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1、(10)申请公布号 CN 103966310 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103966310 A (21)申请号 201410040644.3 (22)申请日 2014.01.27 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 广州市体育科学研究所 地址 510000 广东省广州市天河区天河路 299 号 (72)发明人 陈伟民 娄婧婧 (74)专利代理机构 广州凯东知识产权代理有限 公司 44259 代理人 陈领 (54) 发明名称 乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种乳腺癌易感基因快速检测 试剂盒， 包括检测 Foxp3、。
2、 FGFR2、 CD14、 BRCA1 基因 所对应的 5 个 SNP 多态性检测。本发明还公开一 种乳腺癌易感基因快速检测方法。本发明的有益 效果如下 ： 通过半巢式 AS-PCR 扩增和琼脂糖凝胶 电泳检测， 根据 DNA 电泳条带进行基因分型， 筛选 出具有潜在乳腺癌易感的个体， 从而达到预防乳 腺癌的目的 ； 此方法操作简便， 检测时间短、 成本 低， 此外还具有灵敏度高， 特异性强， 应用前景广 阔。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 15 页 序列表 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书15页 序。
3、列表5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103966310 A CN 103966310 A 1/3 页 2 1.乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 其特征在于， 包括检测Foxp3基因上rs2294021号 多态位点， 其中检测 Foxp3 基因多态位点的引物混合物为 ： SEQ NO.1 ： 5 -CCCGCAGGAAGGAGGAGGTCT-3 ； SEQ NO.2 ： 5 -TTCCGAACAGCATCGTCCT-3 ； SEQ NO.3 ： 5 -GGCAGGGGCTCATGGAC-3 ； SEQ NO.4 ： 5 -GGCAGGGGCTCATGGAT-3 。 2. 根据权利要求 1。
4、 所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 其特征在于， 还包括检测 FGFR2 基因上 rs1219648 和 rs2981582 号多态位点。 其中， 检测 FGFR2 基因上 rs1219648 号多态位点的引物混合物为 ： SEQ NO.1 ： 5 -ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3 ； SEQ NO.2 ： 5 -TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3 ； SEQ NO.3 ： 5 -CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3 ； SEQ NO.4 ： 5 -CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3 ； SEQ NO.5 ： 5 -ATAA。
5、ATACATCCCTTGTTCTCGT-3 ； SEQ NO.6 ： 5 -TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3 ； SEQ NO.7 ： 5 -CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3 ； SEQ NO.8 ： 5 -CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3 ； 检测 FGFR2 基因上 rs2981582 号多态位点的引物混合物为 ： SEQ NO.9 ： 5 -TCCAAGTATCACAGGGCAT-3 ； SEQ NO.10 ： 5 -CAAGAGGCAGTTCCATAATCG-3 ； SEQ NO.11 ： 5 -CACTTAATGAACCTGTTT。
6、TC-3 ； SEQ NO.12 ： 5 -CACTTAATGAACCTGTTTTT-3 。 3. 根据权利要求 2 所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 其 特征在于， 还包括检测 CD14 基因上 rs2569190 号多态位点， 其中， 检测 CD14 基因多态位点的引物混合物为 ： SEQ NO.13 ： 5 -GCAGCAACAAGCAGGACG-3 ； SEQ NO.14 ： 5 -TGGTGCCAACAGATGAGG-3 ； SEQ NO.15 ： 5 -ATGTTTCAGGGAGGGGTG-3 ； SEQ NO.16 ： 5 -ATGTTTCAGGGAGGGGTA-3 。 4.。
7、 根据权利要求 3 所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 其特征在于， 还包括检测 BRCA1 基因上 rs2046210 号多态位点， 其中， 检测 BRCA1 基因多态位点的引物混合物为 ： SEQ NO.17 ： 5 -CGGTCATTACAACACAGAACTAT-3 ； SEQ NO.18 ： 5 -CACAGAACTAAACCACCAAGAG-3 ； SEQ NO.19 ： 5 -CTTTTATTTCAGGTAGATTT-3 ； SEQ NO.20 ： 5 -CTTTTATTTCAGGTAGATTC-3 。 5.根据权利要求1、 2、 3或者4所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 。
8、其特征在于， 检 测 Foxp3 基因上 rs2294021 号多态位点的引物混合物的摩尔数比为 SEQ NO.1 ： SEQ NO.2/ SEQ NO.3:SEQ NO.4=1 ： 1 ： 1 ； 检测FGFR2基因上rs1219648号多态位点的引物混合物的摩尔 数比都为 SEQ NO.5 ： SEQ NO.6/SEQ NO.7:SEQ NO.8=1 ： 1 ： 1 ； 检测 FGFR2 基因上 rs2981582 号多态位点的引物混合物的摩尔数比都为SEQ NO.9 ： SEQ NO.10/SEQ NO.11:SEQ NO.12=1 ： 权 利 要 求 书 CN 103966310 A 。
9、2 2/3 页 3 1 ： 1 ； 检测 CD14 基因上 rs2569190 号多态位点的引物混合物的摩尔数比为 SEQ NO.13 ： SEQ NO.14/SEQ NO.15:SEQ NO.16=1 ： 1 ： 1 ； 检测 BRCA1 基因上 rs2046210 号多态位点的引物混 合物的摩尔数比为 SEQ NO.17 ： SEQ NO.19/SEQ NO.19:SEQ NO.20=0.2-0.5 ： 1 ： 1。 6. 根据权利要求 1 所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 其特征在于， 还包括扩增 试剂和扩增后的基因分型用试剂， 所述扩增试剂包括PCR缓冲液、 dNTPs混合物、 热。
10、启动Taq 酶和超纯水 ； 所述扩 增后的基因分型用试剂包括琼脂糖、 TAE 缓冲液、 DNA 分子量标准、 DNA 无毒染料和 DNA 上样缓冲液。 7. 根据权利要求 6 所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述扩增试 剂包括 10X PCR buffer ： 其中， Tris-HCl pH8.0100mM;KCl500mM;MgCl215mM， 各组分浓度为 2.5mM 的 dNTPs 混合物， 5U/l 的热启动 Taq 酶用量为 0.1-0.125l。 8. 根据权利要求 1 所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 其特征在于， 扩增试剂由 以下体积的组分组成 ： 对于。
11、上述 Foxp3、 FGFR2、 CD14、 BRCA1 所对应的引物中， 上、 下游引物及多态性引物的 浓度均为 10M ； 检测 Foxp3 基因多态位点的引物混合物 SEQ NO.1， SEQ NO.2， SEQ NO.3 和 SEQ NO.4 的用量分别为 0.4l-0.7l ； 检测 FGFR2 基因 2 个多态位点的引物混合物 SEQ NO.1-12 的用量都分别为 0.3l-0.8l ； 检测 CD14 基因多态位点的引物混合物 SEQ NO.13， SEQ NO.14， SEQ NO.15和SEQ NO.16的用量分别为0.3l-0.7l ； 检测BRCA1基因 多态位点的引物。
12、混合物中 SEQ NO.17 引物的用量为 0.1l-0.3l,SEQ NO.18， SEQ NO.19 和 SEQ NO.20 引物用量分别为 0.3l-0.7l。 9. 一种乳腺癌易感基因快速检测方法， 其特征在于， 其步骤包 括， （1） 、 检材基因组的 DNA 提取 ； （2） 、 扩增和扩增产物的检测分析 ； 权 利 要 求 书 CN 103966310 A 3 3/3 页 4 对于上述 Foxp3、 FGFR2、 CD14、 BRCA1 所对应的引物中， 上、 下游引物及多态性引物的 浓度均为 10M ； 检测 Foxp3 基因多态位点的引物混合物 SEQ NO.1， SEQ N。
13、O.2， SEQ NO.3 和 SEQ NO.4 的用量分别为 0.4l-0.7l ； 检测 FGFR2 基因 2 个多态位点的引物混合物 SEQ NO.1-12 的用量都分别为 0.3l-0.8l ； 检测 CD14 基因多态位点的引物混合物 SEQ NO.13， SEQ NO.14， SEQ NO.15和SEQ NO.16的用量分别为0.3l-0.7l ； 检测BRCA1基因 多态位点的引物混合物中 SEQ NO.17 引物的用量为 0.1l-0.3l,SEQ NO.18， SEQ NO.19 和 SEQ NO.20 引物用量分别为 0.3l-0.7l。 PCR 扩增程序如下 ： 权 利 。
14、要 求 书 CN 103966310 A 4 1/15 页 5 乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法 技术领域 ： 0001 本发明涉及生物基因检测技术领域， 具体为一种乳腺癌易感基因快速检测试剂盒 及检测方法。 背景技术 ： 0002 乳腺癌 （Breast cancer） 被称之为女性杀手， 发病率仅次于肺癌。据世界卫生组 织国际癌症研究中心发布的癌症报告 （GLOBOCAN2008） 估计， 全世界每年约有 138 万妇女罹 患乳腺癌， 约有54万乳腺癌患者死亡。 2008年中国女性乳腺癌新发病例数约16.9万， 世界 人口标化发病率为 21.6/10 万 , 居女性所有恶性肿瘤第 2。
15、 位 ； 死亡率为 5.7/10 万， 居女性 癌症死亡的第 6 位。 0003 早诊断早发现， 乳腺癌病情的治愈还是相当令人乐观的。在第 IV 期得到诊断的乳 腺癌患者只有20%能够存活到5年之后， 而在第I期就确诊的患者100%活到5年之后。 因此， 乳腺癌的早期诊断是目前亟待解决的问题。 0004 目前， 临床上对乳腺癌检测有传统的检测方法， 包括 X 线诊断、 超声显象检查、 细 胞学及组织学诊断等， 但这些检测手段针对性不强， 检出率低， 具有较大的局限性 ； 还有一 些基因检测手段， 如免疫组化技术、 荧光原位杂交技术、 荧光定量 PCR 技术、 基因芯片技术 等。 免疫组化技术可。
16、检测肿瘤和靶细胞蛋白表达情况， 不能观察基因水平突变类型， FISH能 直接和准确的判断靶基因是否存在扩增， 但较昂贵和繁琐。 基因芯片技术可检测人数多、 位 点多， 时间短， 但仅用于已公布的基因位点、 重复准确性低， 价格高。荧光定量 PCR 技术试剂 昂贵， 需精密仪器等。这些技术的缺点都大大的限制了乳腺癌早期诊断的应用。 0005 国内外对乳腺癌易感基因的研究表明， 乳腺癌患者在基因水平存在某些基因突变 的现象， 大多表现为 SNP 或碱基缺失多态性。乳腺癌具有发病率、 死亡率高等特点， 因此， 通 过早期基因筛查、 风险评估和监测来规避乳腺癌的发生就显得尤为重要。 0006 目前， 。
17、乳腺癌与基因多态性关联性研究成果使乳腺癌易感基因筛查成为可能。研 究表明， Foxp3、 CD14、 FGFR2、 BRCA14 个基因多态位点突变与乳腺癌发生显著相关。4 个 基因中， Foxp3 为调节性 T 细胞特异性转录因子， 对其发育和功能起着重要的调节作用， Foxp3+CD4+CD25 在肿瘤免疫逃逸机制中起重要作用。CD14 识别、 结合 LPS 复合物， 介导 LPS所致的细胞反应， 在LPS性炎症反应、 内毒休克等病理反应中起重要作用， D14参与了乳 腺癌， 膀胱癌等肿瘤的发生过程 ； FGFR2 指导细胞分裂、 迁移和分化成更加具有功能性的细 胞， FGFR2 受体镶嵌。
18、在细胞表面， 接受来自外部的信号， 从而传递信号到内表面， 最终指导细 胞分化。FGFR2 基因的突变， 会引起细胞过度增生而引起癌症的发生 ； BRCA1 主要作用是控 制传递细胞繁殖的信息， 如果出现变异， 细胞将会无节制地繁殖， 导致癌症。大约有 10% 的 乳腺癌由遗传性的 BRCA1 基因突变引发的。 0007 中国汉族乳腺癌人群中， 广泛存在 Foxp3、 CD14、 FGFR2、 BRCA1， 4 个基因的单核苷 酸多态性改变， 从而导致乳腺癌的发生， 因此筛查该 4 个基因的多态位点突变对于防治乳 腺癌具有特殊的意义。 说 明 书 CN 103966310 A 5 2/15 页。
19、 6 发明内容 ： 0008 本发明的目的是以上述现有技术为基础， 提供一种操作简易、 多位点、 高效率、 低 成本、 高灵敏度的， 对乳腺癌能起到预防作用的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒。 0009 本发明另一目的是提供一种乳腺癌易感基因快速检测方法。 0010 为了实现本发明目的， 本发明采取的技术方案是 ： 乳腺癌易感基因快速检测试剂 盒， 包括检测 Foxp3 基因上 rs2294021 号多态位点的引物混合物， 其中， 检测 Foxp3 基因上 rs2294021 号多态位点的引物混合物为 ： 0011 0012 且摩尔数比为SEQ NO.1 ： SEQ NO.2/SEQ NO.3:S。
20、EQ NO.4=1 ： 1 ： 1 ； 在检测时， 浓度为 10M 的上述引物 SEQ NO.1， SEQ NO.2， SEQ NO.3 和 SEQ NO.4 的用量为 0.3l-0.7l。 其中， 上游引物为 SEQ NO.1， 下游引物为 SEQ NO.2， 多态性引物为 SEQ NO.3 和 SEQ NO.4。 0013 所述乳腺癌易感基因快速检测试剂盒还包括检测 FGFR2 基因上 rs1219648 和 rs2981582 号多态位点的引物混合物， 其中， 检测 FGFR2 基因上 rs1219648 多态位点的引物 混合物为 ： 0014 0015 且摩尔数比为SEQ NO.5 ：。
21、 SEQ NO.6/SEQ NO.7:SEQ NO.8=0.4-0.7 ： 1 ： 1 ； 在检测时， 浓度为10uM的上述SEQ NO.5引物的用量为0.4l-0.7l,浓度为10uM的上述SEQ NO.6， SEQ NO.7 和 SEQ NO.8 引物用量为 0.5l-0.8l。其中， 上游引物为 SEQ NO.5， 下游引物 为 SEQ NO.6， 多态性引物为 SEQ NO.7 和 SEQ NO.8。 0016 检测 FGFR2 基因上 rs2981582 号多态位点的引物混合物为 ： 0017 说 明 书 CN 103966310 A 6 3/15 页 7 0018 且 摩 尔 数 。
22、比 为 SEQ NO.9 ： SEQ NO.10/SEQ NO.11:SEQ NO.12=1 ： 1 ： 1 ； 在 检 测 时， 浓度为 10uM 的上述引物 （SEQ NO.9， SEQ NO.10， SEQ NO.11 和 SEQ NO.12） 的用量为 0.4l-0.7l ； 其中， 上游引物为 SEQ NO.9， 下游引物为 SEQ NO.10， 多态性引物为 SEQ NO.11 和 SEQ NO.12。 0019 所述乳腺癌易感基因快速检测试剂盒还包括检测 CD14、 BRCA1 基因多态位点的引 物混合物， 其中， 检测 CD14 基因上 rs2569190 号多态位点的引物混合。
23、物为 ： 0020 0021 且摩尔数比为SEQ NO.13 ： SEQ NO.14/SEQ NO.15:SEQ NO.16=0.5 ： 1 ： 1 ； 在检测时， 浓度为10uM的上述SEQ NO.13引物的用量为0.3l-0.7l,浓度为10uM的上述引物SEQ NO.14， SEQ NO.15 和 SEQ NO.16 的用量为 0.3l-0.7l。其中， 上游引物为 SEQ NO.13， 下游引物为 SEQ NO.14， 多态性引物为 SEQ NO.15 和 SEQ NO.16。 0022 检测 BRCA1 基因上 rs2046210 号多态位点的引物混合物为 ： 0023 0024 且。
24、摩尔数比为 SEQ NO.17 ： SEQ NO.18/SEQ NO.19:SEQ NO.20=0.25 ： 1 ： 1 ； 在检测 时， 浓度为 10uM 的上述 SEQ NO.17 引物的用量为 0.5ul-0.7ul, 浓度为 10uM 的上述引物 SEQ NO.18， SEQ NO.19 和 SEQ NO.20 用量为 0.6ul-1ul。其中， 上游引物为 SEQ NO.17， 下 游引物为 SEQ NO.18， 多态性引物为 SEQ NO.19 和 SEQ NO.20。 0025 所述乳腺癌易感基因快速检测试剂盒还包括扩增试剂， 所述扩增试剂包括 PCR 缓 冲液、 dNTPs 混。
25、合物、 热启动 Taq 酶和超纯水 ； 0026 优 选 的， 所 述 扩 增 试 剂 包 括 10xPCR 缓 冲 液 （其 中， Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM） ， 各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物， 5U/l的热启动 Taq 酶 （Taq HS） 用量为 0.1-0.125l。 0027 其中， 所述 PCR 缓冲液中的 Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM） ， 所述 dNTPs 混合物的各组分浓度为 2.5mM， 热启动 Taq 酶 （Taq HS） 为 5U/l。 0028 所述试剂盒还。
26、包括扩增后的基因分型用试剂， 所述扩增后的基因分型用试剂包括 琼脂糖、 TAE 缓冲液、 DNA 分子量标准 （DNA Marker） 、 DNA 无毒染料和 DNA 上样缓冲液。所述 DNA 无毒染料可以是 Biotium Gelred 无毒染料。 0029 优选的， 扩增试剂由以下体积的组分组成 ： 说 明 书 CN 103966310 A 7 4/15 页 8 0030 0031 对于上述 Foxp3 基因、 FGFR2 基因、 CD14 基因、 BRCA1 基因所对应的引物中， 所述上 游引物的浓度为 10uM, 所述多态性引物的浓度为 10uM， 所述下游引物的浓度为 10uM。对于。
27、 所述 Foxp3 基因、 FGFR2 基因、 CD14 基因、 BRCA1 基因所述上游引物、 多态性引物和下游引物 的用量按以上所述。 0032 乳腺癌易感基因快速检测方法 , 其步骤包括 ： 0033 （1） 、 检材基因组的 DNA 提取 ； 0034 （2） 、 扩增和扩增产物的检测分析 ； 0035 其中， PCR 扩增试剂由以下体积的组分组成 ： 0036 0037 0038 对于上述 Foxp3 基因、 FGFR2 基因、 CD14 基因、 BRCA1 基因所对应的引物中， 所述上 游引物的浓度为 10uM, 所述多态性引物的浓度为 10uM， 所述下游引物的浓度为 10uM。。
28、对于 所述 Foxp3 基因、 FGFR2 基因、 CD14 基因、 BRCA1 基因， 所述上游引物、 多态性引物和下游引 物的用量按以上所述。 0039 其中， 所述 PCR 缓冲液 （其中， Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM） ， 所述 说 明 书 CN 103966310 A 8 5/15 页 9 dNTPs 混合物的各组分浓度为 2.5mM， 热启动 Taq 酶 （Taq HS） 为 5U/l ； 0040 PCR 扩增程序如下 ： 0041 0042 （3） 、 琼脂糖凝胶电泳分析。 0043 所述扩增采用 AS-PCR（等位基因特异性 。
29、PCR） 来进行， 然后采用琼脂糖凝胶电泳和 凝胶成像系统进行多态性分型检测。 0044 其中， 所检测的人基因组 DNA 为使用 Chelex 法、 磁珠提取法或酚 / 氯仿抽提法对 来源样本进行处理得到的 DNA ； 所述来源样本为来源于人类的滤纸片血斑 / 口腔拭子样本、 FTA 卡血斑或血液。 0045 其中， 下游引物为检测共用引物 ; 所述多态性引物的 3端第二位碱基分别为错 配碱基， 用于检测上游引物 ； 0046 通过 AS-PCR 及琼脂糖凝胶电泳特异性检测乳腺癌易感基因 ； 用于基因检测的引 物为以上所述， 基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现， 采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。。
30、 0047 本发明选取 Foxp3 基因、 FGFR2 基因、 CD14 基因、 BRCA1 基因 4 个与乳腺癌发生显 著相关的基因的多态位点作为筛查靶点， 应用 AS-PCR 技术实现快速检测、 筛查携带乳腺癌 易感基因多态位点的潜在乳腺癌风险个体， 从而达到预防乳腺癌发生之目的。 0048 本发明同时检测 Foxp3 基因、 FGFR2 基因、 CD14 基因、 BRCA1 基因 4 个基因的 SNP （单核苷酸多态性） 多态位点。每个 SNP 多态位点的检测需要 4 条 PCR 引物 ( 一对上下游引 物， 两条多态引物 )， 共需要设计 20 条引物。每个 SNP 多态位点的检测需要。
31、做两管 PCR 扩 增， 每 5 个 SNP 多态位点， 加一管阴控， 共做 11 管 PCR 扩增反应。由于 11 管 PCR 扩增反应 是在同一台 PCR 仪上同步进行的， 为了实现乳腺癌易感基因检测的高效性， 特异性， 要求上 述 20 条 PCR 引物的 Tm 值 （退火温度） 相近， 为此在 PCR 引物的设计需要做大量的 DAN 序列 软件分析工作， 所述 Tm 值的优化需要通过大量的实验结果来确定设计的合理性。基于以上 原因， 本试剂盒各基因 SNP 多态性的检测是既相对独立又相互联系的， 不可分割。 0049 本发明的有益效果如下 ： 通过半巢式 AS-PCR 扩增和琼脂糖凝胶。
32、电泳检测， 根据 DNA 电泳条带进行基因分型， 筛选出具有乳腺癌易感风险的个体， 达到预防乳腺癌发生的目 的 ； 此方法操作简便， 时间短、 成本低， 灵敏度高， 特异性强， 具有良好的社会效益， 应用前景 广阔。 附图说明 0050 图 1 是本发明乳腺癌易感基因快速检测试剂盒基因分型电泳图 1 ； 0051 图 2 是本发明乳腺癌易感基因快速检测试剂盒基因分型电泳图 2 ； 0052 图 3 是本发明乳腺癌易感基因快速检测试剂盒对基因 CD14 多态性扩增引物比分 型电泳图。 说 明 书 CN 103966310 A 9 6/15 页 10 具体实施方式 0053 以下结合附图和具体实施。
33、例对本发明乳腺癌易感基因快速检测试剂盒进行详细 的描述说明。 0054 乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂 ； 0055 所述扩增试剂包括 PCR 缓冲液、 dNTPs 混合物、 热启动 Taq 酶、 引物混合物和超纯 水 ； 还包括扩增后的基因分型用试剂 ： 试剂琼脂糖、 TAE 缓冲液、 DNA 分子量标准、 DNA 无毒 染料和DNA上样缓冲液。 所述DNA上样缓冲液(DNA loading buffer， 6X)， 是一种常规的六 倍浓缩的 DNA 上样缓冲液， 以溴酚蓝为指示剂， 稀释至 1X（倍） 后比重仍然较大， 上样时极 易下沉， 且颜色清晰可。
34、见， 此 DNA 上样缓冲液在市场上可以购买到。 0056 所述扩增试剂包括扩增试剂包括 10 倍 PCR buffer（缓冲液） （其中， Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM） ， 各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物， 5U/l的热启动 Taq 酶 （Taq HS） 用量为 0.1-0.125l。优选的， 5U/l 的热启动 Taq 酶 （Taq HS） 用量为 0.125l。其中， dNTP 混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 dGTP， 三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 dATP， 三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 dTTP， 三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 dCTP 。
35、四中核苷酸组成。 0057 乳腺癌易感基因快速检测试剂盒， 还包括 Foxp3 基因、 FGFR2 基因、 CD14 基因、 BRCA1 基因所对应的引物混合物。 0058 其中， 检测 Foxp3 基因上 rs2294021 号多态位点的引物混合物为 ： 0059 SEQ NO.1 ： 5 -CCCGCAGGAAGGAGGAGGTCT-3 ； 0060 SEQ NO.2 ： 5 -TTCCGAACAGCATCGTCCT-3 ； 0061 SEQ NO.3 ： 5 -GGCAGGGGCTCATGGAC-3 ； 0062 SEQ NO.4 ： 5 -GGCAGGGGCTCATGGAT-3 ； 0。
36、063 且摩尔数比为SEQ NO.1 ： SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=1 ： 1 ： 1 ； 在检测时， 浓度为 10M 的上述引物 （SEQ NO.1， SEQ NO.2， SEQ NO.3 和 SEQ NO.4） 的用量为 0.4l-0.6l。 0064 检测 FGFR2 基因上 rs1219648 号多态位点的引物混合物为 ： 0065 SEQ NO.5 ： 5 -ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3 0066 SEQ NO.6 ： 5 -TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3 0067 SEQ NO.7 ： 5 -CACGCCTATTTT。
37、ACTTGACACATG-3 0068 SEQ NO.8 ： 5 -CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3 0069 且摩尔数比为SEQ NO.5 ： SEQ NO.6/SEQ NO.7:SEQ NO.8=0.5-0.6 ： 1 ： 1 ； 在检测时， 浓度为10uM的上述SEQ NO.5引物的用量为0.5l-0.6l,浓度为10uM的上述SEQ NO.6， SEQ NO.7 和 SEQ NO.8 引物用量为 0.6l-0.7l。 0070 检测 FGFR2 基因上 rs2981582 号多态位点的引物混合物为 ： 0071 SEQ NO.9 ： 5 -TCCAAGTATCACA。
38、GGGCAT-3 0072 SEQ NO.10 ： 5 -CAAGAGGCAGTTCCATAATCG-3 0073 SEQ NO.11 ： 5 -CACTTAATGAACCTGTTTTC-3 0074 SEQ NO.12 ： 5 -CACTTAATGAACCTGTTTTT-3 0075 且 摩 尔 数 比 为 SEQ NO.9 ： SEQ NO.10/SEQ NO.11:SEQ NO.12=1 ： 1 ： 1 ； 在 检 测 时， 浓度为 10uM 的上述引物 （SEQ NO.9， SEQ NO.10， SEQ NO.11 和 SEQ NO.12） 的用量为 0.5l-0.6l ； 说 明 书。
39、 CN 103966310 A 10 7/15 页 11 0076 检测 CD14 基因上 rs2569190 号多态位点的引物混合物为 ： 0077 SEQ NO.13 ： 5 -GCAGCAACAAGCAGGACG-3 0078 SEQ NO.14 ： 5 -TGGTGCCAACAGATGAGG-3 0079 SEQ NO.15 ： 5 -ATGTTTCAGGGAGGGGTG-3 0080 SEQ NO.16 ： 5 -ATGTTTCAGGGAGGGGTA-3 ； 0081 且摩尔数比为SEQ NO.13 ： SEQ NO.14/SEQ NO.15:SEQ NO.16=0.5 ： 1 ： 。
40、1 ； 在检测时， 浓度为10uM的上述SEQ NO.13引物的用量为0.5l-0.6l,浓度为10uM的上述引物SEQ NO.14， SEQ NO.15 和 SEQ NO.16 的用量为 0.4l-0.6l。 0082 检测 BRCA1 基因上 rs2046210 号多态位点的引物混合物为 ： 0083 SEQ NO.17 ： 5 -CGGTCATTACAACACAGAACTAT-3 0084 SEQ NO.18 ： 5 -CACAGAACTAAACCACCAAGAG-3 0085 SEQ NO.19 ： 5 -CTTTTATTTCAGGTAGATTT-3 0086 SEQ NO.20 ： 。
41、5 -CTTTTATTTCAGGTAGATTC-3 0087 且摩尔数比为 SEQ NO.17 ： SEQ NO.18/SEQ NO.19:SEQ NO.20=0.25 ： 1 ： 1 ； 在检测 时， 浓度为 10uM 的上述 SEQ NO.17 引物的用量为 0.6ul-0.7ul, 浓度为 10uM 的上述引物 SEQ NO.18， SEQ NO.19 和 SEQ NO.20 用量为 0.7ul-0.9ul。 0088 优选的， 检测Foxp3基因多态位点的引物混合物SEQ NO.1、 SEQ NO.2、 SEQ NO.3和 SEQ NO.4 的用量分别为 0.5l ； 检测 FGFR2。
42、 基因上 rs1219648 和 rs2981582 号多态位点的 引物混合物 SEQ NO.5-12 的用量都为 0.5l ； 检测 CD14 基因多态位点的引物混合物 SEQ NO.13， SEQ NO.14， SEQ NO.15 和 SEQ NO.16 的用量分别为 0.5l ； 检测 BRCA1 基因多态位 点的引物混合物中 SEQ NO.17 引物的用量为 0.1l,SEQ NO.18， SEQ NO.19 和 SEQ NO.20 引物用量分别为 0.5l ； 0089 优选的， 检测 Foxp3 基因多态位点的引物混合物 SEQ NO.1， SEQ NO.2， SEQ NO.3 和。
43、 SEQ NO.4 的用量分别为 0.6l ； 检测 FGFR2 基因上 rs1219648 号多态位点的引物混合 物 SEQ NO.5， SEQ NO.6， SEQ NO.7 和 SEQ NO.8 的用量分别为 0.6l ； 检测 FGFR2 基因上 rs2981582 号多态位点的引物混合物 SEQ NO.9， SEQ NO.10， SEQ NO.11 和 SEQ NO.12 的用 量分别为0.6l ； 检测CD14基因多态位点的引物混合物SEQ NO.13， SEQ NO.14， SEQ NO.15 和 SEQ NO.16 的用量分别为 0.6l ； 检测 BRCA1 基因多态位点的引物。
44、混合物中 SEQ NO.17 引物的用量为 0.1l,SEQ NO.18， SEQ NO.19 和 SEQ NO.20 引物用量分别为 0.6l ； 0090 每个基因所对应的 SNP 位点的检测需要 4 条引物完成， 由于在一个 PCR 扩增体系 中需要同时扩增内参条带和多态性目的条带， 因此， 会产生 PCR 竞争性反应， 为了提高内参 条带和多态性条带的分辨率， 需要通过实验将内参引物的摩尔数 / 体积与多态引物的摩尔 数 / 体积的比例调整到上述最佳比例， 以提高检测时分辨率。 0091 实施例 1 0092 扩增试剂由以下体积的组分组成 ： 说 明 书 CN 103966310 A 。
45、11 8/15 页 12 0093 0094 0095 其中， 所述内参上游引物的浓度为 10uM, 所述多态性引物的浓度为 10uM， 所述下 游引物的浓度为 10uM。 0096 PCR 扩增程序如下 ： 0097 0098 （3） 、 做琼脂糖凝胶电泳分析。 0099 实施例 2 0100 扩增试剂由以下体积的组分组成 ： 说 明 书 CN 103966310 A 12 9/15 页 13 0101 0102 实施例 3 0103 扩增试剂由以下体积的组分组成 ： 0104 0105 为了验证上述信息， 可以将扩增产物在 ABI3130 基因遗传分析仪上的检测分析， 以验证本发明上述检测。
46、结果。 0106 由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物， 将10l上样混合物与1l扩增 说 明 书 CN 103966310 A 13 10/15 页 14 产物或等位基因分析标准物混合， 避免产生气泡， 95变性 5min， 做电泳， 用 ABI3130 基因 遗传分析仪检测分析验证分析结果。 0107 所述扩增采用 AS-PCR（等位基因特异性 PCR） 来进行， 采用琼脂糖凝胶电泳进行多 态性分型检测。 0108 其中所检测的人基因组 DNA 为使用 Chelex 法、 磁珠提取法或酚 / 氯仿抽提法对 来源样本进行处理得到的 DNA ； 所述来源样本为来源于人类的滤纸片血斑 / 口。
47、腔拭子样本、 FTA 卡血斑或血液。 0109 通过 AS-PCR 及琼脂糖凝胶电泳特异性检测乳腺癌易感基因， Foxp3、 FGFR2、 CD14、 BRCA1 基因的引物为 SEQ NO.1、 SEQ NO.2、 SEQ NO.3、 SEQ NO.4， 所述基因的扩增采用聚合 酶链式反应来实现， 采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。 0110 效果说明 0111 对上述琼脂糖凝胶电泳检测得到的电泳图分型完整清晰， 如图 1 所示。其中， 用 M.DL1000DNA分子量标准 ； 1-6泳道为FGFR2(rs1219648)基因的PCR扩增产物 ； 7-12泳道为 FGFR2(rs2981582) 。
48、基因的 PCR 扩增产物 ； 13-18 泳道为 Foxp3 基因的 PCR 扩增产物 ； 19-24 泳道为CD14基因的PCR扩增产物 ； 25-30泳道为BRCA1基因的PCR扩增产物;1、 2、 19、 20泳 道基因分型为 GG 型 ； 3、 4、 21、 22 泳道基因分型为 AG 型 ； 5、 6、 23、 24 泳道基因分型为 AA 型 ； 7、 8、 17、 18、 25、 26泳道基因分型为CC型 ； 9、 10、 15、 16、 27、 28泳道基因分型为CT型 ； 11、 12、 13、 14、 29、 30 泳道基因分型为 TT 型。 0112 在乳腺癌易感基因分型电泳图中， Foxp3 基因的参考片段大小为 835bp, 目 的 条 带 大 小 为 404bp;CD14 基 因 的 参 考 片 段 大 小 为 732bp, 目 的 条 带 大 小 为 459bp ； FGFR2(rs1219648) 基 因 的 参 考 片 段 大 小 为 801bp, 目 的 条 带 大 小 为 430bp;FGFR2(rs2981582) 基因的参考片段大小为 835bp, 目的条带大小为 304。