一种半枝莲制剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及中药提取分离及制剂的制备，更具体的说是临床一种具有抗肿瘤、抗病毒、提高机体免疫力的半枝莲提取物及其制备方法，及以该提取物为主要成分制成的各种中药制剂。属于医药技术领域。
背景技术
半枝莲分布资源极其丰富，在我国用于临床已有几百年历史，但以往由于缺乏对其药效物质基础及机理的研究，影响了它的开发与利用。半枝莲主要含黄酮、多糖、甾醇、有机酸、生物碱等类成分。半枝莲中的总黄酮尤其是野黄芩苷含量的高低与其疗效有相关性。因此，有效的开发和利用半枝莲中黄酮类化学成分具有重要的意义。
基于上述目的，我们从临床有效方药中拆方筛选出有效抗肿瘤、抗病毒、提高机体免疫力药物半枝莲，对其有效化学成份、药理药效及作用机理等方面进行了广泛的研究，在此基础上研制了单味半枝莲总黄酮制剂。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是要提供一种对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用，而对正常组织无伤害、同时具有抗病毒、提高机体免疫力作用，且质量比较容易控制，总黄酮含量高的半枝莲提取物制剂，以提高临床疗效。
本发明的另一个目的在于，提供了制备以半枝莲提取物有效部位为主要活性成分的各种中药制剂的制备工艺。
为解决上述问题，本发明研究制定了如下技术方案：
一种半枝莲抗癌、抗病毒、提高机体免疫力制剂，是以半枝莲总黄酮提取物或提取液为主要成分；所说的半枝莲总黄酮提取物中总黄酮含量大于75％；所说的半枝莲总黄酮提取液中总黄酮含量大于5％。
上述半枝莲总黄酮提取物或提取液中富含野黄芩苷、芦丁等黄酮类成分(见附图3～5)。所述半枝莲总黄酮提取物中，野黄芩苷含量为25％～40％以上。所述半枝莲总黄酮提取液中，野黄芩苷含量为1.5％～3％以上。
本发明半枝莲制剂的制备方法和步骤如下：
(1)总黄酮提取液制备：将半枝莲全草粗粉碎，用0.1％～0.3％(W/W)精氨酸水溶液(pH6.0～8.5)；常温浸泡、搅拌提取，得pH值为7～9的半枝莲总黄酮提取液，其总黄酮含量大于5％；
(2)总黄酮提取物制备：将步骤(1)得到的提取液用20％(W/W)醋酸调pH2～3或用10％(W/W)盐酸调pH3～4放置，分离、洗涤沉淀即为半枝莲总黄酮提取物，其总黄酮含量在75％以上；
(3)将步骤(2)的半枝莲总黄酮提取物和半枝莲纳米粉按质量比分别为15％～55％和45％～85％混合制成口服固体制剂；
或者是：将步骤(1)得到的半枝莲水提液，微米滤膜滤过去除杂质制成液体制剂；口服液体制剂中半枝莲总黄酮含量为5％～35％；
或者是：将步骤(2)的半枝莲总黄酮提取物加精氨酸水溶液溶解，微米滤膜过滤，制成口服液体制剂，口服液体制剂中半枝莲总黄酮含量为5％～35％。
本发明中所说的口服固体制剂包括颗粒剂、片剂、微丸。半枝莲纳米粉是半枝莲全草经超微粉碎后粒径在50nm～150nm范围，植物细胞100％破壁。
本发明中所说的口服液体制剂包括口服液、合剂，口服液体制剂中半枝莲总黄酮含量为5％～35％。
本发明所制备的半枝莲总黄酮提取物含量测定方法包括以下方法中的一种或两种：
A、总黄酮
取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.28mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液；精密吸取对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，分别加0.3％精氨酸溶液至25ml，以0.3％精氨酸溶液为空白，照分光光度法(中国药典2005年版一部附录VI A)，在327nm的波长处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线；精密吸取半枝莲总黄酮提取液，以0.3％精氨酸溶液为空白，照分光光度法(中国药典2005年版一部附录VI A)，在327nm的波长处测定吸收度，计算，即得；本半枝莲总黄酮提取物含总黄酮以野黄芩苷(C21H18O12)计，不得少于75％。
B、野黄芩苷
照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，体积比为35∶61∶2的甲醇∶水∶醋酸为流动相，检测波长为327nm；理论板数按野黄芩苷峰计算，不低于1500；精密称取野黄芩苷对照品，加流动相制成每1ml中含野黄芩苷0.88mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液；取本半枝莲总黄酮提取物作为供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；本半枝莲总黄酮提取物含野黄芩苷不得少于25％。见附图4～5。
本发明所述的口服制剂，用于临床的剂量为每日服用按生药材计30～60g。
本发明的优点在于：
(1)半枝莲总黄酮中药制剂为单味中药的有效成分组成，是一种以抑制血管再生为作用靶点的抗肿瘤药物，并有抗病毒、提高机体免疫力的作用。经动物实验观察表明，产品吸收利用度好，无不良反应，疗效好，经济安全。
(2)本发明选用材料科学，制备工艺简单先进、经济实用，适合于工业化生产。由于半枝莲总黄酮中大部分是黄酮苷类，少量或不含黄酮苷元类，极易溶于碱性溶液。同时考虑黄酮类化合物对酸碱的不稳定性。故本发明使用了一种前所未有的有效提取方法，将精氨酸水溶液作为总黄酮提取溶剂。本发明中还将原药材纳米粉碎，也是创新之一。
(3)半枝莲总黄酮提取液经过实验验证，活性炭对半枝莲中黄酮类成分有强烈的吸附作用，所以在制备工艺中没有选用活性炭处理。
(4)本发明半枝莲总黄酮中药制剂为纯中药制剂，因此避免了服用和注射西药所带来的过敏反应和一些毒副作用。异常毒性检查结果表明，半枝莲总黄酮溶液对小鼠异常毒性试验合格；全身过敏试验结果表明，半枝莲总黄酮溶液对豚鼠无全身过敏反应；刺激性试验结果表明，局部刺激性试验符合规定。
附图说明：
图1为半枝莲黄酮提取物对HUVEC内皮细饱小管形成的影晌对照图；其中A：对照；B～D：25、50、100mg/L半枝莲黄酮提取物
图2为半枝莲黄酮提取物对内皮细饱迁移的影晌；其中A：对照；B～D：25、50、100mg/L半枝莲黄酮提取物
图3为芦丁标准品HPLC图谱。
图4为野黄芩苷标准品HPLC图谱。
图5为半枝莲黄酮提取液HPLC图谱。
【具体实施方式】
实施例1：各种药物制剂的制备实例
(1)总黄酮提取液制备：将半枝莲全草粗粉碎，用0.1％～0.3％(W/W)精氨酸水溶液(pH6.0～8.5)；常温浸泡、搅拌提取，得pH值为7～9的半枝莲总黄酮提取液，其总黄酮含量大于5％；
(2)总黄酮提取物制备：将步骤(1)得到的提取液用20％(W/W)醋酸调pH2～3或用10％(W/W)盐酸调pH3～4放置，分离、洗涤沉淀即为半枝莲总黄酮提取物，其总黄酮含量在75％以上；
(3)制备颗粒剂和片剂：
按配置总量计称取15％-55％的半枝莲总黄酮提取物，加入45％-85％的半枝莲纳米粉，充分搅拌混合均匀，以70％(V/V)乙醇做黏合剂，制成软材，过14目尼龙筛网制成颗粒，(将此湿颗粒直接可在包衣锅中滚成微丸，无需加任何辅料)，湿颗粒于60℃干燥2～3小时，干燥颗粒过14目筛整粒，使每克颗粒含半枝莲总黄酮提取物200～600mg既得。
将此干颗粒直接可压成片剂。
制备口服液或合剂：
按配置总量计称取15％～55％的半枝莲总黄酮提取物，加0.3％精氨酸水溶液溶解稀释至一定体积，调节pH6.5～8，冷藏24小时，滤过，滤液加水调整总量达标示量，搅匀，0.22微米滤膜滤过，灌装即得，使每毫升口服液含半枝莲总黄酮提取物50～300mg。或直接将半枝莲总黄酮提取液采用流通蒸汽100℃加热30min，4℃冷藏放置24h，经0.22微米滤膜滤过，调配使每毫升口服液含半枝莲总黄酮提取物50～300mg灌装即得。
实施例2：总黄酮含量测定方法
(1)紫外吸收波长的确立
精密称取野黄芩苷对照品，加入0.3％精氨酸水溶液(pH8.5)，制成浓度为0.028mg/mL的野黄芩苷对照品溶液，进行紫外全波长(190nm～900nm)扫描，结果野黄芩苷在λ＝277nm和λ＝327nm处各有一个吸收峰，半枝莲总黄酮提取液的紫外吸收光谱与野黄芩甙的紫外吸收光谱基本一致。实验证明，半枝莲药材中其它脂溶性成分在277nm波长处也有紫外吸收，对该峰影响较大，而半枝莲中总黄酮以外的其它成分则在327nm波长处吸收很小。所以确定在327nm处测定半枝莲总黄酮的吸收度。
(2)标准曲线的建立
精密称取野黄芩苷对照品1.700mg，置10mL量瓶中，加入0.3％精氨酸水溶液(pH8.5)至刻度，定容。精密吸取野黄芩苷对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml分别置于25ml量瓶中，加0.3％精氨酸水溶液(pH8.5)至刻度，摇匀。按2005年版中国药典中紫外分光光度法项下，以0.3％精氨酸水溶液(pH8.5)为空白，在327nm波长处分别测定吸光度，以吸光度(Y)为纵坐标，溶液浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y＝14.369x-0.0211，r＝0.9994(n＝5)，结果表明半枝莲总黄酮在0.0027072-0.0135360mg·ml-1呈良好的线性关系。
(3)精密度试验
将同一批次的半枝莲提取液用上法重复检测5次，计算提取液总黄酮含量，RSD为1.5％，精密度良好。
(4)稳定性试验
取上述已测定地对照品溶液及样品溶液，放置3、6、9、12小时后，经紫外光谱测定，其吸收值基本不变，说明对照品溶液及样品溶液都是很稳定的。
(5)加样回收试验
精密称取已知总黄酮含量的半枝莲黄酮提取液1ml，共9份，分为低、中、高3组，分别加入野黄芩苷对照品溶液(相当于野黄芩苷0.025、0.050、0.075mg)，测定半枝莲黄酮提取液中黄酮含量，计算回收率，RSD为1.87％，结果见表1。
表1 加样回收率试验结果
(6)样品测定
取制备好的半枝莲黄酮提取液，将提取液在327nm处测定吸收度，利用标准曲线外标法定量，计算半枝莲黄酮提取液中总黄酮的含量，结果见表2。
表2 不同批次半枝莲黄酮提取液总黄酮含量测定结果
实施例3：疗效观察
材料和方法
(1)材料
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、宫颈癌Hela细胞株由扬州大学医学院中医药研究所提供；半枝莲黄酮类化合物提取物由扬州大学医学院中医药研究所提供；成纤维生长因子(bFGF)和Matrigel分别购自Sigma和BD公司；人VEGF的ELISV试剂盒购自武汉博士德公司；NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所；AnnexinV联合PI双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；将用二甲基亚砜(DMSO)、M199及DMEM培养基配置成1g/L的母液，抽滤后-20℃保存，实验当天取出稀释成实验所需浓度；HUVEC和Hela细胞均在孵箱中常规培养，以胰蛋白酶消化后进行传代，取对数生长期细胞用于实验。在预实验中通过MTT比色法确定半枝莲黄酮提取物的IC10为104.08mg/L，选择与IC10接近的整数浓度并倍数递减作为实验的浓度。
(2)方法
①内皮细胞小管形成实验：将24孔板每孔加预先置4℃过夜的Matrigel300μl，在37℃、50ml/LCO2培养箱中聚合1h，将HUVEC用胰酶消化后用培养液调2×108/L浓度的细胞悬液，并添加10μg/LbFGF和分别25、50、100mg/L的半枝莲黄酮提取物，另设空白组(孔内加细胞不加药)和溶媒对照组(培养液中含有0.1g/LDMSO)，混匀放入37℃、50ml/LCO2培养箱中培养6h后在100倍Olympus倒置显微镜下观察小管形成的情况，每孔取5个视野计数小管形成数，取平均值。
②内皮细胞迁移实验：将内皮细胞消化后以1×108/L种入24孔板，在培养基中加入半枝莲黄酮提取物，药物终浓度为25、50、100mg/L，终体积2ml，并设阴性对照组和溶媒对照组共5组，37℃、50ml/LCO2培养箱中培养24h后消化，并用无血清M199培养基调整密度为1×108/L。在Transwell上室的聚碳酸脂膜上加入3mg/L的Matrigel20μl，37℃聚合30min，在Transwell的下室加入600μlHela细胞条件培养液，同时上室分别种入用无血清M199稀释的内皮细胞，每孔100μl，培养18h后取出小室，用棉签拭去滤膜上层未迁移的内皮细胞，固定，染色，用刀片取下滤膜，中性树脂固定于载玻片上，在显微镜下随机计数中间和周围共5个视野细胞数，各组计数4个样本，求出平均值。
③对Hela细胞VEGF和NO表达的影响：将Hela细胞消化后以3×108/L浓度种植6孔板，培养24h后，用PBS清洗2次，加入100mg/L NBS的DMEM培养基和药物，终浓度为25、50、100mg/L，终体积2ml，37℃、50ml/LCO2培养箱中分别培养24h和48h后收集培养上清，12000r/min离心10min，取上清经0.22μm滤膜抽滤后，用ELISA和NO试剂盒测定上清中VEGF和NO含量。
统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件分析，实验结果以mean±SD表示，进行方差分析和t验验。
(3)结果
①半枝莲黄酮提取物对内皮细胞小管形成及迁移的影响：25mg/L的低浓度作用后对小管形成数无明显影响，当浓度达到50mg/L以上时对小管形成有明显影响，不仅小管数目减少，而且管腔不完整，与空白组相比有差异(P＜0.05)，浓度达到100mg/L时，很少有完整小管形成(表3，图1)。HUVEC经50、100mg/L的半枝莲黄酮提取物作用后，内皮细胞的迁移数明显减少(p＜0.01)，且迁移的内皮细胞数随着浓度的增加而减少(表3，图2)。
表3半枝莲黄酮提取物对内皮细胞小管形成及迁移的影响mean±SD，n＝4
ap＜0.05，bp＜0.01，vs对照组
表4半枝莲黄酮提取物对Hela细胞分泌VEGF和NO的影响mean±SD，n＝4
bp＜0.01，vs对照组
②半枝莲黄酮提取物对Hela细胞分泌VEGF和NO的影响：半枝莲黄酮提取物作用24h，48h后能抑制Hela细胞VEGF的表达(p＜0.01)，但是作用24h后各组之间比较没有差异，作用48h后，中、高浓度组(50、100mg/L)之间比较有差异，且经中、高浓度组作用后的Hela细胞VEGF表达24h和48h之间比较有差异(p＜0.05)。50、100mg/L半枝莲黄酮提取物作用细胞24h后能明显抑制肿瘤细胞的NO表达，具有显著差异，且各浓度组之间比较有差异作用后各浓度均能抑制细胞的表达，有显著差异(p＜0.01)，且各浓度组之间比较有差异，作用48h后各浓度均能抑制Hela细胞NO的表达，有显著差异(p＜0.01)，各组同一浓度体系，24h与48h相比在50，100mg/L时对NO表达影响具有显著差异(p＜0.01)，其他浓度相比没有显著差异(表4)。
(4)结论
半枝莲黄酮类化合物能抑制内皮细胞小管样结构形成和肿瘤细胞条件培养液刺激下的内皮细胞迁移，实验表明其作用机制可能与其能抑制肿瘤细胞分泌NEGF及NO这些血管生成促进因子有关，为进一步探讨半枝莲在肿瘤治疗方面的前景奠定了基础。