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1、(10)申请公布号 CN 102994630 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994630 A *CN102994630A* (21)申请号 201210357881.3 (22)申请日 2012.09.24 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 中山大学达安基因股份有限公司 地址 510665 广东省广州市高新技术产业开 发区香山路 19 号 (72)发明人 李明 何瑰 陈华云 (54) 发明名称 一种卵巢透明细胞癌诊断试剂盒及其制备方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种。
2、利用 HNF1B 荧光探针制备的 荧光原位杂交检测试剂盒， 还涉及 HNF1B 荧光探 针的制备方法， 本发明的 HNF1B 荧光探针及相应 的试剂盒可用于卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案 选择。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种辅助卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案选择的 HNF1B 基因状态荧光原位杂交 检测试剂盒， 包括 ： 1) 杂交缓冲液、 荧光标记探针混合物、 未标记的竞争性 DNA、。
3、 DAPI 复染 剂， 和 2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒， 其特征在于荧光标记探针混合物包 含 GSPHNF1B 探针和 17 号染色体着丝粒探针， 每人份荧光标记探针混合物中 GSP HNF1B 和 CSP17 探针的使用量均为 0.5l。 2. 根据权利要求 1 的试剂盒， 其特征还在于未标记的竞争性 DNA 为 Human COT-1DNA。 3. 根据权利要求 1 的试剂盒， 其特征还在于杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺， SSC， 硫酸葡聚糖， 其中去离子甲酰胺浓度为 50 70， 硫酸葡聚糖浓度为 0.1g/ml。 4. 根据权利要求 1 的试剂盒， 其特征还在于 D。
4、API 复染剂配制方法为 50 250ng DAPI 溶于 1ml 抗褪色液 (10mg/ml 对苯二胺 /PBS， 甘油混合液 )。 5.一种制备权利要求1试剂盒所述HNF1B基因探针和17号染色体着丝粒探针的方法， 如下 ： (1) 片段筛选 ： 通过 NCBI Mapview 数据库检索所有含有 HNF1B 基因的克隆， 并 对这些克隆进行筛选， 选择含有 HNF1B 基因最优的克隆， 编号为 CTD-2257N17(chr17 ： 3603362436152533) ； 通过 NCBI Mapview 数据库检索 17 号染色体重复区域序列， 并进行 重复性分析， 选择引物设计区域 ；。
5、 (2) 培养鉴定 ： 按照 HNF1B 筛选确定的克隆编号购买克隆 (Invitrogen)， 常规培养， 使 用针对 HNF1B 基因区域的 STS 引物进行 PCR 扩增， 并通过 2琼脂糖凝胶电泳对扩增产物 片段进行分析， 从而完成待选 HNF1B 克隆的鉴定 ； CSP17 以人基因组 DNA 为模板， 利用设计 的引物对进行 PCR 反应， 通过电泳进行鉴定 ； 将目的产物进行克隆、 培养， 从而完成待选 CSP 17 片段鉴定 ； (3) 探针制备 ： 对鉴定阳性的菌液， 进行质粒 DNA 的提取 ； 通过 OD 值的测定对质粒 DNA 进行定量 ； 然后， 通过切口平移方法对质。
6、粒 DNA 进行荧光标记 ； 对标记产物进行纯化 ； (4) 探针验证 ： 使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。 6. 根据权利要求 5 所述的制备方法， 其特征还在于包含 HNF1B 基因片段的克隆培养 和鉴定步骤中使用的 STS 引物对序列分别为 ： 上游引物 5 -TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3 和下游引物 5 -TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3 ； PCR 扩增条件为 ： 94 5 分钟 ； (94 30 秒， 56 30 秒， 72 45 秒 )35 循环 ； 72 7 分钟。 7. 根据权利要求 5 所述的制备方法， 其特征还在于制备 。
7、CSP17 探针的引物对序列为 ： 上游引物 5-TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3和下游引物 5 -AGTGTTTCCAAACTGCTGAATC-3 ； PCR 扩增条件为 ： 94 5 分钟 ； (94 30 秒， 56 30 秒， 72 45 秒 )35 循环 ； 72 7 分钟。 8. 根据权利要求 5 所述的制备方法， 其特征还在于探针制备过程中 50l 切口平移体 系中 DNA 聚合酶 I 使用量在 10U 20U 间， DNase I 使用量在 0.001U 0.01U 间。 9. 根据权利要求 5 所述的制备方法， 其特征还在于探针标记的荧光素为荧光素标记 Spec。
8、trum dUTP。 10. 根据权利要求 5 所述的制备方法， 其特征还在于探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩， 最 后使用 1 2l 灭菌纯化水或 Human Cot-1DNA(1g/l) 溶解沉淀。 权 利 要 求 书 CN 102994630 A 2 1/8 页 3 一种卵巢透明细胞癌诊断试剂盒及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用 HNF1B 荧光探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒， 还涉及 HNF1B 荧光探针的制备方法， 本发明的 HNF1B 荧光探针及相应的试剂盒可用于卵巢透明细 胞癌诊断和治疗方案选择。 背景技术 0002 卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖。
9、器官常见的肿瘤之一， 发病率仅次于子宫颈 癌和子宫体癌而列居第三位。 但因卵巢癌致死者， 却占各类妇科肿瘤的首位， 对妇女生命造 成严重威胁。 卵巢癌的病因尚不清楚， 其发病可能与年龄、 生育、 血型、 精神因素及环境等有 关。卵巢癌临床早期无症状， 鉴别其组织类型及良恶性相当困难， 目前为止， 临床资料统计 五年生存率仅 25 30。卵巢癌是相对常见的病， 大约有 1.4的女性会患上这种病。 发现早， 90的病人都能活下来 ； 发现迟， 癌细胞扩散到卵巢， 存活率低于 30。卵巢透明 细胞癌 (Ovarian clear cell carcinoma， OCCA) 占卵巢癌的 5 11， 发。
10、病平均年龄 58 岁， 与子宫内膜异位症的关系密切， 在病变的卵巢中合并子宫内膜异位症达 24左右， 而同 时存在盆腔子宫内膜异位症病变的达 25 50左右， 这在其他卵巢上皮性癌中是少见 的。卵巢透明细胞癌为恶性肿瘤， 预后较其它分型更差， 与临床分期有密切关系。 0003 卵巢癌检查有几种方法， 包括细胞学诊断、 超声波检查、 免疫学检查等， 但均不十 分成功。 目前而言， 卵巢恶性肿瘤标志物的敏感性和特异性均不能满足早期诊断的需要， 多 用来检测治疗中和 / 或治疗后的病情变化， 为评定疗效和及时发现肿瘤复发提供依据。 0004 肝细胞核因子 -1(HNF1 homeobox B， HN。
11、F1B) 位于 17 号染色体长臂 1 区 2 带， 编 码一种包含同源结构域的转录因子超家族成员， 编码蛋白与 DNA 结合形成同源二聚体， 或 与 HNF1a(hepatocyte nuclear factor 1-alpha) 结合形成异质二聚体。转录因子 HNF1B 对胰腺细胞形成和维持血糖稳态具有重要作用。基因突变会导致肾囊肿和非胰岛素依赖 型糖尿病或称为第二型糖尿病， 在一些癌症中该基因的表达会发生改变。 目前有研究表明， HNF1B 是卵巢透明细胞癌的生物标志物， 可有效区分透明细胞癌与其它病变类型。临床研 究中通过 RNA 干扰该基因表达， 能达到细胞凋亡目的， 使该基因在治疗。
12、方面有广阔的应用 前景。Jin L， et al.Regulation of tissue-specific expression of renal organic anion transporters by hepatocyte nuclear factor 1/and DNA methylation.J Pharmacol Exp Ther， 2012Mar ； Stanislas Faguer， et al.Diagnosis， management， and prognosis ofHNF1B nephropathy in adulthood.Kidney International8。
13、0， 768-776 ； Berndt SI， Sampson J， Yeager M， et al.Large-scale fine mapping of the HNF1B locus and prostate cancer risk.Hum Mol Genet.2011Aug 15 ； 20(16) ： 3322-9 ； Brimo F， Herawi M， Sharma R， et al.Hepatocyte nuclear factor-1expression in clear cell adenocarcinomas of the bladder and urethra ： dia。
14、gnostic utility and implications for histogenesis.Kim HJ， Bae JS， Lee J， et.al.HNF1Bpolymorphism associated with development of prostate cancer in Korean patients.Hum Pathol.2011Nov ； 说 明 书 CN 102994630 A 3 2/8 页 4 42(11) ： 1613-9.Urology.2011Oct ； 78(4) ： 969.e1-6 ； Sohei Yamamoto， Hitoshi Tsuda， S。
15、hinsuke Aida， et， al.Immunohistochemical detection of hepatocyte nuclearfactor 1in ovarian and endometrial clear-cell adenocarcinomas and nonneoplastic endometrium.Human Pathology Vol.38.Issue 7， 1074-1080 ； K.Yamaguchi， M.Mandai， T.Oura， N.Matsumura， J.Hamanishi and T.Baba et al.， Identification of。
16、 an ovarian clear cell carcinoma gene signature that reflects inherent disease biology and the carcinogenic processes， Oncogene 29(2010)， pp.1741-1752. 0005 目前试验室检测方法常见的有基于免疫组化的表达分析和基于荧光定量 PCR 方 法 (FQ-PCR) 或测序技术的突变及缺失分析。Harries LW， Brown JE， Gloyn AL(2009) Species-Specific Differences in the Express。
17、ion of the HNF1A，HNF1Band HNF4AGenes.PLoSONE 4(11) ： e7855 ； Immunohistochemical detection of hepatocyte nuclearfactor 1in ovarian and endometrial clear-cell adenocarcinomas and nonneoplastic endometrium.Human Pathology Vol.38， Issue 7， 1074-1080 0006 综上， HNF1B 因其在卵巢透明细胞癌中的特异表达特征， 有望作为肿瘤鉴别分型和 靶向治疗的新。
18、靶标。 但该基因的检测方法目前仅停留在试验室阶段， 市场无灵敏度高、 特异 性好的检测试剂。 0007 荧光原位杂交技术基于碱基互补原则， 用已知序列标记 DNA 探针与载玻片上的待 测 DNA/RNA 互补杂交， 在荧光显微镜下检测杂交信号判断结果。FISH 技术将细胞遗传学和 分子生物学改变联系起来， 让微小的基因改变显现于肉眼之下， 拓展了细胞遗传学检测的 范围， 显著提高了其识别异常染色体的能力。 目前已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、 易位重排及缺失等检测。 0008 本发明利用荧光原位杂交技术， 以 HNF1B 基因区段为靶标， 设计并制备荧光探针。 利用探针实现对 HNF1B 。
19、基因状态的检测， 有助于卵巢透明细胞癌鉴别分型和治疗方案制 定， 从而达到早鉴别早治疗， 提高诊疗效果。 0009 本发明提供了一种卵巢透明细胞癌分子标志物 HNF1B 探针的制备方法， 并在此基 础上利用探针自主研制了 HNF1B 基因检测试剂盒， 填补了国内该检测领域的空白， 具有十 分重 大的意义。 发明内容 0010 本发明的一个目的是提供 HNF1B 基因探针 (GSP HNF1B) 和作为内控的用于 17 号 染色体鉴别的 17 号染色体着丝粒探针 (CSP17) 的制备方法。 0011 根据本发明一个优选的实施方案， GSP HNF1B 的制备步骤包括 ： 0012 (1) 克隆。
20、筛选 ： 通过 NCBI Mapview 数据库检索所有含有 HNF1B(17q12) 基因的克 隆， 并对这些克隆进行筛选， 选择最优的克隆。 0013 (2) 克隆培养和鉴定 ： 按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆， 取 100l 克隆 菌液加入至 500ml 的 TB 培养液 ( 氯霉素抗性 ) 中， 37摇床中摇菌培养 8 12 小时 ； 针对 HNF1B 基因探针使用相应的 STS 引物进行 PCR 扩增， 并通过 2琼脂糖凝胶电泳对扩增产物 片段进行分析， 从而完成待选克隆的鉴定。 0014 (3) 基因探针制备 ： 对鉴定阳性的菌液， 进行质粒 DNA 的提取 ； 通过 OD 。
21、值的测定 说 明 书 CN 102994630 A 4 3/8 页 5 对质粒 DNA 进行定量 ； 然后， 对质粒 DNA 进行荧光标记 ； 对标记产物进行纯化 ； 获得探针， 避 光、 -205储存。 0015 (4) 基因探针验证 ： 使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。 0016 根据本发明一个优选的实施方案， CSP17 的制备步骤包括 ： 0017 (1) 片段分析 ： 通过 NCBI Mapview 数据库检索重复区域序列， 进行重复性分析。 0018 (2) 引物设计 ： 针对重复片段， 利用 Primer Premier 5.0 设计引物对。 0019 (3)克隆、。
22、 培养和鉴定 ： 以人基因组DNA为模板， 利用上述引物对进行PCR反应。 通 过电泳进行鉴定 ； 将目的产物进行克隆、 培养， 同样使用上述引物对进行 PCR 扩增， 并通过 2琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析， 从而完成待选克隆的鉴定。 0020 (4) 探针制备 ： 对鉴定阳性的菌液， 进行质粒 DNA 的提取 ； 通过 OD 值的测定对 质粒 DNA 进行定量 ； 然后， 对质粒 DNA 进行荧光标记 ； 对标记产物进行纯化 ； 获得探针， 避 光、 -205储存。 0021 (5) 探针验证 ： 使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。 0022 根据本发明一个优选的实施方。
23、案， 克隆筛选步骤中含有 HNF1B 基因最优选的克 隆， 编号为 CTD-2257N17(chr17 ： 3603362436152533)。 0023 根据本发明一个优选的实施方案， 克隆培养和鉴定步骤中使用的 STS 引物对序列 为 ： 上游引物 5 -TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3 (SEQ ID NO ： 1) 和下游引物 5 -TGTAGCACT GTTGTTCTTTGGG-3 (SEQ ID NO ： 2) ； PCR扩增条件为 ： 945分钟 ； (94 30秒， 5630秒， 72 45 秒 )35 循环 ； 72 7 分钟。 0024 根据本发明一个优选。
24、的实施方案， 用于制备 CSP17 探针的引物对序列为 ： 上游引 物 5 -TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3 (SEQ ID NO ： 3) 和下游引物 5 -AGTGTTTCCAAACTGCTGAAT C-3 (SEQ ID NO ： 4) ； PCR扩增条件为 ： 945分钟 ； (9430秒， 5630秒， 7245秒)35 循环 ； 72 7 分钟。 0025 根据本发明一个优选的实施方案， 探针制备步骤中克隆质粒 DNA 提取可使用市售 的质粒提取试剂盒， 优选 Qiagen 公司的 Plasmid Maxi Kit。 0026 根据本发明一个优选的实施方案， 探针制。
25、备步骤中克隆质粒 DNA 的定量是将质粒 DNA 稀释后分别测定 260nm 和 280nm 下的吸光度， 计算产物浓度。 0027 根据本发明一个优选的实施方案， 探针制备步骤中质粒 DNA 进行荧光标记可以使 用切口平移方法标记， 利用 DNaseI 和 DNA 聚合酶 I 实现基因探针的荧光标记。 0028 根据本发明一个优选的实施方案， 50l 切口平移体系中 DNA 聚合酶 I 使用量在 10U 20U 间， DNase I 使用量在 0.001U 0.01U 间， 标记条件为 16 2 小时。 0029 根据本发明一个优选的实施方案， 探针标记的荧光素为荧光素标记的 dUTP， 并。
26、优 选 Spectrum dUTP。 0030 根据本发明一个优选的实施方案， 探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩， 最后使用 1 2l 灭菌纯化水或 Human Cot-1DNA(1g/l) 溶解沉淀。 0031 本发明的另一个目的是利用 HNF1B 基因探针和 CSP17 探针 ( 内控 ) 制备一种用于 辅助卵巢透明细胞癌鉴别分型和治疗选择的 HNF1B 基因荧光原位杂交检测试剂盒。 0032 为了实现本发明， 我们采用了以下技术方案 ： 0033 (1) 样本处理和制片 ： 按照原位杂交方法对样本进行处理。 说 明 书 CN 102994630 A 5 4/8 页 6 0034 (2) 杂交 。
27、： 配制杂交液， 主要包括标记探针和杂交缓冲液。合适温度下进行 8 16 小时的杂交， 然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针 ； DAPI 复染剂复染。 0035 (3) 通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号， 对不同信号进行观察计数。 0036 基于以上技术方案发明的试剂盒包括 ： 1) 杂交缓冲液、 荧光标记探针混合物、 未 标记的竞争性 DNA， DAPI 复染剂， 和 2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。 0037 根据本发明的一个优选实施方案， 杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺， SSC， 硫 酸葡聚糖， 其中去离子甲酰胺浓度为 50 70， 硫酸葡聚糖浓度为 0.。
28、1g/ml。 0038 根据本发明的一个优选实施方案， 荧光标记探针混合物包括 GSP HNF1B 和 CSP17 探针， 每人份荧光标记探针混合物中两种基因探针的使用量均为 0.5l。 0039 根据本发明的一个优选实施方案， 由杂交缓冲液、 荧光标记探针混合物和未标记 的竞争性 DNA 配制杂交液， 其中未标记的竞争性 DNA 选择 Human COT-1DNA。每人份杂交液 中加入 7l 杂交缓冲液， 1l 荧光标记探针混合物， Human COT-1DNA 使用量为 1g， 并用 H2O 补至 10l。 0040 根据本发明的一个优选实施方案， 其中 DAPI 复染剂配制方法为 50 。
29、250ng DAPI 溶于 1ml 抗褪色液 (10mg/ml 对苯二胺 /PBS， 甘油混合液 )。 0041 利用本发明的试剂盒， 依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行 信号计数。 0042 本发明与现有技术相比， 具有下列优点 ： 0043 (1) 实现了对卵巢透明细胞癌新分子标志物 HNF1B 基因状态的检测 ； 0044 (2) 进行准确、 快速的信号计数、 且结果重复性好 ； 0045 (3) 无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片， 可用于中期或间期细胞信 号计数， 操作相对简单 ； 0046 (4) 通过制备成试剂盒， 可以实现在肿瘤生物学、 细胞遗传学等领域。
30、的应用， 有助 综合评价各分子标志物， 了解其与肿瘤发生等的联系。 附图说明 0047 图 1 显示 GSPHNF1B 克隆鉴定的电泳结果。目的产物 223bps。其中 1 道为 marker， 2 道为样本 ； 箭头标示代表 300bp。 0048 图 2 显示 CSP17 克隆鉴定的电泳结果。目的产物 316bps。其中 1 道为 marker， 2 道为样本 ； 箭头标示代表 300bp。 0049 图 3 显示人类外周血淋巴细胞中期染色体上 GSP HNF1B( 红色 ) 和 CSP17( 绿色 ) 检测结果。 0050 图 4 显示卵巢透明细胞癌组织样本中 GSP HNF1B( 红色。
31、 ) 和 CSP17( 绿色 ) 的检测 结果。其中箭头分别指示出两色探针的荧光信号。 0051 图 5 显示卵巢浆液性囊性癌组织样本中 GSP HNF1B( 红色 ) 和 CSP17( 绿色 ) 的检 测结果。其中箭头分别指示出两色探针的荧光信号。 图 6 显示 HNF1B 基因所在 17q12 区段。 具体实施方式 0052 下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 说 明 书 CN 102994630 A 6 5/8 页 7 0053 实施例 1 ： GSP HNF1B 探针的制备 0054 (1) 引物设计克隆筛选 ： HNF1B 基因位于人染色体 17q12 区段， NCBI Map。
32、view 数据 库检索所有含有HNF1B基因的克隆， 筛选出包含有该基因的克隆， 编号为CTD-2257N17。 (参 见附图 6) 0055 0056 (2) 克隆培养和鉴定 ： 购买克隆 CTD-2257N17， 取 100l 克隆菌液加入至 500ml 的 TB 培养液 ( 氯霉素抗性 ) 中， 37摇床中摇菌培养 8 12 小时 ； 菌液使用上游引物 5 -TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3 和下游引物 5 -TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3 进行 PCR 扩增， 扩增条件为 ： 94 5 分钟 ； (94 30 秒， 56 30 秒， 72 45 秒 。
33、)35 循环 ； 72 7 分 钟。对扩增产物进行电泳验证， 结果在 223bps 具有明亮的条带 ( 参见附图 1)。 0057 (3)基因探针制备 ： 鉴定阳性的菌液， 使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit， 按照 说明书要求的操作方法进行质粒DNA提取， 通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA 定量 ； 按照公式 ： 双链 DNA 浓度 (ng/l) OD26050(ng/l) 计算质粒 DNA 浓度。 0058 通过切口平移方法对质粒 DNA 进行荧光标记， 探针标记的荧光素为 Spectrum dUTP， 选择 orange-dUTP 标记 HNF1B。
34、 基因。按如下方案， 严格避光条件下在冰上配制 PCR 反 应体系。 0059 0060 配完后震荡混匀， 16标记 2 小时， 再 80孵育 10 分钟灭活酶。 0061 对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩， 按如下方案在 1.5ml 离心管中依次加入醋酸钠 和无水乙醇， 避光、 冰上配制 ： 0062 0063 混匀后置于 -80冰箱中 2 小时， 4 12000rpm 离心 20 分钟， 小心去上清， 勿搅动 沉淀， 加入 1ml 的 70乙醇， 4 12000 转 / 分钟离心 10 分钟， 小心去上清， 勿搅动沉淀， 避 光干燥。使用 1l 灭菌纯化水溶解沉淀， 获得 HNF1B 基因探针。
35、， 避光、 -20储存。 0064 (4)HNF1B 基因探针验证 ： 使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包 含中期或间期染色体 DNA， 荧光原位杂交后， 间期细胞或中期染色体 (10 号染色体 ) 上均可 见 荧光信号。 说 明 书 CN 102994630 A 7 6/8 页 8 0065 实施例 2 ： CSP17 着丝粒探针的制备 0066 (1) 引物设计 ： 通过 NCBI Mapview 数据库检索重复区域序列， 进行重复性分析， 利 用 Primer Premier 5.0 设计引物对。 0067 (2) 克 隆、培 养 和 鉴 定 ： 以 人 基 因 组 DNA。
36、 为 模 板，利 用 上 游 引 物 5 -TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3 (SEQ ID NO ： 3)和下游引物5 -AGTGTTTCCAAACTGCTGAATC-3 进行 PCR 反应。扩增条件为 ： 94 5 分钟 ； (94 30 秒， 56 30 秒， 72 45 秒 )35 循环 ； 72 7 分钟。对扩增产物进行电泳验证， 结果在 316bps 具有明亮的条带 ( 参见附图 2)。 0068 (3)探针制备 ： 鉴定阳性的菌液， 使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit， 按照说明 书要求的操作方法进行质粒 DNA 提取， 通过测定 260nm 和。
37、 280nm 处的吸光度对质粒 DNA 定 量 ； 按照公式 ： 双链 DNA 浓度 (ng/l) OD26050(ng/l) 计算质粒 DNA 浓度。 0069 通过切口平移方法对质粒 DNA 进行荧光标记， 探针标记的荧光素为 Spectrum dUTP， 选择 green-dUTP 标记 CSP17 探针。按如下方案， 严格避光条件下在冰上配制 PCR 反 应体系。 0070 0071 配完后震荡混匀， 16标记 2 小时， 再 80孵育 10 分钟灭活酶。 0072 对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩， 按如下方案在 1.5ml 离心管中依次加入醋酸钠 和无水乙醇， 避光、 冰上配制 ： 0。
38、073 0074 混匀后置于 -80冰箱中 2 小时， 4 12000rpm 离心 20 分钟， 小心去上清， 勿搅动 沉淀， 加入 1ml 的 70乙醇， 4 12000 转 / 分钟离心 10 分钟， 小心去上清， 勿搅动沉淀， 避 光干燥。使用 1l 灭菌纯化水溶解沉淀， 获得 HNF1B 基因探针， 避光、 -20储存。 0075 (4)CSP17 探针验证 ： 使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中 期或 间期染色体DNA， 荧光原位杂交后， 间期细胞或中期染色体(17号染色体)上均可见荧 光信号。 0076 实施例 3 ： HNF1B 基因荧光原位杂交检测试剂盒制备 。
39、0077 以 10 人份 / 盒为例。 0078 (1) 杂交液配制 说 明 书 CN 102994630 A 8 7/8 页 9 0079 将标记好的探针依次放好， 按下表方案配制荧光标记探针混合物 ： 0080 0081 按下表方案配制杂交液 ： 0082 0083 (2)DAPI 复染剂配制 0084 抗褪色液 ： 全程操作必须避光， 10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中， 调节pH为9.0， 加入 9ml 甘油， 反复震荡混匀， -20储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色， 假如呈现黄 色或者橙色则需废弃并重新配制。 0085 用去离子水配制 1mg/ml DAPI 储存液。 008。
40、6 取 2.5l 的 DAPI 溶液 (0.1mg/ml) 溶于 1ml 抗褪色液中， 避光条件下反复震荡混 匀， -20避光密闭保存。 0087 (3) 成品组装 0088 组分名称 规格 数量 杂交液 100l/ 管 1 管 DAPI 复染剂 100l/ 管 1 管 说明书 1 份 0089 实施例 4 ： HNF1B 基因荧光原位杂交检测试剂盒在福尔马林固定石蜡包埋的卵巢 组织样本中的使用方法 0090 (1) 玻片预处理 0091 玻片放入 65+5恒温箱中烤片过夜 ； 取出玻片， 放入室温二甲苯中 30 分钟， 再将 其放入室温 1 1(V V) 的二甲苯 ： 无水乙醇中 10 分钟。
41、， 放入室温无水乙醇中 10 分钟， 再 依次放入室温 100乙醇、 90乙醇、 70乙醇各3分钟 ； 室温去离子水中静置3分钟， 吸取 多余水分 ； 1005的去离子水中煮片20分钟(切片水平放置于容器中， 样本面朝上)。 在 样本区域滴加 200ul 的胃蛋白酶反应液， 消化 15 分钟。甩去多余液体， 放入 2SSC 中室温 洗涤 5 分钟 ； 取出， 再放入另一缸室温 2SSC 中 5 分钟 ； 取出， 再放入 70、 90、 100梯 度乙醇脱水各 2 分钟 ； 取出玻片， 室温晾干玻片 ； 继续杂交过程。 0092 (2) 样品和探针同时变性 0093 从试剂盒中取出杂交液， 震荡。
42、混匀， 瞬时离心 ； 加 10l 的杂交液到杂交区域， 迅 速盖上盖玻片， 轻压使杂交液均匀分布， 避免产生气泡 ； 橡皮胶水沿盖玻片边缘封片， 完全 覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘 ； 将玻片放入杂交仪中， 湿润原位杂交仪湿度条， 插入湿 说 明 书 CN 102994630 A 9 8/8 页 10 条， 盖上杂交仪上盖， 设置 “Denat&Hyb” 程序， 变性 85 2 分钟， 杂交 37 10 18 小时。继 续杂交后洗涤步骤。 0094 (3) 杂交后洗涤及复染 0095 取出， 小心去除橡皮胶水和盖玻片 ； 将玻片放入 371 2SSC 中 10 分钟 ； 再将 其放入 37+1。
43、 0.1 NP-40/2SSC 洗涤 2 分钟 ； 室温 70乙醇 3 分钟 ； 暗处晾干。 0096 复染 ： 滴加 10l DAPI 到载玻片目标区域， 盖上盖玻片， 轻压， 避免产生气泡， 在 暗处存放， 待观察。 0097 (4) 结果分析 0098 在Olympus BX53荧光显微镜下， 用滤镜组分别观察DAPI复染的杂交荧光信号， 用 CCD 照相记录。在 40 物镜下寻找， 在 100 物镜下计数 ； 调整合适的焦距， 对信号和背景 有明确的概念 ； 信号点因位于细胞内 ； 当细胞外存在荧光信号点时， 要注意与细胞内信号 点区分， 最好能避开该区域进行计数 ； 调整焦距， 在核。
44、的不同层次找到信号点 ； 记录观察每 个细胞中的各探针的数目。 0099 (5) 结果判定 0100 按处理方法要求进行操作， 记录 GSP HNF1B 和 CSP 17 信号数目。荧光原位杂交结 果显示 ： 在人外周血淋巴细胞中， 中期染色体上的对应靶点可分别见两个信号点 ( 参见附 图 3)， 其它染色体区域未见荧光信号。在组织样本中， 核内可见双色探针荧光信号， 阳性样 本见 3R2G 信号 ( 参见附图 4)， 阴性样本见 2R2G 信号 ( 参见附图 5)。 0101 实施例 5 ： HNF1B 基因检测试剂盒的临床使用评价 0102 以临床检测为卵巢透明细胞癌、 宫内膜样癌、 卵巢。
45、浆液性和粘液性囊腺癌作为检 测对象。利用本发明实施例 3 中所述的 DDIT3 基因检测试剂盒进行检测。检测结果如表 1 示。 0103 表 1 检测结果 0104 0105 从结果可知， 2 例恶性透明细胞癌检测结果均为 FISH 阳性， 其它 7 例样本均为阴 性。提示在临床检测中应用 HNF1B 检测可辅助临床诊断。 0106 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在 不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的 保护范围。 说 明 书 CN 102994630 A 10 1/2 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102994630 A 11 2/2 页 12 序 列 表 CN 102994630 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102994630 A 13 2/2 页 14 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102994630 A 14 。