中获得提高的溶解性的方法，包括将野生型牛肠激酶轻链的一个或多个疏水氨基酸突变为亲水氨基酸以及任选地将野生型牛肠激酶轻链的其它氨基酸进行突变的步骤，其中进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。

6.  根据权利要求5的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸选自I、V、L、M、W、F、A。

7.  根据权利要求5-6任一项的方法，其中所述亲水氨基酸选自由赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组。

8.  根据权利要求5-7任一项的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸位于选自位置11-14(氨基酸AWPW)、位置78-80(氨基酸I V I)和位置133-136(氨基酸A L I Y)的一个或多个位置。

9.  根据权利要求8的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸位于位置134和/或135。

10.  生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a) 在包含诱导物的生长培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码所述肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列；
b) 回收具有包含体形式的肠激酶轻链类似物的细胞
c) 溶解并再折叠所述肠激酶轻链类似物；以及
d) 纯化所述肠激酶轻链类似物。

11.  根据权利要求10的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述牛肠激酶轻链类似物是根据权利要求1-4任一项的类似物。

12.  在细菌或酵母宿主细胞中重组产生肽或蛋白质的方法，包括
a) 在酵母或细菌中表达包含要产生的肽或蛋白质的融合蛋白；
b) 用根据权利要求1-4任一项的牛肠激酶轻链类似物切割所述融合蛋白；以及
c) 分离产生的肽或蛋白质。

13.  根据权利要求12的重组产生肽或蛋白质的方法，其中步骤a)中表达的融合蛋白进一步包含Asp-Asp-Asp-Asp-Lys切割位点。

14.  根据权利要求12-13任一项的重组产生肽或蛋白质的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

15.  根据权利要求12-14任一项的重组产生肽或蛋白质的方法，其中所述要产生的肽或蛋白质是GLP-1肽。

说明书修饰的肠激酶轻链
技术领域
本发明涉及新的哺乳动物肠激酶类似物，制备这种物质的方法和所述哺乳动物肠激酶类似物用于切割具有肠激酶切割位点的蛋白质中的用途。
通过引用对序列表的合并
序列表，标题为“序列表”，为10 kb，创建于2012年12月17日，通过引用合并入本文。
背景
丝氨酸蛋白酶肠激酶(enterokinase)(简称肠激酶或EK)，也被称为肠肽酶(enteropeptidase)，是异二聚糖蛋白，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ((Asp)4-Lys, DDDDK)，其中它选择性地在赖氨酸之后切割。从牛十二指肠粘膜中分离的肠激酶展示150,000的分子量(MW)和35%的糖含量(carbohydrate content)。该酶由重链(MW~115,000)和二硫键连接的轻链(MW~35,000)组成(Liepnieks 等, J. Biol. Chem., 254(5): 1677-1683 (1979))。重链的功能是将酶固定在粘膜的膜上。轻链充当催化亚基。
在大肠杆菌(E.coli)中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了该目的需要有加工酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的加工酶。肠激酶是这样的酶，而且已经进行了许多努力以在大肠杆菌中确定重组方法以获得肠激酶或肠激酶类似物。但是，到目前为止结果仍然相当贫乏：可获得的商业产品价格昂贵且特异性活性较低，这是由于沉淀的EK的无效复性或可溶的EK的无效分泌造成的。
大肠杆菌中针对可溶性EK产品的方法导致可溶性和不溶性蛋白的混合物，需要2种纯化路线，昂贵的亲和柱，并且总之产量较低。为了获得均一的产品，EK必须被产生为包含体形式的不可溶物质。它们易于分离但是难以以令人满意的产量复性，这是由于蛋白可能聚集。
本发明的目的是获得具有改进性质的哺乳动物肠激酶类似物。
简述
本发明涉及在合适位点突变的哺乳动物肠激酶类似物。本发明的肠激酶类似物相对于亲本(野生型)哺乳动物肠激酶中氨基酸的一个或多个替换可以例如是疏水氨基酸被亲水的、带电荷的氨基酸替换。
在本发明的一个方面，获得的牛肠激酶轻链类似物包含在位置134和/或135上的至少一个由疏水氨基酸向亲水带电荷氨基酸的替换。在一个方面，根据本发明的牛肠激酶轻链类似物进一步包含在位置112上的替换。
本发明还涉及在肠激酶轻链类似物的复性过程中获得提高的溶解性的方法。在一个方面，该方法包括将野生型牛肠激酶轻链的一个或多个疏水氨基酸突变为亲水氨基酸的步骤，以及任选地将野生型牛肠激酶轻链的其它氨基酸进行突变的步骤，其中进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。
在一个方面，本发明提供用于获得哺乳动物肠激酶类似物的改进的生产方法。另外或者可选地，在第二个方面，本发明提供改进的生产方法，其导致产量提高。
在本发明的一个方面，生产牛肠激酶轻链类似物的方法包括以下步骤：
a) 在包含诱导物的生长培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列；
b) 回收具有包含体形式的肠激酶轻链的细胞
c) 溶解并再折叠肠激酶轻链类似物；以及
d) 纯化肠激酶轻链类似物。
在一个方面，本发明提供在细菌或酵母宿主细胞中重组生产肽或蛋白质的方法。在一个方面，所述方法包括：
a) 在酵母或细菌中表达包含要被生产的肽或蛋白质的融合蛋白；
b) 用根据方面1-9任一项的牛肠激酶轻链类似物切割所述融合蛋白；以及
c) 分离产生的肽或蛋白。
本发明还可以解决随着示例性的实施方案的公开将会显而易见的其它问题。
附图简述
图1：Trx-EKL (A)和Trx-EKLM (B)表达对诱导时间的依赖。M：标志物；BI：诱导前；I2, I3, I4和I6分别代表IPTG的诱导时间(小时)；15%凝胶；使用发酵确定成分培养基(Fermentation defined medium, FDM)。
图2：EK纯化的流程图
图3: 再折叠过程中的再折叠%产量(图3A)和1L再折叠缓冲液中纯化的EKL和EKLM的量(mg, 图3B)作为Trx-连接肽-EKL和Trx-连接肽-EKLM浓度的函数。▲/△: Trx-连接肽-EKL, 1mg/ml包含体(IB)；●/○: Trx-连接肽-EKLM, 6mg/ml IB；◆/◇: Trx-连接肽-EKLM, 4mg/ml IB。1.3g Trx-连接肽-EKLM或Trx-连接肽-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体被溶解至不同的浓度，即在含有20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中Trx-连接肽-EKL为1mg/ml，Trx-连接肽-EKLM为4mg/ml或6mg/ml。在含有20mM Tris, 1M脲, 1mM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3的再折叠缓冲液中稀释至所指出的浓度并在20℃温育24小时后，如实验部分所述用Q HP层析对EKLM/ EKL进行纯化。
图4：Trx-EKL的再折叠产量随着温育时间而增加。1.3g Trx-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中溶解至1.6mg/ml。在含有20mM Tris, 1M脲, 1mM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3的再折叠缓冲液中稀释100倍并在20℃分别温育24小时或48小时后，如实验部分所述检测酶活性。
图5：再折叠产量对脲浓度的依赖。1.3g Trx-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中溶解至1.6mg/ml。在含有20mM Tris, 1mM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3且分别含有0mM, 0.5mM, 1mM, 1.5mM或2mM脲的再折叠缓冲液中稀释100倍并在20℃温育24小时后，如实验部分所述检测酶活性。
图6：再折叠产量对氧化还原GSSG/GSH比例的依赖。1.3g Trx-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中溶解至1.6mg/ml。在含有20mM Tris, 1M 脲, pH 8.3和所指出的GSSG/GSH的再折叠缓冲液中稀释100倍并在20℃温育24小时后，如实验部分所述检测酶活性。
图7：通过Q HP层析纯化EKLM。(A): 层析谱。EKLM通过钠梯度洗脱，如P2中所示。含有EK酶活性的级分被标示出。(B)：还原条件下每一步的EKLM的SDS-PAGE。EKLM：通过疏水相互作用层析进一步纯化P2获得的高纯度EKLM (>90%)；M：标志物，BI：诱导前，Total：总裂解物；Sup：细胞裂解后的上清；IB：进行再折叠和纯化的包含体；App：再折叠和自活化之后应用于Q HP柱的样品；P1, P2和P3代表图7A中标出的每个峰的合并级分。(C)：酶活性。△:P1. 1ul样品加入到100ul反应缓冲液中；●: P2. P2稀释5倍后，1ul稀释的样品加入到100ul反应缓冲液中；○: P3. 1ul样品加入到100ul反应缓冲液中；■: 空白. 1ul缓冲液(20mM Tris, pH 8.0)加入到100ul反应缓冲液中。1.3g Trx-EKLM的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中溶解至4mg/ml。在含有20mM Tris, 1M 脲, 1mM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3的再折叠缓冲液中稀释80倍并在20℃温育24小时后，如实施例部分所述用Q HP层析对EKLM进行纯化。
图8：EKL和EKLM之间相似的特异性酶活性。25EU的纯化的EKL和EKLM被加样到SDS-PAGE上。
图9：EKLM在-80℃或4℃稳定至少3个月。如实施例部分所述纯化的EKLM被等分并储存于-80℃或4℃。3个月后，取自每种温度的5μg EKLM在还原和非还原条件下被加样到SDS-PAGE上，并与新鲜纯化的EKLM (新鲜)相比较。
图10：氨基酸序列trxEKLM (SEQ ID No: 9)和trx-连接肽-EKLM (SEQ ID No: 8)的比较。在trx-连接肽-EKLM中，trx和EKLM之间的间隔肽比trxEKLM长37个氨基酸。
图11：Trx-连接肽-EKLM的再折叠效率随加入到再折叠缓冲液中的PEG1000或环糊精而增加。包含体被溶解至7.3 mg/ml并在再折叠缓冲液中以1比20的比例稀释。再折叠缓冲液中PEG1000和环糊精的最终浓度分别为1%和1.5%。
描述
本发明涉及在合适位点突变的哺乳动物肠激酶类似物。本发明的肠激酶类似物相对于亲本(野生型)哺乳动物肠激酶中氨基酸的一个或多个替换可以例如是疏水氨基酸被亲水的、带电荷的氨基酸替换。在一个方面，本发明的哺乳动物肠激酶类似物相对于野生型牛肠激酶的氨基酸的一个或多个替换是由疏水氨基酸向亲水带电荷氨基酸的替换。在一个方面，进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型哺乳动物肠激酶轻链例如折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。
野生型牛肠激酶轻链通常在宽的pH范围(4.5-9.5)和温度范围(4–45℃)内在存在各种去垢剂和变性剂的条件下表现出良好的活性。因此，肠激酶轻链已在生物技术中作为一种有力的工具被用于融合蛋白的体外切割中。
但是，从动物例如猪和牛中提取的复杂生产方法和低生产产量限制了EK在生物技术中的应用。近来，已通过活性肠激酶轻链的分泌或通过无活性肠激酶轻链的包含体的胞内聚集、再折叠和活化在大肠杆菌中获得重组肠激酶轻链。而且已证明牛肠激酶轻链的Cys112替换为Ala增加酶活性，大概是由于其促进了再折叠。在全酶中Cys112连接轻链和重链，且其不是轻链的必要部分。
在本发明的一个方面，哺乳动物肠激酶类似物是哺乳动物肠激酶轻链类似物例如牛肠激酶轻链类似物。在本发明的一个方面，哺乳动物肠激酶类似物是牛肠激酶轻链类似物。在根据本发明的一个方面，牛轻链类似物包含在位置134和/或位置135上的一个或多个替换。在一个方面，牛肠激酶轻链类似物包含在位置112、134和/或135上的替换。在一个方面，牛肠激酶轻链类似物包含至少两个替换。在一个方面，牛肠激酶轻链类似物包含至少三个替换。在一个方面，牛肠激酶轻链类似物包含在位置112、134和135上的替换。在一个方面，牛肠激酶轻链类似物包含替换C112A、L134K和I135K。
本发明的新的牛肠激酶轻链类似物包括具有野生型牛肠激酶轻链的一级结构构象(即氨基酸序列)的那些。野生型牛肠激酶轻链具有基本如SEQ ID NO:1所示的序列。

根据一个方面，本发明的牛肠激酶轻链类似物具有肠激酶蛋白酶活性。这种蛋白酶的抗体也是可获得的。
本发明所述的牛肠激酶轻链类似物，保持肠激酶野生型蛋白酶活性以用作限制性蛋白酶特异性切割融合蛋白。
本文所使用的术语“牛肠激酶”指其结构和性质所熟知的牛肠激酶。哺乳动物肠激酶是含糖的异二聚体，具有650-800个氨基酸的重链和大约235个氨基酸的催化性轻链，且总的同源性为75-80% (Liepniecks 等, J. Biol. Chem. 254 , 1677 (1979), Matsushima 等, J.Biol. Chem. 269 (31), 19976 (1994), Kitamoto 等, Biochemistry 34, 4562 (1995) 分别是牛、猪和人肠激酶)。对催化性轻链的进一步研究在LaVallie 等, J. Biol. Chem. 268 (31), 23311-17 (1993)(牛EK)中和Matsushima 等, J. Biochem. 125, 947, (1999)(猪EK)中报道。
本文所用的术语“牛肠激酶轻链”指具有4个二硫桥的牛肠激酶的轻链。牛肠激酶轻链是例如上述的LaVallie et al中所描述的。
本文所使用与位于折叠的野生型肠激酶轻链表面上的氨基酸相关的术语“表面”指在例如Mod Base P 98072所述的3D结构中被鉴别为位于折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上的氨基酸。
根据本发明的“肠激酶轻链”在本文中被理解为牛肠激酶轻链或来自于另一个物种例如猪或人肠激酶轻链的肠激酶轻链。
本文所使用的术语“肠激酶轻链肽”指牛肠激酶轻链或其具有肠激酶活性的类似物或衍生物的肽。
如本文所使用的，肠激酶活性指在特定位点切割肽或蛋白质底物的能力；对于蛋白质底物，通常是在序列(Asp)4-Lys，或例如Light 等, Anal. Biochem. 106: 199(1980)中所述的类似序列之后(带负电荷的氨基酸后跟着带正电荷的氨基酸的簇)。典型地，通过用肠激酶或肠激酶类似物切割N-末端的原肽(含有(Asp)4-Lys)从而激活胰蛋白酶原，并随后用甲苯磺酰基-精氨酸-甲基酯(TAME)检测产生的活性胰蛋白酶的量来测定这种活性。或者，可以通过将酶与肽底物Gly (Asp)4-Lys-ss-萘胺酰温育，并测量ss-NA(ss-萘酰胺)部分的切割和释放所产生的荧光(在337 nm激发，在420 nm发射)的增加来测定肠激酶活性。参见例如Grant 等, Biochem. Biophys. Acta. 567:207(1979)。牛肠激酶对于某些胰蛋白酶底物如TAME和BAEE (苄基-精氨酸-乙烷基-酯)也有活性。
本文所使用的术语“野生型肠激酶轻链”意指进行根据本发明的任何替换之前的肠激酶轻链。
本文所使用的术语“肠激酶轻链类似物”或“牛肠激酶轻链类似物”指修饰的牛肠激酶轻链，其中肠激酶轻链的一个或多个氨基酸残基被其它的氨基酸残基替换和/或其中一个或多个氨基酸残基被从肠激酶轻链中删除和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加(added)和/或插入(inserted)到肠激酶轻链中。
在一个实施方案中，肠激酶轻链类似物与牛肠激酶轻链相比包含少于10个氨基酸的修饰(替换、缺失、添加(包括插入)及其任意组合)，可选地相对于牛肠激酶轻链包含少于9, 8, 7, 6, 5, 4, 3或2个修饰。在一个方面，肠激酶轻链类似物相对于牛肠激酶轻链包含5个氨基酸的修饰，在一个方面4个氨基酸的修饰，在一个方面3个氨基酸的修饰，在一个方面2个氨基酸的修饰以及在一个方面1个氨基酸的修饰。
肠激酶分子轻链中的修饰通过说明位置和替换天然氨基酸残基的氨基酸残基的单字母或三字母代码来表示。使用单字母代码表示氨基酸时，术语如134K和135K表示位置134和135上的氨基酸分别是K。使用三字母代码表示氨基酸时，相应的表达分别是134Lys和135Lys。因此，例如112Ala,134Lys,135Lys牛肠激酶轻链是其中位置112上的氨基酸被丙氨酸替换，位置134上的氨基酸被赖氨酸替换，且位置135上的氨基酸被赖氨酸替换牛肠激酶轻链的类似物。
本文中，术语“氨基酸残基”是其形式为从羧基基团除去羟基基团和/或其形式为从氨基基团除去氢原子的氨基酸。
牛肠激酶轻链类似物的实例是这样的：其中位置134上的Leu被Lys或另一个带电荷氨基酸替换，位置135上的Ile被Lys或另一个带电荷氨基酸替换。进一步，位置112上的Cys可以被许多氨基酸包括Ala和Ser替换。
根据本发明的牛肠激酶轻链类似物的其它实例包括但不限于：134Lys牛肠激酶轻链；135Lys牛肠激酶轻链；134Lys,135Lys牛肠激酶轻链；112Ala,134Lys,135Lys牛肠激酶轻链；112Ala,134Lys牛肠激酶轻链；112Ala,135Lys牛肠激酶轻链和包括其它带电荷氨基酸替换的任何这种组合。
在一个方面，获得的牛肠激酶轻链类似物相对于天然牛肠激酶轻链在复性过程中具有提高的溶解性。在一个方面，根据本发明的牛肠激酶轻链类似物有一个或多个表面定位的疏水氨基酸被突变为亲水的、带电荷的氨基酸，其中相对于天然牛肠激酶轻链在复性过程中获得了提高的溶解性。在一个方面，用于替换为亲水的带电荷氨基酸的表面定位的疏水性氨基酸是在将牛肠激酶轻链与其它丝氨酸蛋白酶比对并通过肠激酶的计算3D模型扫描溶剂可接触的表面之后被选择。
再折叠根据本发明的牛肠激酶轻链类似物的方法是所属领域的技术人员所知道的。例如，可以通过在脲中变性，然后在谷胱甘肽或另一种氧化-还原环境中氧化再折叠进行再折叠。
在一个方面，在再折叠过程中使用缓冲液(再折叠缓冲液)。在本发明的一个方面，再折叠缓冲液包含脲。在一个方面，再折叠缓冲液包含0M和2M之间的脲。在一个方面，再折叠缓冲液包含0.5M和2M之间的脲，0M和1.5M之间的脲或0.5M和1.5M之间的脲。在一个方面，再折叠缓冲液包含大约1M的脲。
包含体的初始浓度可能影响再折叠产量。在本发明的一个方面，包含体的浓度在1和4 mg/ml之间。
在本发明的一个方面，在再折叠过程中，即在再折叠条件下的稀释和温育过程中除去硫氧还蛋白(Trx)标签。已经发现无需加入活化酶就可以获得再折叠和活化。在本发明的一个方面，连接trx标签和本发明的牛肠激酶轻链类似物的连接肽通过自切割除去。发明人由此令人惊讶地发现连接trx标签和本发明的牛肠激酶轻链类似物的连接肽促进了再折叠。
在一个方面，相对于野生型EK复性过程中获得的聚集，根据本发明的牛肠激酶轻链类似物的复性过程中的聚集较少。在一个方面，根据本发明的牛肠激酶类似物具有替换L134K和I135K，其中牛肠激酶轻链类似物相对于野生型EK在复性过程中溶解性更好。在一个方面，根据本发明的牛肠激酶轻链类似物进一步具有替换C112A。发明人相信通过突变位置112的单个半胱氨酸，可以促进EK轻链中4个二硫桥的形成，所述位置112的单个半胱氨酸在野生型EK异二聚体中参与轻链和重链的二硫键连接。
在一个方面，本发明的牛肠激酶轻链类似物与野生型牛肠激酶相比具有完全的肠激酶活性。在一个方面，本发明的牛肠激酶轻链类似物具有与野生型牛肠激酶基本上等同的功能活性或生物学活性。例如，牛肠激酶轻链类似物具有与具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽基本上等同的功能活性或生物学活性(即是功能上等同的)(例如具有基本上等同的肠肽酶活性)。
编码本发明的肠激酶轻链类似物的核酸形式也在本发明的范围内。根据本发明的核酸包括基因组DNA (gDNA)、互补DNA (cDNA)、通过化学合成制备的合成DNA以及具有缺失或替换的DNA、等位基因变体以及在严谨条件下与之杂交的序列，只要它们编码本发明的肠激酶轻链类似物。
在一个实施方案中，提供了核酸，其中所述核酸包含多核苷酸序列，且其中所述核酸编码哺乳动物肠激酶轻链类似物例如根据本发明的牛肠激酶轻链类似物。在一个实施方案中，核酸可操作地与可诱导的启动子相连。在一个实施方案中，提供了重组载体，所述重组载体包含与可诱导的启动子可操作连接的核酸。在一个实施方案中，可诱导的启动子选自AraB, T7, trp, lac, tac。
本发明的进一步的实施方案提供宿主细胞，所述宿主细胞包含重组载体，所述重组载体包含编码哺乳动物肠激酶轻链类似物例如根据本发明的牛肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列。
本发明的进一步的方面提供宿主细胞，所述宿主细胞包含重组载体，所述重组载体包含编码哺乳动物肠激酶轻链类似物例如根据本发明的牛肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、S.saccaromyces和米曲霉(A.oryzae)。
多肽例如肠激酶轻链的产生是所属领域熟知的。牛肠激酶轻链类似物可以例如通过经典的肽合成，例如使用t-Boc或Fmoc化学或其它完善的技术进行的固相肽合成来产生，参见，例如Greene and Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999。牛肠激酶轻链类似物还可以通过这样的方法产生，该方法包括培养包含编码所述类似物的DNA序列并且能在允许表达牛肠激酶轻链类似物的条件下在合适的营养培养基中表达牛肠激酶轻链类似物的宿主细胞。在牛肠激酶轻链和牛肠激酶轻链类似物的生产中可以使用几种重组方法。可以用于在微生物例如大肠杆菌和酿酒酵母中生产肠激酶的方法的实例在例如WO 94/16083中公开。
典型地，牛肠激酶轻链类似物通过在合适的宿主细胞中通过例如WO 94/16083中公开的熟知的技术表达编码所讨论的牛肠激酶轻链类似物或其前体的DNA序列而产生。
本发明的牛肠激酶轻链类似物可以从细胞培养基或从细胞中回收。本发明的牛肠激酶轻链类似物可以通过所属领域知道的多种程序纯化，包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、聚焦层析和尺寸排阻)、电泳程序(例如制备性等电聚焦(IEF))、差别溶解度(例如硫酸铵沉淀)、或提取(参见例如Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)。
在一个方面，本发明的牛肠激酶轻链类似物通过阴离子交换层析纯化。在另一个方面，阴离子交换层析之后进行疏水相互作用层析。在一个方面，本发明的牛肠激酶轻链类似物通过Q HP阴离子交换层析纯化。在另一个方面，Q HP阴离子交换层析之后进行Phenyl FF疏水相互作用层析。
在本发明的一个方面，提供了改进的生产哺乳动物肠激酶轻链类似物例如牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a) 在包含诱导物的生长培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列；
b) 回收具有包含体形式的肠激酶轻链类似物的细胞
c) 溶解并再折叠肠激酶轻链类似物；以及
d) 纯化肠激酶轻链类似物。
本发明提供了以非常有效率的和经济的方式在大肠杆菌中生产哺乳动物肠激酶轻链类似物例如牛肠激酶轻链类似物的新的重组方法。
根据本发明的牛肠激酶轻链类似物的表达可以例如集中于大肠杆菌的包含体中或酵母的分泌物质中。在一个实施方案中，肠激酶的表达集中于大肠杆菌的包含体中。
可用作宿主细胞用于非糖基化的、均质的肠激酶活性的生产的大肠杆菌的各种菌株也是所属领域熟知的。这些菌株的非排除性的列表包括大肠杆菌B BL21 DE3, 大肠杆菌K12 W3110, MC1061, DH1, K803, HB101, JM101和其它类似K12的菌株。可选地，可以使用其它细菌物种，包括枯草芽孢杆菌，假单胞菌的各种菌株，其它杆菌等等。
所属领域的技术人员所知道的酵母细胞的许多菌株也可以利用作为宿主细胞表达本发明的肠激酶活性。酵母细胞特别可用做成熟肠激酶的前/原融合蛋白的宿主。当使用合适的酵母载体表达时，融合蛋白借助于信号肽被分泌。
当本发明的牛肠激酶轻链类似物在细菌细胞中表达时，它通常可以作为包含体在细胞内表达，或者如果包括分泌信号的话，它可以以活性形式从细菌细胞分泌。如果必要或者期望的话，当观察到生物活性减少时，可以通过传统方法获得肠激酶活性，例如在脲或盐酸胍中溶解蛋白，然后通过稀释降低这些试剂的浓度并用氧化试剂例如二硫苏糖醇或ss-巯基乙醇处理以促进再折叠。
在一个实施方案中，根据本发明的牛肠激酶轻链类似物是酶促活性蛋白酶，其在多种融合蛋白产品中在亲和标签和成熟蛋白之间的(Asp)4-Lys (DDDDK) 序列之后特异性切割。在一个实施方案中，根据本发明的牛肠激酶轻链类似物具有保留的酶活性。
在本发明的一个方面，获得了再大肠杆菌细胞中制备牛肠激酶轻链类似物的方法，其中用携带牛肠激酶轻链类似物基因和可诱导启动子的质粒转化大肠杆菌细胞，通过进行分批阶段和补料分批阶段的发酵，并从培养物中分离和纯化所表达的蛋白。
在本发明的一个方面，获得了根据本发明的牛肠激酶轻链类似物的再折叠方法，其中肠激酶轻链类似物在重组大肠杆菌中以包含体的形式表达。在一个实施方案中，进行变性然后在氧化还原系统中再折叠。
本发明的肠激酶轻链类似物可用在切割具有肠激酶切割位点的蛋白质方法中，特别是这种切割序列被构建到其序列中的融合蛋白。所需要的量可由所属领域的技术人员通过经验容易地确定。
本文所使用的术语“融合蛋白”指由两种或更多种蛋白质或肽通过基因工程方法制造的蛋白。如本文所使用的，融合蛋白可以指其中特意引入Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (D4K)序列以进行特异性切割的蛋白质。通常，融合蛋白的切割产生两个多肽。根据本发明的融合蛋白可以是重组融合蛋白。在特定的实施方案中，可以例如，除目标野生型蛋白的氨基酸序列之外，在一个末端，例如N-末端添加源自于载体的残基肽产生融合蛋白。用这种方法，例如可以构建在载体中连接目标蛋白的上游处具有Asp-Asp-Asp-Lys (D4K)切割位点的重组融合蛋白。
本文的术语“可操作连接”意指一种结构，其中控制序列相对于多核苷酸序列的编码序列位于合适的位置，以使得控制序列指导多肽的编码序列的表达。
术语“蛋白酶”是指包括单独或与其它多肽组合破坏蛋白质的氨基酸之间的肽键的任何多肽。
术语“蛋白水解活性”指底物被酶切割的活性。在特定的实施方案中，该术语指肠激酶的酶切割。在示例性的实施方案中，该术语指本发明的牛肠激酶轻链类似物对Asp-Asp-Asp-Asp-Lys切割位点的特异活性。“非特异性蛋白水解活性”指不针对特定切割位点的切割活性。“特异性蛋白水解活性”指针对特定切割位点的切割活性。
实际上，如本文所描述的，根据本发明的牛肠激酶轻链类似物与来自于牛的两链形式相比，在融合蛋白的切割上更为优秀。
作为本发明的另一个方面，本发明的肠激酶轻链类似物作为另一种蛋白的融合蛋白配偶体之一被掺入。这样，向反应容器中加入最低量的外源肠激酶活性后，该融合蛋白导致释放另外的肠激酶活性，其能依次催化更多的融合蛋白的蛋白水解切割。以这种方式，可以以自催化的方式由融合蛋白产生大量的肠激酶活性。
本发明的另一个特定方面教导了使用本文所述的本发明任何牛肠激酶轻链类似物切割含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys切割位点的蛋白的方法，所述方法包括使所述蛋白与本发明的任何牛肠激酶轻链类似物接触，且其中所述蛋白与牛肠激酶轻链类似物的接触导致特异性切割。
在一个实施方案中，蛋白是融合蛋白。在另一个实施方案中，融合蛋白是重组融合蛋白。在进一步的实施方案中，蛋白是细菌产生的。在更特定的实施方案中，蛋白是合成蛋白。
在进一步的方面，本发明教导了使用本文所述的根据本发明的任何牛肠激酶轻链类似物制备重组蛋白的方法，所述方法包括提供含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys切割位点的重组融合蛋白，并使所述融合蛋白与本发明的任何牛肠激酶轻链类似物接触，其中所述重组融合蛋白与牛肠激酶轻链类似物的接触导致Asp-Asp-Asp-Asp-Lys特异性切割和重组蛋白的制备。
下面是根据本发明的方面的非限制性列表：
1. 一种牛肠激酶轻链类似物，其包含在位置134和/或135上的至少一个替换，所述替换是疏水氨基酸被亲水带电荷氨基酸替换。
2. 根据方面1的牛肠激酶轻链类似物，其中在位置134和135二者上都具有疏水氨基酸被亲水带电荷氨基酸替换。
3. 根据方面1或2的牛肠激酶轻链类似物，其进一步包含在位置112上的替换。
4. 根据方面3的牛肠激酶轻链类似物，其中位置112上的氨基酸选自丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
5. 根据方面3的牛肠激酶轻链类似物，其中位置112上的氨基酸是丙氨酸。
6. 根据前述方面任一项的牛肠激酶轻链类似物，其中亲水带电荷氨基酸是选自赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的一个或多个氨基酸。
7. 根据前述方面任一项的牛肠激酶轻链类似物，其中所述一个或多个亲水带电荷氨基酸是赖氨酸。
8. 根据前述方面任一项的牛肠激酶轻链类似物，包含替换C112A、L134K和I135K。
9. 根据前述方面任一项的牛肠激酶轻链类似物，其中被突变的肠激酶轻链是SEQ ID NO:1。
10. 在肠激酶轻链类似物的复性过程中获得提高的溶解性的方法，包括将野生型牛肠激酶轻链的一个或多个疏水氨基酸突变为亲水氨基酸以及任选地将野生型牛肠激酶轻链的其它氨基酸进行突变的步骤，其中进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。
11. 根据方面10的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸选自I, V, L, M, W, F, A。
12. 根据方面10的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸选自由亮氨酸和异亮氨酸组成的组。
13. 根据方面10-12任一项的方法，其中所述一个或多个亲水氨基酸选自由赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组。
14. 根据方面13的方法，其中所述一个或多个亲水氨基酸是赖氨酸。
15. 根据方面10-14任一项的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸位于选自位置11-14(氨基酸AWPW)、位置78-80(氨基酸I V I)和位置133-136(氨基酸A L I Y)的一个或多个位置。
16. 根据方面15的方法，其中被突变的一个或多个疏水氨基酸位于位置134和/或135。
17. 生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a) 在包含诱导物的生长培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码所述肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列；
b) 回收具有包含体形式的肠激酶轻链类似物的细胞
c) 溶解并再折叠所述肠激酶轻链类似物；以及
d) 纯化所述肠激酶轻链类似物。
18. 根据方面17的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中在所述再折叠过程中使用再折叠缓冲液。
19. 根据方面17或18的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述再折叠缓冲液包含脲。
20. 根据方面17-19任一项的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述再折叠缓冲液包含大约1M脲。
21. 根据方面19-20任一项的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述再折叠缓冲液进一步包含低分子量聚乙二醇(low-PEG)。
22. 根据方面19-21任一项的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述再折叠缓冲液进一步包含PEG1000例如1% PEG1000。
23. 根据方面19-22任一项的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述再折叠缓冲液进一步包含羟丙基-β-环糊精例如1.5%羟丙基-β-环糊精。
24. 根据方面17-23任一项的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中包含体的浓度在1和4 mg/ml之间。
25. 根据方面17-24任一项的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
26. 根据方面17-25任一项的生产牛肠激酶轻链类似物的方法，其中所述牛肠激酶轻链类似物是根据方面1-9任一项的类似物。
27. 在细菌或酵母宿主细胞中重组产生肽或蛋白质的方法，包括
a) 在酵母或细菌中表达包含要产生的肽或蛋白质的融合蛋白；
b) 用根据方面1-9任一项的牛肠激酶轻链类似物切割所述融合蛋白；以及
c) 分离产生的肽或蛋白质。
28. 根据方面27的重组产生肽或蛋白质的方法，其中步骤a)中表达的融合蛋白进一步包含Asp-Asp-Asp-Asp-Lys切割位点。
29. 根据方面28的重组产生肽或蛋白质的方法，其中步骤b)导致Asp-Asp-Asp-Asp-Lys特异性切割。
30. 根据方面27-29任一项的重组产生肽或蛋白质的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
31. 根据方面27-30任一项的重组产生肽或蛋白质的方法，其中所述要产生的肽或蛋白质是GLP-1肽。
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实施例
本文中已开发了制备牛肠激酶轻链类似物的生产方法。牛肠激酶轻链类似物与硫氧还蛋白标签融合，在大肠杆菌中作为包含体被表达。再折叠和自活化之后，通过Q HP阴离子层析纯化活性肠激酶轻链类似物。而且，发现牛肠激酶轻链(EKLM)的三重替换(C112A, L134K和I135K)（其提高了表面亲水性质），使再折叠产量增加4倍，而不丧失活性。4g/L培养物中纯化的肠激酶轻链类似物的产量是800mg/L，特异性活性测定为5000 ± 10 EU/mg。因此，我们的肠激酶轻链类似物生产方法提供了用于加工治疗性融合蛋白和其它融合蛋白的有价值的工具。
缩写:
EK: 肠激酶
EKL：具有C112A突变的牛肠激酶轻链
EKLM (本文中可选地命名为EKM或EKLM(C112A, L134K, I135K))：在位置112突变为Ala、位置134突变为Lys以及位置135突变为Lys的牛肠激酶轻链。
TrxEKLM：通过12AA的连接肽与N-末端的硫氧还蛋白标签融合的EKLM
Trx-连接肽-EKLM：通过较长的49AA的连接肽与N-末端的硫氧还蛋白标签融合的EKLM
Trx-连接肽-EKL：通过较长的49AA的连接肽与N-末端的硫氧还蛋白标签融合的EKL
IPTG：异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷
DTT：二硫苏糖醇
GSSG：氧化谷胱甘肽
GSH：谷胱甘肽
FDM：发酵确定成分培养基
Trx：硫氧还蛋白
LC-MS：液相色谱-质谱
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
BL21：大肠杆菌菌株大肠杆菌B BL21 DE3
PCR反应：聚合酶链式反应
Low-PEG：低分子量聚乙二醇例如具有至多达1000的分子量的聚乙二醇
PEG1000：聚乙二醇1000，分子量大约1000的聚乙二醇。
实施例1. Trx-连接肽-EKL和Trx-连接肽-EKLM的质粒构建
编码牛肠激酶催化亚基的DNA序列用下述引物扩增：

这两个引物分别含有 Kpn I和EcoR I限制性酶切位点。目标片段从Kpn I和EcoR I位点被引入到pET32a (Novagen)中。使用来自Stratagene的Pfu DNA聚合酶进行常规PCR反应。通过测序确认质粒pET32a-EKL的序列。使用来自Stratagene的QuikChange? XL定点突变试剂盒(QuikChange? XL Site-Directed Mutagenesis Kit)使用下述引物引入三个替换位点，即C112A, L134K, I135K：

Trx-连接肽-EKLM的氨基酸序列：

加下划线：Trx；标准体：连接肽；粗斜体：EKLM
Trx-EKLM的氨基酸序列：

加下划线：Trx；标准体：连接肽；粗斜体：EKLM。
实施例2. Trx-连接肽-EKL和Trx-连接肽-EKLM的发酵和表达
来自甘油储液的细胞被接种到EC1平板上，在37oC生长过夜，并用0.9%氯化钠(NaCl)洗涤以悬浮细胞。培养物在包含发酵确定组分培养基(FDM)的发酵罐中在37oC生长16 小时，并在OD600为150时用1.0mM IPTG诱导，然后在离心收获之前在37oC生长6小时。
在补料-分批发酵中Trx-连接肽-EKL和Trx-连接肽-EKLM在大肠杆菌中均表达。如图1所示，在IPTG诱导前经SDS-PAGE判断没有明显的泄露表达(leaky expression)。在SDS-PAGE上出现略大于43kD的IPTG诱导条带，由LC-MS确认该条带代表目标蛋白。而且，目标蛋白的表达水平依赖于诱导时间。使用发酵确定组分培养基(FDM)对Trx-连接肽-EKL和Trx-连接肽-EKLM进行4小时或6小时的诱导，分别产生可接受的表达，并获得~4g/L的目标蛋白。
实施例3. 再折叠、自催化活化和纯化
发酵得到的细胞被重悬于含有20mM Tris, pH 8.0的裂解缓冲液(1:10, w/w)中，用弗氏压碎器使之裂解。在4℃以20,000g使包含体沉淀1小时，然后用裂解缓冲液洗涤一次。将包含体在含有20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中溶解至3.2mg/ml，并在4℃温育3小时。在20,000g离心30min后，将溶解的EK (即Trx-连接肽-EKL和/或Trx-连接肽-EKLM)在含有20mM Tris, 1M脲, 1mM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3的再折叠缓冲液中稀释80倍，并在20℃温育24小时。
在再折叠程序的稀释和温育过程中，发生自催化切割，并完全释放没有硫氧还蛋白(Trx)标签的活性酶。最后，通过Q HP阴离子交换层析纯化酶。
方法方案显示在图2中。包含体溶解于含有5-8M脲和10-20mM DTT的缓冲液中。应当注意包含体浓度影响再折叠产量。发现4mg/ml Trx-连接肽-EKLM的再折叠产量比6mg/ml Trx-连接肽-EKLM的高2倍(图3A)。
通过稀释使再折叠发生。由固定体积获得的纯化酶的量也依赖于再折叠缓冲液中Trx连接肽EK的浓度，且当Trx-连接肽-EKLM浓度为120μg/ml时达到最大。
伴随着再折叠过程发生自催化活化。通过漏出的活性EK从Trx-连接肽-EK释放活性EK，所述漏出的活性EK在紧邻成熟EK之前的DDDDK识别位点将Trx标签特异性地切割掉。再折叠和自催化活化过程似乎在48小时为最佳(图4)。考虑到脲对EK的抑制，发现如果再折叠缓冲液中有超过2M的脲，再折叠产量大幅减少。我们的结果表明再折叠缓冲液中1M脲为最佳(图5)。
再折叠产量依赖于氧化还原系统。发现比例为1:3的GSSG/GSH为最佳，且优于胱氨酸/半胱氨酸(图6)。
再折叠和自活化之后的活性EK被纯化，并通过一步阴离子交换层析纯化浓缩(QHP柱，图7A)。发现Trx标签存在P1中，P2中主要是EKLM和Trx标签的杂质，且P3含有痕量的EKLM，其通过图7C所示的活性检测证实。应当注意通过使用疏水相互作用层析(HIC)进一步纯化P2获得高纯度的EKLM (>90%) (图7B)。而且，还测定了每种级分的酶活性(图7C)，并合并。对于Trx-连接肽-EKL，再折叠过程中当Trx-连接肽-EKL超过40μg/ml时再折叠产量相当低(在40μg/ml为4.4%)，这使得该方法在实践上比较困难。换句话说，需要巨大的储存罐生产大量的EK (~1,000g)。
低再折叠产量可能是因为蛋白质疏水相互作用引起的蛋白质聚集。在基于其3D结构对EKL进行表面疏水性作图之后，发现133ALIY是表面上最疏水的区域之一。因此，构建了具有3个替换(C112A, L134K和I135K)的EKLM并进行研究。使用完全相同的方法，EKLM大大提高了再折叠产量，特别是当再折叠缓冲液中EKLM浓度超过40μg/ml时，而这是EKL大规模生产的瓶颈(图3A)。如图3A所示，在再折叠缓冲液中Trx-连接肽-EKLM浓度为40μg/ml时，Trx-连接肽-EKLM的再折叠产量(17%)比Trx-连接肽-EKL (4.4%)高4倍。而且，从1L再折叠罐中可以纯化出~16mg活性EKLM，其中EKLM的浓度是120μg/ml。
比较了EKL和EKLM的特异性酶活性，如图8所示。EKLM的三重替换对于酶活性没有明显的影响，其由下述事实证明：如果加载相同活性，EKL和EKLM在SDS-PAGE上具有类似的条带。而且，如果在含有20mM Tris, 200mM NaCl的缓冲液中储存在-80℃或4℃的话，EKLM非常稳定。直至3个月，没有观察到明显的降解和活性的减少(图9)。
实施例4. 酶测定
直接使用荧光底物，GDDDDK-β-萘胺酰测量酶活性。在含有100ul反应缓冲液的Fluorescent 96孔板的每个孔中加入1ul样品开始反应。混合10秒后，用Fluostar OPTIMA测量荧光(在340nM激发并在420nM发射)。用任意单位(EU)定义酶活性，其衍生自斜率*60/30,000，其中斜率代表线性范围。
实施例5. 连接肽区域
产生了两个与trx连接的EKLM氨基酸序列（其连接肽区域不同），trxEKLM和trx-连接肽-EKLM(参见图10)。在trx-连接肽-EKLM中，trx和EKLM之间的间隔序列比trxEKLM长37个氨基酸。
TrxEKLM
细胞破坏和IB溶解
7.41g TrxEKLM细胞沉淀重悬于100ml裂解缓冲液(20mM Tris, pH 8.0)中，使用匀浆器在30,000psi的压力下破坏细胞。弃去上清后，称重IB为3.53g。分离的IB重悬于70ml溶解缓冲液(20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT (新鲜加入))中并在4℃温育4小时。溶解的样品通过离心使之澄清。
TrxEKLM的再折叠
16ml IB溶液被稀释到500ml再折叠缓冲液(20mM Tris, 1mM GSSG, 3mM GSH, 1M脲, pH 8.0)中并在20℃搅拌54小时。再折叠过程中的蛋白浓度为60μg/ml。
TrxEKLM的纯化
柱:                   Q HP柱
样品缓冲液:   20mM Tris, 1mM GSSG, 3mM GSH, 0.62mM DTT, 1M脲, pH 8.0
缓冲液:           缓冲液A: 20mM Tris, pH 8.0
缓冲液B:       20mM Tris, 0.5M NaCl, pH 8.0
程序:             10 CV 100% A
                       以10ml/min应用
                       5 CV 100% A
                       7 CV 0% B-70%B
                       1 CV 70% B-100%B
                       1.5CV 100%B
柱体积:          28 ml
速度:             10ml/min。
具有最高酶活性的洗脱级分被合并，得到的合并体积为30ml，总酶活为14,100EU。蛋白量为2.82mg。
Trx-连接肽-EKLM
细胞破坏和IB溶解
66.9g Trx-连接肽EKLM细胞沉淀重悬于1000ml裂解缓冲液(20mM Tris, pH 8.0)中，并使用匀浆器在30,000psi的压力下破坏细胞。弃去上清后，称重IB为22g并用1000ml 20mM Tris, pH 8.0洗涤一次。洗涤后，将IB溶液分装在6个瓶子中进行离心。弃去上清后，向一个瓶子中加入41ml溶解缓冲液(20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT (新鲜加入))中并在4℃温育3小时。溶解的IB样品通过离心使之澄清，最终体积为43ml。
Trx-连接肽-EKLM的再折叠
9ml IB溶液被稀释到500ml再折叠缓冲液(20mM Tris, 1M脲, 1mM GSSG, 3mM GSH, pH 8.0)中并在20℃搅拌18小时。再折叠过程中的蛋白质浓度为60μg/ml。
Trx-连接肽-EKLM的纯化
柱:                   Q HP柱
样品缓冲液:   20mM Tris, 1M脲, 1mM GSSG, 3mM GSH, 0.296mM DTT, pH 8.0
缓冲液:          缓冲液 A1: 20mM Tris, 1M脲, pH 8.0
缓冲液           A2: 20mM Tris, pH 8.0
缓冲液           B: 20mM Tris, 0.5M NaCl, pH 8.0
程序:              10 CV 100% A1
                        以10ml/min应用
                        5 CV 100% A1
                        5 CV 100% A2
                        7 CV 0% B-70%B(100% A2-30%A2)
                        1 CV 70% B-100%B(30% A2-0%A2)
                        1.5CV 100%B
柱体积:           28 ml
速度:               10ml/min。
通过活性测试，洗脱级分18-23的酶活性比其它级分高。具有最高酶活性的洗脱级分被合并，得到的合并体积为30ml，且总酶活为24,900EU。蛋白量为4.98mg。
结果:
当使用TrxEKLM时，当再折叠过程中的蛋白浓度为60 μg/ml时由0.5L再折叠溶液产生2.82mg EKLM蛋白，但在相同的条件下由Trx-连接肽-EKLM的版本产生了4.98mg的EK蛋白。因此，具有较长连接肽的融合蛋白比具有较短连接肽的融合蛋白的再折叠效率高76%。
实施例6：再折叠缓冲液的组分优化
几种不同的添加物，包括去垢剂、环糊精、氨基酸、PEG (聚乙二醇)和糖分别组合到目前的再折叠缓冲液(20mM Tris, 1M脲, 1mM GSSG, 3mM GSH, pH 8.3)中以测试它们提高Trx-连接肽-EKLM的再折叠效率的能力。如实施例3所述并作微小改变进行再折叠过程。简短地说，包含体在含有20mM Tris, 8M脲, pH8.0, 20mM DTT的缓冲液中溶解至7.3mg/ml，然后将溶解的Trx-连接肽-EKLM加入到含有特定添加物的优化再折叠缓冲液中稀释20倍。将混合物在4℃温育20小时，通过实施例4中所述的蛋白酶活性测定对正确折叠的Trx-连接肽-EKLM的量进行定量。
Low-PEG (例如PEG1000, 1%)和羟丙基-β-环糊精(1.5%)两者均表现出强的增加Trx-连接肽-EKLM的再折叠效率的能力，与仅含有脲的再折叠缓冲液相比分别增加57.9%和106.2%(如图11所示)。这两种添加物对于EKLM的成熟和后面的纯化过程没有明显的影响。
虽然本发明的特定特征在本文中已进行了举例说明和描述，所属领域的普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变、和等同方式。因此，应当理解所附的权利要求意在覆盖落入本发明真正精神内的所有这种修改和改变。
                         序列表
 
<110>  Novo Nordisk A/S
 
<120>  修饰的肠激酶轻链
 
<130>  8378.204-WO
 
<150>  PCT/CN2011/002169
<151>  2011-12-23
 
<160>  9    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  235
<212>  PRT
<213>  牛肠激酶轻链
 
<400>  1
 
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1               5                   10                  15     
 
 
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
            20                  25                  30         
 
 
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
        35                  40                  45             
 
 
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
    50                  55                  60                 
 
 
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
                85                  90                  95      
 
 
His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys
            100                 105                 110        
 
 
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
        115                 120                 125             
 
 
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
    130                 135                 140                
 
 
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145                 150                 155                 160
 
 
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
                165                 170                 175    
 
 
Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
            180                 185                 190        
 
 
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
        195                 200                 205            
 
 
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
    210                 215                 220                
 
 
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225                 230                 235
 
 
<210>  2
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工
 
<220>
<223>  引物
 
<400>  2
ggcggtaccg acgacgacga caagattgtc ggaggaagtg ac                          42
 
 
<210>  3
<211>  44
<212>  DNA
<213>  人工
 
<220>
<223>  引物
 
<400>  3
ggcgaattcc taatgtagaa aactttgtat ccactctgtg aacc                        44
 
 
<210>  4
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工
 
<220>
<223>  引物
 
<400>  4
acacagatta tatacagcct attgcgttac cagaagaaaa tcaag                       45
 
 
<210>  5
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工
 
<220>
<223>  引物
 
<400>  5
cttgattttc ttctggtaac gcaataggct gtatataatc tgtgt                       45
 
 
<210>  6
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工
 
<220>
<223>  引物
 
<400>  6
ctattgctgg ctggggggca aagaaatatc aaggttctac tgcagacg                    48
 
 
<210>  7
<211>  47
<212>  DNA
<213>  人工
 
<220>
<223>  引物
 
<400>  7
cgtctgcagt agaaccttga tatttctttc cccccagcca gcaatag                     47
 
 
<210>  8
<211>  393
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  trx-连接肽-EKLM
 
<400>  8
 
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1               5                   10                  15     
 
 
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
            20                  25                  30         
 
 
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
        35                  40                  45             
 
 
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
    50                  55                  60                 
 
 
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
                85                  90                  95     
 
 
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
            100                 105                 110        
 
 
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
        115                 120                 125            
 
 
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
    130                 135                 140                
 
 
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val
145                 150                 155                 160
 
 
Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val Ala Leu
                165                 170                 175    
 
 
Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser Arg Asp
            180                 185                 190        
 
 
Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met Glu Pro
        195                 200                 205            
 
 
Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn Leu Thr
    210                 215                 220                
 
 
Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile Asn Pro
225                 230                 235                 240
 
 
His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His Leu
                245                 250                 255    
 
 
Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Ala Leu Pro
            260                 265                 270        
 
 
Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala Gly
        275                 280                 285            
 
 
Trp Gly Ala Lys Lys Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu Gln Glu
    290                 295                 300                
 
 
Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln Met Pro
305                 310                 315                 320
 
 
Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu Ala Gly
                325                 330                 335    
 
 
Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Gln
            340                 345                 350        
 
 
Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Tyr Gln
        355                 360                 365            
 
 
Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro Arg Phe
    370                 375                 380                
 
 
Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
385                 390            
 
 
<210>  9
<211>  356
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  Trx-EKLM
 
<400>  9
 
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1               5                   10                  15     
 
 
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
            20                  25                  30         
 
 
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
        35                  40                  45             
 
 
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
    50                  55                  60                 
 
 
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
                85                  90                  95     
 
 
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
            100                 105                 110        
 
 
Ser Gly Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser
        115                 120                 125            
 
 
Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln
    130                 135                 140                
 
 
Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala
145                 150                 155                 160
 
 
Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala
                165                 170                 175    
 
 
Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu
            180                 185                 190        
 
 
Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg
        195                 200                 205            
 
 
Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His Leu Glu Met Lys Val Asn
    210                 215                 220                
 
 
Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Ala Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val
225                 230                 235                 240
 
 
Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala Gly Trp Gly Ala Lys Lys
                245                 250                 255    
 
 
Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu
            260                 265                 270        
 
 
Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr
        275                 280                 285            
 
 
Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys
    290                 295                 300                
 
 
Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp
305                 310                 315                 320
 
 
Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn
                325                 330                 335    
 
 
Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln
            340                 345                 350        
 
 
Ser Phe Leu His
        355