流产布鲁氏菌免疫标记重组菌株与其在制备疫苗中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种流产布鲁氏菌免疫标记重组菌株与其在制备疫苗中的应用。
背景技术
布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染病，也是大动物传染病中仅次于口蹄疫，具有重要的政治、经济影响力的疾病，在世界各国的流行形势十分严峻。长期以来全球防控布鲁氏菌病的策略主要是检疫-扑杀(发达国家)或免疫接种(发展中国家)，前者通过检疫扑杀患病牛、羊、猪等动物为措施，耗资巨大、操作困难；后者通过免疫接种并辅助扑杀措施，虽可阻止疾病在动物群中的传播，但免疫动物和临床患病动物难以鉴别，使患病动物在自然群体中长期存在，严重威胁人类和动物群的健康，阻碍动物布鲁氏菌病的根除和净化。
根据现在国际上及我国的使用来看，粗糙型疫苗株RB51和疫苗株S19都是弱毒活疫苗，但S19的毒力强，接种母畜易引起流产，利用血清学方法不能与野生菌株感染区分；而RB51的毒力相对较弱，虽然能够进行血清学的鉴别诊断，但RB51的免疫效力备受争议，在我国也没有使用。所以安全标记疫苗菌株是现在世界各国对于布鲁氏菌病防控的技术瓶颈。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种流产布鲁氏菌免疫标记重组菌株与其在制备疫苗中的应用。
本发明提供的流产布鲁氏菌重组菌株，是将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)中的糖基转移酶基因灭活得到的菌株。
所述流产布鲁氏菌(Brucella abortus)可为现有的菌株，如野生株(包括标准株、强毒株和弱毒株)、疫苗株等，具体可为流产布鲁氏菌(Brucella abortus)2308菌株。
所述糖基转移酶可为任何来源于流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的糖基转移酶，具体可如序列表的序列1所示。
所述糖基转移酶基因的编码序列可如序列表的序列2所示。
可通过任何现有方法灭活所述糖基转移酶基因，如基因组中该序列缺失、外源或内源序列插入、同源重组、RNA干扰等。
所述同源重组可通过将DNA片段KDA5导入所述流产布鲁氏菌实现；所述DNA片段KDA5自上游至下游依次包括同源臂DA5-1和同源臂DA5-2；所述同源臂DA5-1和同源臂DA5-2能与所述流产布鲁氏菌基因组中的糖基转移酶基因的编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述糖基转移酶基因。
所述DNA片段KDA5自上游至下游依次包括同源臂DA5-1、卡那霉素抗性基因片段(以下以kan抗性基因代替)和同源臂DA5-2；所述同源臂DA5-1和同源臂DA5-2的长度均为400-600bp。
所述同源臂DA5-1具体可为以流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：
pWUM355(上游引物)：5’-GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA-3’(序列表的序列3)；
pWUM356(下游引物)：5’-AAGCTTCACGCCGAGCTTATTCATG-3’(序列表的序列4)。
所述同源臂DA5-2具体可为以流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：
pWUM357(上游引物)：5’-GGCGTGAAGCTTCAGGTCGCCGCAAATGA-3’(序列表的序列5)；
pWUM358(下游引物)：5’-CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG-3’(序列表的序列6)。
所述kan片段具体可为以pKD4质粒为模版，用以下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：
pWU0177H(上游引物)：5’-CCCCAAGCTTCACGTCTTGAGCGATTGTGTAG-3(序列表的序列7)；
pWU0178H(上游引物)：5’-CCCCAAGCTTGGAAAACGATTCCGAAGCCC-3’(序列表的序列8)。
所述DNA片段KDA5的核苷酸序列具体可如序列表的序列9所示。序列9中，自5’末端第1-587位核苷酸为DA5-1、第588-1895为核苷酸为kan抗性基因片段、第1896-24066bp位核苷酸为DA5-2。
实验证明，该重组菌株的毒力低于出发的母本菌株，免疫保护效力与现有疫苗株相当，并且具有临床检疫、诊断用免疫标记。因此，该重组菌株可用于制备布鲁氏菌疫苗。
所述重组菌株可应用于制备流产布鲁氏菌病疫苗。
本发明还保护一种流产布鲁氏菌病疫苗，它的活性成为所述的重组菌株。
本发明通过对布鲁氏菌基因组中的功能基因进行筛选，发现糖基转移酶编码基因的灭活对布鲁氏菌的毒力影响较大，同时可以改变菌株免疫动物后动物血清中的抗体组成。本发明通过将流产布鲁氏菌的糖基转移酶基因灭活，得到了新的菌株，与出发菌株相比，该新菌株的毒力较弱，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物，而且可使免疫接种动物和临床患病动物通过血清学技术进行鉴别。使用本发明的菌株免疫小鼠，小鼠体内产生的抗体与标准菌株、现有疫苗菌株不同，通过动物血清的免疫学检测能够将患病动物从免疫动物群体中鉴别出来。本发明可应用于布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，应用于开发布鲁氏菌病疫苗和配套的鉴别诊断试剂，对促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。
【附图说明】
图1为重组菌株RBA5的构建流程图。
图2为DA5-1和DA5-2的PCR扩增电泳图。
图3为DA5的PCR扩增电泳图。
图4为PCR扩增得到的kan抗性基因片段的电泳图。
图5为pEASY-T1-DA5转化大肠杆菌DH5α后经PCR扩增地鉴定图。
图6为pEASY-T1-KDA5转化大肠杆菌DH5α后经PCR扩增的鉴定图。
图7为pBluescripts II KS-KDA5转化大肠杆菌DH5α后经PCR扩增的鉴定图。
图8为pBluescripts II KS-KDA5转化大肠杆菌DH5α后双酶切鉴定图。
图9为重组菌RBA5的PCR鉴定图。
图10为重组菌RBA5接种后小鼠脾脏载菌量随时间变化曲线。
图11为重组菌RBA5接种小鼠的初步免疫保护试验结果。
【具体实施方式】
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中所用的菌株和质粒如下：
流产布鲁氏菌(Brucella abortus)菌株2308(标准菌株)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)菌株S19(疫苗菌株)均购自中国兽药监察所菌种室；流产布鲁氏菌(Brucella abortus)菌株RB51(粗糙型疫苗菌株)来自美国产商业牛布鲁氏菌粗糙型疫苗的分离菌株；pKD4质粒(E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center)；pEASY-T1 Simple载体购自北京全式金公司；pBluescripts II KS购自Stratagene公司。
实施例1、灭活糖基转移酶基因重组菌株的构建
根据流产布鲁氏菌基因组中的糖基转移酶基因(GenBank AccessionNumber：3787661)，设计两对引物，第一对引物用于扩增同源臂DA5-1，第二对引物用于扩增DA5-2。设计第三对引物，用于扩增pKD4质粒中的kan抗性基因片段。同源臂DA5-1和同源臂DA5-2连接后形成DNA片段DA5；将DA5插入pEASY-T1Simple载体，得到重组载体pEASY-T1-DA5；将kan抗性基因片段插入pEASY-T1-DA5中的DA5-1和DA5-2之间，得到重组载体pEASY-T1-KDA5；将pEASY-T1-KDA5酶切得到的KDA5片段插入pBluescripts II KS载体，最终得到重组载体pBluescripts IIKS-KDA5。重组载体pBluescripts II KS-KDA5与流产布鲁氏菌菌株2308发生同源重组即可得到灭活糖基转移酶基因并含有kan抗性基因的重组菌株。灭活糖基转移酶基因的重组菌株(RBA5)的构建流程图见图1。
一、重组载体pBluescripts II KS-KDA5的构建
1、布鲁氏菌基因组的提取
取15μl灭活的流产布鲁氏菌菌株2308，加入1ml TNE(每升含有1.21gTris，5.84g NaCl，0.37g EDTA)混匀，10000r/min离心，留沉淀弃上清。之后加入135μl TNE重悬洗涤后的沉淀。再向其中加入135μl含2％Triton X-100的TNE，混匀。加30μl新鲜配制的溶菌酶(5mg/ml)，轻弹试管混匀。37℃水浴孵育30min，之后加入15μl蛋白酶K(20mg/ml)，涡旋混匀。65℃水浴至少孵育2h。
加入RNAse(使RNAse浓度达到10μg/ml)，琼脂糖凝胶电泳鉴定后将提取的基因组DNA于4℃保存备用。
2、PCR扩增糖基转移酶基因的上游片段DA5-1(587bp)和下游片段DA5-2(511bp)
扩增上游片段的引物如下：
pWUM355(上游引物)：5’-GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA-3’；
pWUM356(下游引物)：5’-AAGCTTCACGCCGAGCTTATTCATG-3’。
上游引物中加入KpnI酶切位点，下游引物中加入HindIII酶切位点。
扩增下游片段的引物如下：
pWUM357(上游引物)：5’-GGCGTGAAGCTTCAGGTCGCCGCAAATGA-3’；
pWUM358(下游引物)：5’-CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG-3’。
上游引物中加入HindIII酶切位点，下游引物中加入BamHI酶切位点。
以步骤1得到的基因组DNA为模板，分别使用上述两个引物对进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min；94℃变性45s，退火温度从65℃至50℃每降1℃运行2个循环，每个循环72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。
扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图2，图2中，1：DA5-1的PCR扩增产物；2：DA5-2的PCR扩增产物；3：DNA分子量标准。结果表明，成功扩增出了目的片段。
3、DA5DNA片段的获得
通过重叠PCR的方法，将上游片段DA5-1和下游片段DA5-2连接，得到片段即为DA5片段(1098bp)。
PCR扩增引物如下：
pWUM355(上游引物)：5’-GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA-3’；
pWUM358(下游引物)：5’-CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG-3’。
使用上述两个引物进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min；94℃变性45s，退火温度从65℃至50℃每降1℃运行2个循环，每个循环72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。
扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图3，图3中，1：PCR扩增产物；2：DNA分子量标准。结果表明，成功获得了将DA5-1和DA5-2连接的DA5片段。
4、kan抗性基因片段(1308bp)的获得
以pKD4质粒为模板扩增kan抗性基因片段，PCR扩增引物如下：
pWU0177H(-上游引物)：5’-CCCCAAGCTTCACGTCTTGAGCGATTGTGTAG-3；
pWU0178H(上游引物)：5’-CCCCAAGCTTGGAAAACGATTCCGAAGCCC-3’。
使用上述两个引物进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min；94℃变性45s，退火温度从65℃至50℃每降1℃运行2个循环，每个循环72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。
扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图4，图4中1：PCR扩增产物；2：DNA分子量标准。结果表明，成功从质粒中扩增出卡那霉素(kan)抗性基因片段。
5、pEASY-T1-DA5重组载体的构建
根据pEASY-T1 simple载体说明书，建立pEASY-T1 simple载体与步骤3中得到的DA5片段的克隆反应体系，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选；挑选阳性白斑菌落进行扩大培养，进行PCR鉴定，鉴定引物如下：
pWUM355(上游引物)：5’-GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA-3’；
pWUM358(下游引物)：5’-CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG-3’。
使用上述两个引物进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min；94℃变性45s，退火温度从65℃至50℃每降1℃运行2个循环，每个循环72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图5，图5中1：重组载体的PCR扩增产物；2：DNA分子量标准。结果表明，成功构建出了目的载体，将其命名为pEASY-T1-DA5重组载体。
6、pEASY-T1-KDA5重组载体的构建
将步骤5中得到的pEASY-T1-DA5载体及步骤4中得到的kan抗性基因片段分别进行HindIII酶切，酶切产物进行连接，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选；挑选阳性白斑菌落进行扩大培养，进行PCR鉴定，鉴定引物如下：
pWUM355(上游引物)：5’-GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA-3’；
pWUM358(下游引物)：5’-CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG-3’。
使用上述两个引物进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min；94℃变性45s，退火温度从65℃至50℃每降1℃运行2个循环，每个循环72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。
扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图6，图6中1：DNA分子量标准；2：重组载体的PCR扩增产物(DNA片段KDA5)。
将重组载体进行测序，结果表明，重组载体中含有DNA片段KDA5(如序列表的序列9所示)，将其命名为pEASY-T1-KDA5重组载体。
7、pBluescripts II KS-KDA5重组载体的构建
将步骤6中得到的重组载体pEASY-T1-KDA5与pBluescripts II KS(含有amp抗性基因)分别进行BamHI和KpnI双酶切，酶切产物进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑和AMP抗性筛选；挑选阳性白斑和AMP筛选阳性的菌落进行扩大培养，进行PCR鉴定，鉴定引物如下：
pWUM355(上游引物)：5’-GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA-3’；
pWUM358(下游引物)：5’-CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG-3’。
使用上述两个引物进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min；94℃变性45s，退火温度从65℃至50℃每降1℃运行2个循环，每个循环72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。
扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图7，图7中，1：重组载体PCR扩增产物(DNA片段KDA5)；2：DNA分子量标准。
提取PCR阳性重组载体进行BamHI和KpnI双酶切鉴定。酶切鉴定的结果见图8，图8中1：重组载体的酶切产物；大片段为载体骨架、小片段为KDA5片段；2：DNA分子量标准。
将重组载体进行测序，结果表明，重组载体中含有DNA片段KDA5(如序列表的序列9所示)，将其命名为pBluescripts II KS-KDA5重组载体。将含有重组载体的菌株增殖培养，保存在-80℃备用。
二、流产布鲁氏菌免疫标记重组菌株的获得
在含有20ml TSB培养基的离心管中接种50ul流产布鲁氏菌2308菌株，37℃培养24小时后，离心菌体并用预冷的三蒸水悬浮并转入预冷的1.5ml离心管中，继续离心洗涤3-4次。然后，加入适量的冷三蒸水悬浮菌液，取87ul菌液和3ul质粒(pBluescripts II KS-KDA5)加入1mm的电极杯，将电极杯放入BIORAD电穿孔仪中，调整仪器至Agr程序后，按Pulse钮进行电击。查询电击参数为2.22KV。电击后，向电极杯中加入1ml SOC培养液，转入1.5ml离心管，室温下静置10min，置于37℃摇床复苏12-18h。将转化复苏后的菌液涂布于TSB(含100ug/ul的氨苄青霉素)。5-8天后长出单个菌落。挑取单菌落至TSB液体培养基(无抗生素)37℃增殖48h，再将该菌液稀释10-100倍后，取100ul涂布于含有5％蔗糖的TSA平板培养基。经过3-5天后长出单菌落，将阳性菌落进行PCR鉴定。
PCR鉴定用的引物如下：
pWUM355(上游引物)：5’-GGGGTACCAACCCAAATGCTCACA-3’；
pWUM358(下游引物)：5’-CGGGATCCGCGTGGCAAGCGTAATG-3’。
PCR鉴定结果见图9，图9中，1：重组菌株PCR扩增产物；2：流产布鲁氏菌2308的扩增产物；3：DNA分子量标准。其中，重组菌株PCR扩增产物(即KDA5)为2406bp；流产布鲁氏菌2308PCR扩增产物(即糖基转移酶基因)为2590bp。
结果表明，通过双交换获得了灭活糖基转移酶基因(并由kan替代糖基转移酶编码基因)的流产布鲁氏菌菌株，将其命名为重组菌株RBA5。
实施例2、灭活糖基转移酶基因的流产布鲁氏菌免疫标记重组菌株RBA5鉴定
试验动物：4-6周龄SPF级Balb/C雌鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SCXK(京)2007-0001。
一、毒力鉴定
将健康小鼠随机分四组，每组20只。具体接种方案如下：
第一组：接种实施例1制备的重组菌株RBA5，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含107细菌。
第二组(对照组1)：接种流产布鲁氏菌菌株2308，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含107细菌。
第三组(对照组2)：接种流产布鲁氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含107细菌。
第四组(对照组3)：接种流产布鲁氏菌菌株RB51，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含107细菌。
分别于接种后第2、5、8和11周从每组小鼠中选5只，进行脾脏大小、脾脏载菌量和血清学检测评价。
脾脏载菌量随时间的变化见图10。图10中，WT表示接种菌株2308不同时间点载菌量，S19表示接种菌株S19不同时间点载菌量，RBA5表示接种重组菌株RBA5不同时间点载菌量，RB51表示接种菌株RB51不同时间点载菌量。结果表明：重组菌株RBA5接种后，2、5、8、11周的脾脏载菌量变化与疫苗菌株S19、粗糙型疫苗菌株RB51的脾脏载菌量的变化一致，至11周在小鼠体内全部清除；说明RBA5的毒力与S19、RB51相当，并且这三株菌株的毒力明显比流产布鲁氏菌2308弱。
血清学检测结果表明：接种流产布鲁氏菌标准菌株2308和流产布鲁氏菌疫苗菌株S19的小鼠血清通过布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200801)检测时，均能够在2分钟内出现明显的凝集反应，通过试管凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200603)检测到的抗体效价达到1∶100以上；接种流产布鲁氏菌免疫标记重组菌株RBA5与RB51的小鼠血清的检测结果均为阴性。
二、疫苗效力评价
将健康小鼠随机分为四组，每组15只。具体接种方案如下：
四组小鼠分别注射流产布鲁氏菌基因缺失标记重组菌株RBA5、流产布鲁氏菌疫苗菌株S19、粗糙型疫苗菌株RB51和PBS，具体如下：
第一组：接种实施例1制备的重组菌株RBA5，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含107细菌。
第二组(疫苗对照组)：接种流产布鲁氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含107细菌。
第三组(粗糙型菌株对照组)：接种流产布鲁氏菌菌株RB51，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含107细菌。
第四组(空白对照组)：接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml。
上述菌株接种后于接种后第12周、16周和20周分别用流产布鲁氏菌强毒株2308攻毒，剂量为106CFU/ml。攻毒两周后对各组小鼠采血并剖杀，取脾脏称重量并计算脾脏载菌量变化，评价免疫效力。
脾脏的平均载菌量变化结果如图11所示。图11中，PBS表示空白对照组，S19表示接种S19的各时间点免疫保护力，RBA5表示接种重组菌株RBA5各时间点免疫保护力，RB51表示接种RB51各时间点免疫保护力；Week代表小鼠免疫保护试验的各菌株免疫保护力检测时间点。结果表明，重组菌株RBA5的免疫保护效力比疫苗菌株S19稍差，在第9周与粗糙型疫苗菌株RB51的免疫保护力相当，第9周的免，而12、16周的免疫保护力要优于RB51。
序列表
<110>中国农业大学
<120>流产布鲁氏菌免疫标记重组菌株与其在制备疫苗中的应用
<130>CGGNARY92464
<160>9
<210>1
<211>519
<212>PRT
<213>流产布鲁氏菌(Brucella abortus)
<400>1
Met Asn Lys Leu Gly Val Phe Ile Gly Tyr Asn Pro Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Pro Tyr Gln Gly Ile Ser Arg Leu Ile Ala Phe Val Ile Lys Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Gln Gly Ser Gly Val Thr Ile Ala Cys Pro Gly Trp Leu Lys
35 40 45
Asp Asp Val Arg Val Leu Leu Glu Asp Ala Asp Ile Pro Leu Glu Ala
50 55 60
Val Lys Ile Ile Ala Thr Asn Gly Gln Pro Pro Leu Ala Ser Leu Trp
65 70 75 80
Lys Leu Arg Asp Lys Phe Arg Lys Arg Arg Thr Ser Lys Arg Lys Arg
85 90 95
Leu Trp Leu Glu Arg Tyr Gly Lys Asn Val Ala Asn Phe Val Ala Glu
100 105 110
Trp Leu Ser Ser Arg Ser Tyr Trp Gly Ile Phe Leu Gly Ala Ala Ala
115 120 125
Ile Ala Val Val Thr Ile Leu Leu Ala Val Pro Ile Ala Ile Ala Phe
130 135 140
Thr Ala Leu Ile Gly Leu Leu Phe Ala Arg Arg Leu Ile Arg Arg Val
145 150 155 160
Ile Arg Ser Lys Leu Gly Leu Phe Phe His Lys Asn Ala Asn Gln Phe
165 170 175
Asn Lys Leu Met Ser Ser Asp Glu Thr Ile Asp Arg Met Arg Glu Arg
180 185 190
Glu Phe Ser Leu Leu Met Lys Lys Ile Asn Ala Gln Lys Asp Ile Lys
195 200 205
Val Trp Tyr Val Pro Ala Met Phe Trp Pro Glu Val Ala Asn Ile Lys
210 215 220
Ser Lys Ile Val Met Ala Ala Pro Asp Ile Val Phe Phe Asp Tyr Pro
225 230 235 240
Gly Asn Phe Arg Gly Ile Arg Glu His Asn Ser Tyr Asp Arg Met Leu
245 250 255
Lys Ser Leu Arg Ser Ala Asp His Leu Val Cys Tyr Ser Glu Asn Ala
260 265 270
Lys Gln Lys His Phe Val Glu Arg Cys Asp Val Pro Ala Glu Lys Ile
275 280 285
Thr Val Ile Arg His Gly Phe Val Asp Leu Gly Ala Ser Gly Ala Ala
290 295 300
Ile Leu Arg Gln Asp Ala Leu Asp Thr Leu His Ala Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Asn Asp Gly Gln Met Pro Glu Tyr Leu Lys Gly Phe Arg Phe Asp Asp
325 330 335
Val Pro Phe Phe Phe Tyr Ser Ser Gln Leu Arg Pro His Lys Asn Ile
340 345 350
Glu Gly Leu Ile Arg Ala Tyr Ala Lys Val Leu Lys Glu His Gln Arg
355 360 365
Pro Ala Lys Leu Ile Leu Thr Ala Gln Phe Gln Tyr Asp Lys Arg Ile
370 375 380
Gln Thr Phe Ile Asp Asp Asn Gly Leu His Ala Asp Val Leu Ser Leu
385 390 395 400
His Ser Leu Pro Asn Lys Val Leu Ala Ala Leu Tyr His Leu Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Val Thr Pro Thr Asn Phe Glu Gly Gly Phe Pro Phe Thr Phe
420 425 430
Ser Glu Ala Tyr Ser Val Gly Thr Pro Ser Ile Met Ser Arg Ile Pro
435 440 445
Val Val Gln Glu Val Ile Asp Asp Pro Glu Leu Gln Asp Leu Met Thr
450 455 460
Phe Asn Pro Leu Asp Val Asp Asp Ile Ala Asn Lys Met Ile Phe Gly
465 470 475 480
Leu Asp Asn Arg Gln Arg Leu Phe Glu Ala Gln Ser Ser Leu Tyr Ala
485 490 495
Lys Leu Ser Ala Arg Thr Trp Gln Val Ala Ala Asn Asp Tyr Leu Ser
500 505 510
Leu Leu Lys Ser Val Ala Asp
515
<210>2
<211>1560
<212>DNA
<213>流产布鲁氏菌(Brucella abortus)
<400>2
atgaataagc tcggcgtgtt tatcggctat aacccaggcc aattagatcc atatcagggt 60
atttctcgct taattgcatt cgtgatcaag ggggccttga accagggtag cggtgtaaca 120
attgcttgcc ccggctggct aaaggacgat gtacgtgttc ttttggaaga tgctgatatc 180
ccacttgaag cggtcaaaat tatcgcgacg aatggtcagc ctccattggc ttcgttatgg 240
aagttgagag ataagttccg taagagacgg acgagtaaac gaaaacgtct ctggctggag 300
cgctatggca aaaatgttgc aaattttgtt gcagaatggc tttcttcgcg ctcgtattgg 360
gggatttttt tgggggctgc tgcaattgct gtagtgacta ttctacttgc cgtaccaatt 420
gctatagcct tcaccgctct tatcggcctt ctatttgctc gtcggcttat tagacgtgtt 480
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tgtgatgttc ctgcggaaaa gataacggtt atccgtcacg ggttcgtaga tttgggagct 900
tctggtgcgg ctattttgcg tcaagatgca cttgacacat tacatgcctt tatcaagaag 960
aatgatggtc aaatgccgga atatttgaaa ggtttccggt ttgacgatgt tcctttcttc 1020
ttctattctt cacagcttag accacacaaa aacatagaag gccttattag ggcttatgca 1080
aaagtattga aagagcatca gcgcccagca aaacttatcc ttacggcaca atttcaatat 1140
gacaagcgca tccagacctt tatagatgat aatggcctgc atgctgatgt gctgtcgctg 1200
cattctttac caaacaaggt acttgctgct ctatatcacc tggcatcatt gtcggtcacg 1260
ccaacaaact tcgagggagg gttcccattt acattttcag aagcctattc ggtcggcact 1320
ccatcgatca tgagccgtat cccagtcgtg caggaagtga ttgatgatcc agagcttcaa 1380
gacttgatga cattcaatcc tttggatgtg gatgatatag ccaataagat gatttttggt 1440
ttggacaaca ggcaacgtct atttgaggcg cagtctagtc tatacgccaa attatccgct 1500
cgcacatggc aggtcgccgc aaatgattat ctgtctctgc ttaaatctgt tgcagactag 1560
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
<400>3
ggggtaccaa cccaaatgct caca 24
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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aagcttcacg ccgagcttat tcatg 25
<210>5
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggcgtgaagc ttcaggtcgc cgcaaatga 29
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>6
cgggatccgc gtggcaagcg taatg 25
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccccaagctt cacgtcttga gcgattgtgt ag 32
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>8
ccccaagctt ggaaaacgat tccgaagccc 30
<210>9
<211>2406
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>9
accaacccaa atgctcacaa aaaccatgca aaagcgtttc aagcgctaga cctatattac 60
ggcaaactaa agggtaagat aaagacaaag atagtcggtg tgagtagtgt gcggatggac 120
ccatcccatc gatggcaggc caagtacgaa aataaggctt atgtgaaatc tgtacgggaa 180
attgttgcgg gtctcgacaa cctgaaaagc aatgttgagt tcgctggtga ggttgcggac 240
aaggagtatg cggagcttct tgcttcagct tgtttccttt ggcatccaac tttggcagac 300
aacggaactt ttgctgcggt cgaagcagca tatatgggat gtccaacgct ttcaaacgac 360
tacccgcaga tgcggtatat ttctaaccgt ttcgaaattc ccatgcagta ttttaacgca 420
aggtctgtga aggaaatggc atcagcgctt aagcaaatgg aggagacgcc aatagatgta 480
ggtttattgc caagtcgaga aaccctatct ctgcattcgt gggaagctca cgcttccgaa 540
tactgggatg tgatcgtgag ggcagcggca tgaataagct cggcgtggct ggagctgctt 600
cgaagttcct atactttcta gagaatagga acttcggaat aggaacttca agatcccctc 660
acgctgccgc aagcactcag ggcgcaaggg ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc 720
cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag 780
ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct 840
agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg cgccctctgg 900
taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg 960
gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca 1020
agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 1080
ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 1140
cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc 1200
agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt 1260
cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 1320
atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 1380
tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 1440
acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 1500
gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct 1560
cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc 1620
tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc 1680
tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 1740
cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt 1800
ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga 1860
gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttggtcg ccgcaaatga ttatctgtct 1920
ctgcttaaat ctgttgcaga ctagcgatta tcgaatgggc tgaactctgg attgcgcggt 1980
agtttcgcat cccaagtttc gtccacttta cgaaagttaa tctcatcgct gtggtgatat 2040
gagttgtcat aagtaatctt tgtagatggt gctttttctg cgtccagcgc ggcagggaat 2100
tcaacgcaat aactgccagc agaataataa ccagaaattc gaacataata gtgccctcga 2160
aattgattag cgcattgagg agtacctctt ctgaccatca aaatcaattg ttcaaaatgc 2220
gcttaaagca cacgtattca atatagccgc ccactgaggc ggctttttct ttgccgaaag 2280
gaaatcacca atggctaagg gaacctttgc caaagcgatg ccgcatgtct tctcggatga 2340
aggcgggtat gtcgatcatc cgaaagaccc cggcggcgca acgaatatgg gcattacgct 2400
tgccac 2406