说明书用于结肠直肠癌预后的方法和试剂盒
发明领域
本发明涉及结肠直肠癌的预后，具体涉及用于这种癌症预后的方法和试剂盒。
背景技术
结肠直肠癌(CRC)，也被称为结肠癌或大肠癌，在美国是第五最常见的癌症形式，在中国是第四常见癌症而在欧洲是引起癌症相关死亡的第三主要原因。CRC的早期发现仍然是公共健康的主要挑战。事实上，CRC通常是可治愈的，特别是在早期阶段被诊断时。在不同国家已采取若干筛查策略。常规CRC筛查测试包括粪便隐血测试(FOBT)、乙状结肠镜检、结肠镜检、气钡双重造影或直肠指检。它们都具有优点和局限性，但依从性仍低于预期，主要是由于后勤(logistics)或患者的不适。
数年来，寻找用于早期检测CRC的血液标记物成为焦点，特别是因为其便利性。同时，非常少量的研究支持了基于血液的测试的可行性，其表明血液中的基因生物标记物可区分CRC患者与对照。这些研究基于流式细胞术，其为计数并检验微观颗粒例如细胞的技术(通过将它们悬浮于液体流并使其通过电子检测装置)。
本发明人已发现，差异表达基因主要与免疫细胞活化和运输相关。特别地，他们证明天然杀伤细胞(NK细胞)代表外周血样品中重要的生物标记物。他们没有使用经典的流式细胞技术，而是在全血中确定差异表达基因。通过在全血中分析转录本确定基因表达水平是不常见的，因为本领域技术人员普遍承认当稀释于复杂的RNA混合物(总RNA)中时，在没有特异性纯化步骤的情况下获取特定信息是困难的。本方法的优点是其还避免了纯化RNA的步骤。
因此，本发明涉及用于在来自患者的外周血样品中确定结肠直肠癌预后的方法，所述方法包括：
a)获得所述外周血样品并从所述血液样品提取总RNA，
b)使所述总RNA与至少一种对至少一种NK细胞基因特异的试剂和不多于25种对25种NK细胞基因特异的试剂接触，
c)确定所述至少一种NK细胞基因和至多25种NK细胞基因的表达水平以获得所述患者的表达谱，
d)用之前临床分类为好的预后的患者的NK细胞基因表达谱和之前分类为差的预后的患者的NK细胞基因表达谱对所述患者的表达谱进行分析，其中
‑如果所述患者的表达谱与来自之前临床分类为差的预后的患者的表达谱聚类(cluster)，则确定所述患者具有差的预后，和
‑如果所述患者的表达谱与来自之前临床分类为好的预后的患者的表达谱聚类，则确定所述患者具有好的预后。
具体地，在上述步骤b)中，使总RNA与至少一种对至少一种NK细胞基因特异的试剂和不多于25种对25种NK细胞基因特异的试剂接触，所述NK细胞基因包括SEQ ID NO:1‑12所示的核酸序列，其中所述至少一种试剂对选自以下的至少一种NK细胞基因特异：
(i)KLRB1基因，其包含例如SEQ ID NO:1所示的全长序列，
(ii)KLRC2基因，其包含例如SEQ ID NO:2、3或4所示的全长序列，
(iii)KLRC3基因，其包含例如SEQ ID NO:5、6或7所示的全长序列，
(iv)KLRD1基因，其包含例如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示的全长序列，和
(v)KLRK1基因，其包含例如SEQ ID NO:13所示的全长序列，和
在步骤c)中确定所述至少一种NK细胞基因的表达水平以获得患者的表达谱。
如在实验数据中所详述的，至少一种上述基因的表达水平对预测CRC风险是足够的信息。
在一个实施方案中，在步骤b)中使所述总RNA与对至少5种NK细胞基因和不多于25种NK细胞基因的组合特异的试剂接触，其中所述试剂至少包括对以下的NK细胞基因特异的试剂：
(i)KLRB1基因，其包含例如SEQ ID NO:1所示的全长序列，
(ii)KLRC2基因，其包含例如SEQ ID NO:2、3或4所示的全长序列，
(iii)KLRC3基因，其包含例如SEQ ID NO:5、6或7所示的全长序列，
(iv)KLRD1基因，其包含例如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示的全长序列，和
(v)KLRK1，其包含例如SEQ ID NO:13所示的全长序列，
在步骤c)中确定至少所述4种NK细胞基因的表达水平以获得患者的表达谱。
另外，在步骤b)中，可使所述总RNA与至少一种对至少一种靶细胞基因特异的试剂和不多于5种对5种靶细胞基因特异的试剂接触，所述靶细胞基因包括SEQ ID NO:12‑24所示的核酸序列，其中所述至少一种试剂对至少一种选自以下的靶细胞基因特异：
(i)GZMB基因，其包含例如SEQ ID NO:14、15、16或17所示的全长序列，
(ii)CD247基因，其包含例如SEQ ID NO:18、19或20所示的全长序列，
(iii)RRAS2基因，其包含例如SEQ ID NO:21或22所示的全长序列，和
(iv)SH2D1B基因，其包含例如SEQ ID NO:23或24所示的全长序列，和
(v)LCK基因，其包含例如SEQ ID NO:25、26、27、28、29或30所示的全长序列，和
在步骤c)中确定所述至少一种靶细胞基因的表达水平以获得患者的表达谱；而在一个实施方案中，使所述总RNA与对5种靶细胞基因的组合特异的试剂接触，其中所述试剂对以下靶细胞基因特异：
(i)GZMB基因，其包含例如SEQ ID NO:14、15、16或17所示的全长序列，
(ii)CD247基因，其包含例如SEQ ID NO:18、19或20所示的全长序列，
(iii)RRAS2基因，其包含例如SEQ ID NO:21或22所示的全长序列，和
(iv)SH2D1B基因，其包含例如SEQ ID NO:23或24所示的全长序列，和
(v)LCK基因，其包含例如SEQ ID NO:25、26、27、28、29或30所示的全长序列，和
在步骤c)中确定所述至少5种细胞基因的表达水平以获得患者的表达谱。
在另一个实施方案中，在步骤b)中，进一步使所述总RNA与至少一种对至少一种靶细胞基因特异的试剂和不多于100种对100种靶细胞基因特异的试剂接触，所述靶细胞基因包括SEQ ID NO:25‑59所示的核酸序列，其中所述至少一种试剂对选自以下的至少一种靶细胞基因特异：
(i)MRPS6基因，其包含例如SEQ ID NO:31、32或33所示的全长序列，
(ii)SPRY4基因，其包含例如SEQ ID NO:34所示的全长序列，
(iii)NEAT1基因，其包含例如SEQ ID NO:35所示的全长序列，
(iv)CYBB基因，其包含例如SEQ ID NO:36所示的全长序列，
(v)DUSP2基因，其包含例如SEQ ID NO:37所示的全长序列，
(vi)PDEAD基因，其包含例如SEQ ID NO:38或39所示的全长序列，
(vii)SH2D2A基因，其包含例如SEQ ID NO:40、41或42所示的全长序列，
(viii)INSR基因，其包含例如SEQ ID NO:43或44所示的全长序列，
(ix)ITGAM基因，其包含例如SEQ ID NO:45所示的全长序列，
(x)VCAN基因，其包含例如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的全长序列，
(xi)CD163基因，其包含例如SEQ ID NO:50或51所示的全长序列，
(xii)P2RY10基因，其包含例如SEQ ID NO:52或53所示的全长序列，
(xii)CD226基因，其包含例如SEQ ID NO:54所示的全长序列，
(xiii)MRPL10基因，其包含例如SEQ ID NO:55或56所示的全长序列，
(xiv)ITPRIPL2基因，其包含例如SEQ ID NO:57所示的全长序列，
(xv)CD2基因，其包含例如SEQ ID NO:58所示的全长序列，和
(xvi)NUDT16基因，其包含例如SEQ ID NO:59所示的全长序列，和
在步骤c)中确定所述至少一种靶细胞基因的表达水平以获得患者的表达谱。
特别地，在步骤b)中使所述总RNA与对至少17种靶细胞基因和不多于100种靶细胞基因的组合特异的试剂接触，其中所述试剂至少包括对以下的靶细胞基因特异的试剂：
(i)MRPS6基因，其包含例如SEQ ID NO:31、32或33所示的全长序列，
(ii)SPRY4基因，其包含例如SEQ ID NO:34所示的全长序列，
(iii)NEAT1基因，其包含例如SEQ ID NO:35所示的全长序列，
(iv)CYBB基因，其包含例如SEQ ID NO:36所示的全长序列，
(v)DUSP2基因，其包含例如SEQ ID NO:37所示的全长序列，
(vi)PDEAD基因，其包含例如SEQ ID NO:38或39所示的全长序列，
(vii)SH2D2A基因，其包含例如SEQ ID NO:40、41或42所示的全长序列，
(viii)INSR基因，其包含例如SEQ ID NO:43或44所示的全长序列，
(ix)ITGAM基因，其包含例如SEQ ID NO:45所示的全长序列，
(x)VCAN基因，其包含例如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的全长序列，
(xi)CD163基因，其包含例如SEQ ID NO:50或51所示的全长序列，
(xii)P2RY10基因，其包含例如SEQ ID NO:52或53所示的全长序列，
(xii)CD226基因，其包含例如SEQ ID NO:54所示的全长序列，
(xiii)MRPL10基因，其包含例如SEQ ID NO:55或56所示的全长序列，
(xiv)ITPRIPL2基因，其包含例如SEQ ID NO:57所示的全长序列，
(xv)CD2基因，其包含例如SEQ ID NO:58所示的全长序列，和
(xvi)NUDT16基因，其包含例如SEQ ID NO:59所示的全长序列，和
在步骤c)中确定所述至少17种靶细胞基因的表达水平以获得患者的表达谱。
更确切地，上文描述的方法中，步骤b)中所述的至少一种特异性试剂包括至少一种杂交探针，具体地包括至少一种杂交探针和至少一种引物，而更具体地包括至少一种杂交探针和两种引物。
总RNA包括转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)(例如从靶基因转录和从任何其它基因转录的mRNA)和核糖体RNA。
意在说明，总RNA的提取可通过裂解存在于血液样品中的细胞以释放出患者细胞所包含的核酸的步骤实现。意在举例，可使用如在专利申请WO00/05338(其关于混合磁性和机械裂解)、WO 99/53304(其关于电裂解)、WO99/15321(其关于机械裂解)中描述的裂解方法。本领域技术人员可使用其它公知的裂解方法，例如热休克或渗透休克或使用离液剂例如胍盐的化学裂解(美国专利号5,234,809)。还可能提供额外的步骤，用于从在裂解步骤中释放的其它细胞成分分离核酸。这通常使浓缩核酸成为可能。意在举例，可使用任选地通过吸附或共价作用用寡核苷酸包被的磁性颗粒(在这方面，见美国专利号4,672,040和美国专利号5,750,338)，并由此可通过洗涤步骤纯化结合于这些磁性颗粒的核酸。如果需要随后扩增所述核酸，此核酸纯化步骤是特别有利的。在专利申请WO‑A‑97/45202和WO‑A‑99/35500中描述了这些磁性颗粒特别有利的实施方案。
术语“特异性试剂”是指这样的试剂，当使其与如上述定义的生物学材料接触时，可与对所述靶基因特异的材料相结合。意在说明，当特异性试剂和生物学材料是核来源时，使特异性试剂与生物学材料接触可使特异性试剂与对所述靶基因特异的材料杂交。术语“杂交”是指这样的过程，即在所述过程期间在适当的条件下，两个核苷酸片段以稳定和特异的氢键结合从而形成双链复合物。这些氢键在互补的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))碱基之间(这被称为A‑T键)，或在互补的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)碱基之间(这被称为G‑C键)形成。两个核苷酸片段的杂交可为完全的(称作互补核苷酸片段或序列)，即在此杂交过程中所获得的双链复合物只包含A‑T键和C‑G键。此杂交可为部分的(称作充分互补核苷酸片段或序列)，即所获得的双链复合物既包含使得可能形成双链的A‑T键和C‑G键，也包含没有与互补碱基结合的碱基。两条核苷酸片段之间的杂交取决于所使用的工作条件，特别是严格性。严格性具体定义为两个核苷酸片段的碱基组成的函数并且还由两条核苷酸片段之间的错配程度定义。严格性还取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子浓度和类型、变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。所有这些数据是公知的，并且可由本领域技术人员确定适当的条件。一般来说，根据需要杂交的核苷酸片段的长度，杂交温度为大约20℃至70℃，特别是35℃至65℃，在浓度大约0.5‑1M的盐溶液中。序列，或核苷酸片段，或寡核苷酸，或多核苷酸，是一系列通过磷酸酯键组装在一起的核苷酸基序，特征为含信息的天然核酸序列，其能够与核苷酸片段杂交，所述系列可能含有具有不同结构的单体，并可能从天然核酸分子和/或通过遗传重组和/或通过化学合成获得。基序是单体的衍生物，所述单体可为核酸的天然核苷酸，其构成元件是糖、磷酸基团和含氮碱基；在DNA中，所述糖是脱氧‑2‑核糖，在RNA中，所述糖是核糖；根据是否涉及DNA和RNA，含氮碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；可选地，单体为三种构成元件中的至少一种被修饰的核苷酸；意在举例，修饰可发生在碱基水平(具有修饰的碱基例如肌苷、甲基‑5‑脱氧胞苷、脱氧尿苷、二甲基氨基‑5‑脱氧尿苷、二氨基‑2,6‑嘌呤、溴‑5‑脱氧尿苷或任何其它能够杂交的修饰的碱基)，或发生在糖的水平(例如至少一个脱氧核糖替换为聚酰胺(P.E.Nielsen等人，Science，254，1497‑1500(1991)[3]))，或另外发生在磷酸基团水平(例如替换为酯，具体选自二磷酸酯、烷基磷酸酯和酰基磷酸酯以及硫代磷酸酯)。
根据本发明具体的实施方案，所述特异性试剂包括至少一种杂交探针，或至少一种杂交探针和至少一种对靶基因特异的引物，或至少一种杂交探针和两种对靶基因特异的引物。
为了本发明的目的，术语“扩增引物”指核苷酸片段，其包含5‑100个核苷酸，优选15‑30个核苷酸，其使得酶促聚合例如酶促扩增反应起始。术语“酶促扩增反应”是指通过至少一种酶的作用产生多拷贝核苷酸片段的过程。这样的扩增反应是本领域技术人员公知的，并特别提到下述技术：PCR(聚合酶链式反应)(如在美国专利号4,683,195、美国专利号4,683,202和美国专利号4,800,159中描述)，LCR(连接酶链式反应)(例如在专利申请EP 0201 184中公开)，RCR(修复链式反应)(在专利申请WO 90/01069中描述)，3SR(自主序列复制)(专利申请WO 90/06995)，NASBA(基于核酸序列的扩增)(专利申请WO 91/02818)，TMA(转录介导扩增)(美国专利号5,399,491)和RT‑PCR。
当酶促扩增为PCR时，特异性试剂包括至少两种靶基因特异的扩增引物，其允许扩增靶基因特异的材料。对靶基因特异的材料则优选包含通过反转录来自靶基因的信使RNA获得的互补DNA(称作靶基因特异的cDNA)或通过转录靶基因特异的cDNA获得的互补RNA(称作靶基因特异的cRNA)。当酶促扩增为反转录反应后完成的PCR，称作RT‑PCR。
术语“杂交探针”是指核苷酸片段，其包含至少5个核苷酸，例如5‑100个核苷酸，特别是10‑75个核苷酸，例如15‑35个核苷酸和60‑70个核苷酸，其在给定条件下具有杂交特异性从而与对靶基因特异的材料形成杂交复合物。在本发明中，对靶基因特异的材料可为包含在源自靶基因的信使RNA中的核苷酸序列(称作靶基因特异的mRNA)、包含在通过反转录所述信使RNA获得的互补DNA中的核苷酸序列(称作靶基因特异的cDNA)、或另外为包含在通过转录如上文描述的所述cDNA获得的互补RNA中的核苷酸序列(称作靶基因特异的cRNA)。杂交探针可包含用于其检测的标签。术语“检测”是指直接检测例如计数方法，或间接检测，其通过使用标签的检测方法。存在许多用于检测核酸的检测方法(见，例如，Kricka等人，ClinicalChemistry，1999，no 45(4)，453‑458页，或Keller G.H.等人，DNA Probes，2nd Ed.，Stockton Press，1993，第5和第6部分，173‑249页)。术语“标签”是指能够产生可被检测到的信号的示踪剂。这些示踪剂的非限制性的列表包括酶(其通过例如比色、荧光或发光产生可检测到的信号)，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β‑半乳糖苷酶、葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶；发色团，例如荧光剂、发光剂或染料化合物；电子致密基团，其可通过电子显微镜检测或可通过它们的电子特性例如电导率由安培法或伏安法或通过阻抗测量检测；可通过光学方法如衍射、表面等离子体共振或接触角变化，或通过物理学方法例如原子力光谱，隧道效应等检测的基团；放射性分子，例如32P、35S或125I。
为了本发明的目的，杂交探针可为“检测”探针。在这种情况下，用标签对“检测”探针进行标记。检测探针可具体为如Tyagi和Kramer(Naturebiotech，1996，14：303‑308)所描述的“分子信标”检测探针。这些“分子信标”在杂交期间变成荧光剂。它们具有茎‑环型结构并包含荧光团和“猝灭”基团。特异的环序列与其互补靶核酸序列的结合导致茎展开并在适当的波长激发过程中发出荧光信号。检测探针可具体为根据NanoStringTM的技术的包含“彩色编码的条形码(barecode)”的“报告探针”。
为了检测杂交反应，可使用直接地(具体是通过将标签掺入靶序列)或间接地(具体是使用如上述定义的检测探针)标记的靶序列。特别地，在杂交步骤之前可能进行标记和/或切割靶序列的步骤，例如在酶促扩增反应过程中使用标记的脱氧核糖核苷三磷酸。所述切割具体可通过咪唑或氯化锰的作用完成。还可根据例如在文献WO 91/19812中描述的夹心杂交技术通过与检测探针杂交而在扩增步骤之后标记靶序列。在申请FR 2780059中描述了另一具体的标记核酸的优选方法。
根据本发明优选的实施方案，检测探针包含荧光团和猝灭剂。根据本发明甚至更优选的实施方案，杂交探针在其5'端包含FAM(6‑羧基荧光素)或ROX(6‑羧基‑X‑罗丹明)荧光团并在其3'端包含猝灭剂(Dabsyl)。
杂交探针还可为“捕获”探针。在这种情况下，通过任何适当的方法，即直接地或间接地，例如通过共价或吸附，“捕获”探针被固定或可能被固定在固体基材上。作为固体基材，可使用合成材料或天然材料(任选地为化学修饰的)，具体为多糖例如基于纤维素的材料例如纸，纤维素衍生物例如醋酸纤维素和硝酸纤维素或葡聚糖，聚合物，共聚物(特别是基于苯乙烯型单体的)，天然纤维例如棉花，和合成纤维例如尼龙；无机材料例如二氧化硅、石英、玻璃或陶瓷；乳胶；磁性颗粒；金属衍生物、凝胶等。固体基材可为微量滴定板、膜(如在申请WO‑A‑94/12670中描述的)或颗粒的形式。还可能将若干不同的捕获探针固定在基材上，每种捕获探针对一种靶基因特异。具体地，可使用生物芯片作为基材，其上可固定大量探针。术语“生物芯片”是指小体积的固体基材，大量的捕获探针可在预定的位置连接于其上。生物芯片(或DNA芯片)的概念可追溯到1990年代初期。它基于多学科技术，整合了微电子、核酸化学、图像分析和信息技术。工作原理基于分子生物学的基础：杂交现象，即两条DNA和/或RNA序列通过碱基互补的配对。生物芯片方法基于连接在固体基材上的捕获探针的使用，直接或间接地标记荧光染料的靶核苷酸片段样品作用于所述捕获探针。捕获探针特异地定位于基材或芯片上，并且每个杂交给出与靶核苷酸片段有关的一条具体信息。所获得的信息是累积性的，使例如定量一或多个靶基因的表达水平成为可能。然后为了分析靶基因的表达，可制备包含大量探针的基材，所述探针对应于转录成mRNA的靶基因的全部或部分。为了本发明的目的，术语“低密度基材”是指包含少于50种探针的基材。为了本发明的目的，术语“中密度基材”是指包含从50种探针至10000种探针的基材。为了本发明的目的，术语“高密度基材”是指包含多于10000种探针的基材。
随后将特异于需要分析的靶基因的cDNA或cRNA与例如特异的捕获探针杂交。杂交之后，洗涤基材或芯片，并通过与例如荧光染料型标签结合的高亲和性配体显示标记的cDNA或cRNA/捕获抗体复合物。用例如扫描仪读取荧光并通过信息技术进行荧光分析。意在说明，可提到由Affymetrix公司开发的，用于分子诊断的DNA芯片(“Accessing GeneticInformation with High‑Density DNA arrays”，M.Chee等人，Science，1996，274，610‑614。“Light‑generated oligonucleotide arrays for rapid DNAsequence analysis”，A.Caviani Pease等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，5022‑5026)。在此技术中，捕获探针一般较小，约25个核苷酸。在出版物G.Ramsay，Nature Biotechnology，1998，No.16，40‑44页；F.Ginot，Human Mutation，1997，No.10，1‑10页；J.Cheng等人，Molecular diagnosis，1996，No.1(3)，183‑200页；T.Livache等人，Nucleic Acids Research，1994，No.22(15)，2915‑2921页；J.Cheng等人，Nature Biotechnology，1998，No.16，541‑546页或在美国专利号4,981,783、美国专利号5,700,637、美国专利号5,445,934、美国专利号5,744,305和美国专利号5,807,522中给出了生物芯片其它的实例。固体基材的主要特征应为保持捕获探针对靶核苷酸片段的杂交特征，而同时产生对检测方法最小的背景噪音。探针在基材上的固定可区分为三种主要类型。
首先，存在第一种技术，其在于沉积预先合成的探针。探针的连接通过直接转移完成，其通过微量移液器(micropipette)或微点(microdot)或通过喷墨装置。此技术允许连接大小范围从几个碱基(5‑10)至相对大的60碱基(打印法)至数百碱基(微沉积法)的探针。
打印法是对喷墨打印机使用的方法的改变。其基于以可达到4000滴/秒的速率推进非常小的液球(体积<1nl)。打印法不涉及释放液体的系统与液体沉积于其上的表面之间的任何接触。
微沉积法特征在于将数十至数百碱基的长探针连接到玻璃载片的表面。这些探针通常提取自数据库并为经扩增及经纯化的产物形式。此技术使生产称为微阵列的芯片成为可能，所述芯片在略小于4平方厘米的表面积(称为识别区域)上携带大约一万个DNA点。然而，不应忘记尼龙膜(称为“巨阵列(macroarray)”)的用途，其以最大25点/平方厘米的密度携带直径0.5mm至1mm的扩增(一般通过PCR)后的产物。许多实验室都使用这种非常灵活的技术。在本发明中，生物芯片考虑包括后一种技术。然而，如专利申请WO‑A‑00/71750和FR 00/14896的情况下，可将一定体积的样品沉积在微量滴定板每个孔的底部，或根据另一个专利申请FR 00/14691，可将一定数量彼此分离的液滴沉积于同一个无菌培养皿底部。
第二种用于将探针连接于基材或芯片的技术称作原位合成。此技术导致在芯片表面直接地产生短探针。其基于原位寡核苷酸合成(具体见，专利申请WO 89/10977和WO 90/03382)并且基于寡核苷酸合成仪方法。其在于沿玻璃表面移动反应室，在所述反应室中发生核苷酸延伸反应。
最后，第三种技术称为光蚀刻技术，其为Affymetrix开发的用于生物芯片的方法。其也是原位合成。光蚀刻技术源于微处理器技术。通过连接光不稳定(可被光活化)化学基团来修饰芯片表面。一旦被光照，这些基团能够与寡核苷酸的3'端反应。通过用限定形状的避光罩保护此表面，就可能选择性地光照并因此活化期望连接四种核苷酸之一或其它核苷酸的区域。连续使用不同的避光罩使得可能交替进行保护/反应循环并因此在大约数十平方微米(μm2)的点上生产寡核苷酸探针。此分辨率使得可能在数平方厘米(cm2)的表面积上产生多至数十万个点。光蚀刻技术具有优点：批量平行，它使得可能仅经4乘N个循环产生N聚体芯片。所有这些技术可用于本发明。根据本发明优选的实施方案，如上述定义的步骤b)的至少一种特异性试剂包括至少一种杂交探针，其优选固定于基材上。此基材优选为如上述定义的低、高或中密度基材。
为了提高靶遗传材料的量，可在包含大量探针的基材上的这些杂交步骤之前进行如上述定义的酶促扩增反应步骤。
可通过本领域技术人员已知的任何方案完成步骤c)中靶基因表达水平的确定。总的来说，可通过检测在给定时刻从靶基因转录的mRNA(信使RNA)来分析靶基因的表达。
本发明优选涉及通过根据本领域技术人员公知的任何方案检测源自靶基因的mRNA来确定靶基因的表达水平。根据本发明具体的实施方案，通过检测若干不同的mRNA(每种mRNA源自一个靶基因)，可同时确定若干靶基因的表达水平。
当特异性试剂包括至少一种扩增引物时，可能以下述方式确定靶基因的表达水平：1)从全血提取总RNA(包含转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)和信使RNA(mRNA))之后，进行反转录步骤以获得所述mRNA的互补DNA(或cDNA)。意在说明，可使用能够从RNA片段获得互补DNA片段的反转录酶进行此反转录反应。具体可使用来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)或MMLV(莫罗尼鼠白血病病毒)的反转录酶。当更具体仅需要获得mRNA的cDNA时，在仅包含胸腺嘧啶碱基的核苷酸片段(多聚T)存在的情况下进行此反转录步骤，所述多聚T通过与mRNA的多聚A序列互补而杂交从而形成多聚T‑多聚A复合物，其然后作为通过反转录酶进行的反转录反应的起始位点。然后获得与源自靶基因的mRNA互补的cDNA(靶基因特异的cDNA)和与源自靶基因之外的基因的mRNA互补的cDNA(非靶基因特异的cDNA)。2)使靶基因特异的扩增引物与靶基因特异的cDNA和非靶基因特异的cDNA接触。靶基因特异的扩增引物与靶基因特异的cDNA杂交并且特异性地扩增cDNA(其源自来自靶基因的mRNA)已知长度的预先确定的区域。非靶基因特异的cDNA不被扩增，从而获得大量靶基因特异的cDNA。为了本发明的目的，可无差别地引用“靶基因特异的cDNA”或“源自来自靶基因的mRNA的cDNA”。可具体通过PCR型的扩增反应或通过如上述定义的任何其它扩增技术的方法进行此步骤。对PCR，还可能通过使用若干对不同的扩增引物(每一对引物对一个靶基因特异)同时扩增若干不同的cDNA(每一种cDNA对不同的靶基因特异)：称作多重扩增。3)通过检测并定量在上述步骤2)中获得的靶基因特异的cDNA来确定靶基因的表达。可在靶基因特异的cDNA根据其大小电泳迁移后进行此检测。用于迁移的凝胶和介质可包含溴化乙锭，从而在给定的迁移时间段后，当将凝胶放置在UV(紫外线)台上时，通过发出的光信号直接检测靶基因特异的cDNA。靶基因特异的cDNA的量越大，光信号就越强。这些电泳技术对本领域的技术人员是公知的。还可使用通过进行至饱和的扩增反应获得的定量范围来检测并定量靶基因特异的cDNA。为了考虑在不同的步骤(反转录、PCR等)中可能观察到的酶效率的差异，可通过同时确定“看家”基因(其表达在不同组患者中相似)的表达归一化不同组患者的靶基因的表达。通过获得靶基因表达与看家基因表达的比例，即通过获得靶基因特异的cDNA的量与看家基因特异的cDNA的量的比例，校正不同实验之间的任何变化。本领域技术人员可具体参考下述出版物：Bustin S A，J Mol Endocrinol，2002，29：23‑39；Giulietti A Methods，2001，25：386‑401。
当特异性试剂包含至少一种杂交探针时，可能以下述方式确定靶基因的表达：1)从全血提取总RNA后，如上文描述地完成反转录步骤，从而获得与源自靶基因的mRNA互补的cDNA(靶基因特异的cDNA)和与源自靶基因之外的基因的mRNA互补的cDNA(非靶基因特异的cDNA)。2)使所有的cDNA与基材接触，所述基材上固定有对需要分析其表达的靶基因特异的捕获探针，从而进行靶基因特异的cDNA和捕获探针之间的杂交反应，而非靶基因特异的cDNA不与捕获探针杂交。杂交反应可在包括所有如上述指出的材料的固体基材上完成。根据本发明优选的实施方案，杂交探针固定于基材上。优选地，基材为如上述定义的低、高或中密度基材。由如上述定义的靶基因特异的cDNA的酶促扩增组成的步骤可在杂交反应之前进行，从而获得大量靶基因特异的cDNA并提高靶基因特异的cDNA与对靶基因特异的捕获探针杂交的可能性。也可能在杂交反应之前进行标记和/或切割如上文描述的靶基因特异的cDNA的步骤，例如使用标记的脱氧核糖核苷三磷酸用于扩增反应。所述切割具体可通过咪唑和氯化锰的作用完成。还可在扩增步骤之后标记靶基因特异的cDNA，例如根据在文献WO‑A‑91/19812中描述的夹心杂交技术通过与标记的探针杂交。在申请WO99/65926、WO 01/44507、WO 01/44506、WO 02/090584、WO 02/090319中描述了其它优选的标记和/或切割核酸的具体方法。3)随后进行由检测杂交反应组成的步骤。所述检测可通过使基材(对靶基因特异的捕获探针在其上与靶基因特异的cDNA杂交)与标记的“检测”探针接触，检测由标签发出的信号来进行。当靶基因特异的cDNA事先已用标签标记时，直接检测标签发出的信号。
当在步骤b)中的至少一种特异性试剂包含至少一种杂交探针，也可以下述方式确定靶基因的表达：1)从全血提取总RNA后，如上文描述地完成反转录步骤，从而获得生物学材料的mRNA的cDNA。随后使用T7聚合酶进行cDNA的互补RNA的聚合，所述T7聚合酶在启动子控制下发挥功能并使得可能从DNA模板获得互补RNA。随后获得靶基因特异的mRNA的cDNA的cRNA和非靶基因特异的mRNA的cDNA的cRNA。2)使所有的cRNA与基材接触，所述基材上固定有对需要分析其表达的靶基因特异的捕获探针，从而进行靶基因特异的cRNA和捕获探针之间的杂交反应，而非靶基因特异的cRNA不与捕获探针杂交。当需要同时分析若干靶基因的表达时，可在基材上固定若干不同的捕获探针，每一种探针对一个靶基因特异。也可能在杂交反应之前进行标记和/或切割如上文描述的靶基因特异的cRNA的步骤。3)随后进行由检测杂交反应组成的步骤。检测可通过使基材(对靶基因特异的捕获探针在其上与靶基因特异的cRNA杂交)与标记有标签的“检测”探针接触，并检测由标签发出的信号来完成。当靶基因特异的cRNA事先已用标签标记时，直接检测标签发出的信号。当使用其上杂交有大量探针的生物芯片类基材时，使用cRNA是特别有利的。
本发明还包括试剂盒，其用于在来自患者的外周血样品中预后结肠直肠癌，所述试剂盒包括至少一种对至少一种NK细胞基因特异的试剂和不多于25种对25种NK细胞基因特异的试剂，所述NK细胞基因至少包括SEQ ID NO:1‑13所示的核酸序列，其中所述至少一种试剂对至少一种选自以下的NK细胞基因特异：
(i)KLRB1基因，其包含例如SEQ ID NO:1所示的全长序列，
(ii)KLRC2基因，其包含例如SEQ ID NO:2、3或4所示的全长序列，
(iii)KLRC3基因，其包含例如SEQ ID NO:5、6或7所示的全长序列，
(iv)KLRD1基因，其包含例如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示的全长序列，和
(v)KLRK1基因，其包含例如SEQ ID NO:13所示的全长序列。
在一个实施方案中，试剂盒包括对以下NK细胞基因特异的试剂的组合：
(i)KLRB1基因，其包含例如SEQ ID NO:1所示的全长序列，
(ii)KLRC2基因，其包含例如SEQ ID NO:2、3或4所示的全长序列，
(iii)KLRC3基因，其包含例如SEQ ID NO:5、6或7所示的全长序列，
(iv)KLRD1基因，其包含例如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示的全长序列，和
(v)KLRK1基因，其包含例如SEQ ID NO:13所示的全长序列。
在这样的实施方案中，特异性试剂可靶向若干NK细胞基因但不多于25个NK基因的组合。
另外，试剂盒可包括对至少一种靶细胞基因和不多于5种靶细胞基因特异的至少一种试剂，所述至少一种靶细胞基因选自：
(i)GZMB基因，其包含例如SEQ ID NO:14、15、16或17所示的全长序列，
(ii)CD247基因，其包含例如SEQ ID NO:18、19或20所示的全长序列，
(iii)RRAS2基因，其包含例如SEQ ID NO:21或22所示的全长序列，和
(iv)SH2D1B基因，其包含例如SEQ ID NO:23或24所示的全长序列，和
(v)LCK基因，其包含例如SEQ ID NO:25、26、27、28、29或30所示的全长序列。
具体地，其包括对以下靶细胞基因特异的5种试剂：
(i)GZMB基因，其包含例如SEQ ID NO:14、15、16或17所示的全长序列，
(ii)CD247基因，其包含例如SEQ ID NO:18、19或20所示的全长序列，
(iii)RRAS2基因，其包含例如SEQ ID NO:21或22所示的全长序列，和
(iv)SH2D1B基因，其包含例如SEQ ID NO:23或24所示的全长序列，和
(v)LCK基因，其包含例如SEQ ID NO:25、26、27、28、29或30所示的全长序列。
在这样的实施方案中，特异性试剂可靶向例如上文描述的若干靶细胞基因但不多于5种靶细胞基因的组合。
在另一个实施方案中，例如上述定义的试剂盒可包括至少一种对至少一种靶细胞基因特异的试剂和至多100种对100种靶细胞基因特异的试剂，所述至少一种靶细胞基因选自：
(i)MRPS6基因，其包含例如SEQ ID NO:31、32或33所示的全长序列，
(ii)SPRY4基因，其包含例如SEQ ID NO:34所示的全长序列，
(iii)NEAT1基因，其包含例如SEQ ID NO:35所示的全长序列，
(iv)CYBB基因，其包含例如SEQ ID NO:36所示的全长序列，
(v)DUSP2基因，其包含例如SEQ ID NO:37所示的全长序列，
(vi)PDEAD基因，其包含例如SEQ ID NO:38或39所示的全长序列，
(vii)SH2D2A基因，其包含例如SEQ ID NO:40、41或42所示的全长序列，
(viii)INSR基因，其包含例如SEQ ID NO:43或44所示的全长序列，
(ix)ITGAM基因，其包含例如SEQ ID NO:45所示的全长序列，
(x)VCAN基因，其包含例如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的全长序列，
(xi)CD163基因，其包含例如SEQ ID NO:50或51所示的全长序列，
(xii)P2RY10基因，其包含例如SEQ ID NO:52或53所示的全长序列，
(xii)CD226基因，其包含例如SEQ ID NO:54所示的全长序列，
(xiii)MRPL10基因，其包含例如SEQ ID NO:55或56所示的全长序列，
(xiv)ITPRIPL2基因，其包含例如SEQ ID NO:57所示的全长序列，
(xv)CD2基因，其包含例如SEQ ID NO:58所示的全长序列，和
(xvi)NUDT16基因，其包含例如SEQ ID NO:59所示的全长序列。
并且具体地，其包括对以下17种靶细胞基因特异的17种试剂：
(i)MRPS6基因，其包含例如SEQ ID NO:31、32或33所示的全长序列，
(ii)SPRY4基因，其包含例如SEQ ID NO:34所示的全长序列，
(iii)NEAT1基因，其包含例如SEQ ID NO:35所示的全长序列，
(iv)CYBB基因，其包含例如SEQ ID NO:36所示的全长序列，
(v)DUSP2基因，其包含例如SEQ ID NO:37所示的全长序列，
(vi)PDEAD基因，其包含例如SEQ ID NO:38或39所示的全长序列，
(vii)SH2D2A基因，其包含例如SEQ ID NO:40、41或42所示的全长序列，
(viii)INSR基因，其包含例如SEQ ID NO:43或44所示的全长序列，
(ix)ITGAM基因，其包含例如SEQ ID NO:45所示的全长序列，
(x)VCAN基因，其包含例如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的全长序列，
(xi)CD163基因，其包含例如SEQ ID NO:50或51所示的全长序列，
(xii)P2RY10基因，其包含例如SEQ ID NO:52或53所示的全长序列，
(xii)CD226基因，其包含例如SEQ ID NO:54所示的全长序列，
(xiii)MRPL10基因，其包含例如SEQ ID NO:55或56所示的全长序列，
(xiv)ITPRIPL2基因，其包含例如SEQ ID NO:57所示的全长序列，
(xv)CD2基因，其包含例如SEQ ID NO:58所示的全长序列，和
(xvi)NUDT16基因，其包含例如SEQ ID NO:59所示的全长序列。
在这样的实施方案中，特异性试剂可靶向例如上文描述的若干靶细胞基因但不多于100种靶细胞基因的组合。
如上文所解释，所述至少一种特异性的试剂包括至少一种杂交探针，具体包括至少一种杂交探针和至少一种引物，而更具体包括至少一种杂交探针和两种引物。
最后，本发明涉及至少一种对至少一种NK细胞基因特异的试剂和不多于25种对25种NK细胞基因特异的试剂在制备组合物中的用途，所述组合物用于在来自患者的生物学样品中预后结肠直肠癌，所述NK细胞基因包含SEQ ID NO:1‑12所示的核酸序列，其中所述至少一种试剂对包含选自SEQ ID NO:1‑12任一所示的核酸序列的至少一种NK细胞基因是特异的；
特别是对至少5种NK细胞基因和不多于25种NK细胞基因的组合特异的试剂在制备组合物中的用途，所述组合物用于在来自患者的生物学样品中预后结肠直肠癌，其中所述试剂对包含分别选自SEQ ID NO:1、2‑4、5‑7和8‑12所示的核酸序列的至少5种NK细胞基因是特异的；
特别是对10种靶细胞基因的组合特异的试剂在制备组合物中的用途，所述组合物用于在来自患者的生物学样品中预后结肠直肠癌，其中所述试剂对包含分别选自SEQ ID NO:1、2‑4、5‑7、8‑12、13、14‑17、18‑20、21‑22、23‑24和25‑30所述的核酸序列的靶细胞基因是特异的；和
更特别的是对10种靶细胞基因和不多于100种靶基因的组合特异的试剂在制备组合物中的用途，所述组合物用于在来自患者的生物学样品中预后结肠直肠癌，其中所述试剂对包含分别选自SEQ ID NO:1、2‑4、5‑7、8‑12、13、14‑17、18‑20、21‑22、23‑24、25‑30、31‑33、34、35、36、37、38‑39、4‑42、43‑44、45、46‑49、50‑51、52‑53、54、55‑56、57、58和59所示的核酸序列的靶细胞基因是特异的；
其中，所述至少一种特异性的试剂包括至少一种杂交探针、至少一种杂交探针和至少一种引物或至少一种杂交探针和两种引物。
附图概述
在结肠镜检阴性对照(CNC)和结肠直肠癌(CRC)患者的血液样品中的NK细胞得分，以及CRC样品根据癌症阶段的分布。圆形代表CNC；方框，正三角，倒三角和菱形分别代表I期、II期、III期和IV期CRC。
实施例
I)材料与方法
1.患者和样品收集
本研究已获当地临床研究伦理委员会批准。已获得所有参与者的书面知情同意书。
对CRC组，于2006年7月和2008年3月间在中国复旦大学肿瘤医院(FUCH)结肠直肠外科为本研究连续招募了119个结肠直肠癌患者。根据国际抗癌联合会(UICC)推荐的肿瘤‑淋巴结‑转移系统对肿瘤分期。没有患者接受术前放疗或化疗。本研究排除了患有遗传性结肠直肠癌或炎症性肠道疾病(克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)的患者。对每个患者，在结肠镜检至少一周后，手术前，将2.5ml外周血收集入PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon，CH)中，并根据制造商说明书处理。对对照组，从上海地区的社区医院登记101个已通过结肠镜检证实不携带任何息肉或结肠直肠癌症状的FOBT测试阳性参与者。在结肠镜检检查之前一周将外周血样品收集入PAXgene管中。本研究包括的所有参与者的详细特征在表1中给出。
表1：患者特征
2.RNA提取和微阵列实验
遵循制造商说明书用PAXgeneTM血液RNA系统(PreAnalytix)提取总RNA。通过分光光度计在260纳米的光密度测量总RNA的量，在BioAnalyzer Agilent 2100(Agilent Technologies，PaloAlto，CA，U.S.A.)上使用RNA 6000Nano试剂盒评估质量。只分析拥有7至10的RNA完整性数值的样品。然后将50纳克总RNA反转录并根据制造商标准方案使用Ribo‑SPIATM技术(NuGEN Technologies Inc.，San Carlos，CA，U.S.A.)的WT‑OvationTM RNA扩增系统线性扩增为单链cDNA，并用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)纯化产物。随后用RQ1无RNA酶的DNA酶(Promega Corp.，Fitchburg，WI，U.S.A.)片段化2毫克扩增和纯化后的cDNA，并用生物素化的脱氧核苷三磷酸通过末端转移酶(Roche Diagnostics Corp.，Indianapoli，IN，U.S.A.)和DNA标记试剂(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA，U.S.A)标记。在杂交炉640(AgilentTechnologies)中50℃18分钟，每分钟60转将标记的cDNA杂交至HG U133Plus 2.0Array(Affymetrix)上。HG U133Plus 2.0Array包含54,675个探针集，其代表了大约39,000个最好地表征的人基因。杂交后，根据Affymetrix方案EukGE‑WS2v4使用Fluidics Station 450(Affymetrix)洗涤微阵列并染色。用Scanner 3000(Affymetrix)扫描微阵列。
3.微阵列数据分析
根据标准的Affymetrix质量控制参数建议完成质量控制分析。基于评估标准，我们所有的实验都达到了最低质量要求。通过RMA(鲁棒多芯片平均)用背景校正、分位数归一化和中位数平滑归纳预处理Affymetrix表达微阵列[1]。将具有极端信号强度(低于50或高于2×1014)的探针集滤掉。为了减少批次效应的可能性，对过滤后的表达数据应用归一化算法CamBat11。CamBat方法(http://statistics.byu.edu/johnson/ComBat/)应用参数或非参数经验贝氏框架在给定数据集中调节批次效应。通过微阵列显著性分析(SAM)在错误发现率(FDR)等于0.05下确定差异表达基因(DEG)12。使用具有Bioconductor库的R环境执行预处理和统计学步骤。使用Ingenuity Pathway Analysis软件8.5版本(Ingenuity Systems，Redwood City，CA，U.S.A)进行基因本体(Gene Ontology)和经典途径(Canonical Pathway)分析。
II)结果
1.结肠直肠癌和对照患者群的特征
119个结肠直肠癌(CRC)患者和101个结肠镜检阴性对照(CNC)的临床和人口学变量概述于表1。对CRC，由病理学家在结肠镜检后确认结肠直肠癌的诊断。从在社区医院登记的FOBT阳性患者中选择对照，他们在复旦大学肿瘤医院(FUCH)进行的结肠镜检最终为阴性。在CRC和CNC组之间很好地平衡了年龄和性别。
2.外周血中的表达在结肠直肠癌患者和结肠镜检阴性对照中不同的基因的鉴定
发明人在119个CRC和101个CNC中寻找在两组之间具最高差异的差异表达基因(DEG)，将CRC组(I、II、III和IV期)作为整体考虑。在适当的预处理后，保留了20169个探针集进行DEG分析。在FDR等于0.05，倍数变化(FC)大于1.2，使用SAM鉴定了327个DEG。
在这327个DEG中，分别发现195个(59.6%)和132个(40.36%)在CRC样品中以更高和更低水平表达。T检验的P值范围从1.43×10‑25到1.51×10‑01，18个DEG具有小于6.27×10‑15的T检验P值并且都对应着很好注释的基因：MRPS6、SPRY4、NEAT1、CYBB、DUSP2、PDE4D、SH2D2A、G(1‑2)NSR、ITGAM、VCAN、CD163、P2RY10、CD226、MRPL10、ITPRIPL2、CD2和NUDT16(表2)。最高的倍数变化(FC)值为1.83(CRC中具更高水平的NEAT1)和1.71(CRC中具更低水平的HBG2)，而327个DEG中的26个(8%)具有高于1.40的FC值。
例如，对SPRY4(CRC中更高表达水平排名第一，T检验P值4.04×10‑23，FC 1.79)和MRPS6(CRC中更低表达水平排名第一，T检验P值1.43×10‑25，FC 1.27)观察到的结果。这样的实例代表了在CRC和CNC患者之间显著差异表达的基因。对SPRY4，101个CNC观察到了非常类似的杂交信号值，而CRC的值更多样但与CNC相比具有显著(p值4.04×10‑23)提高的平均值(FC 1.78)。对MRPS6，两个群体都显示了相似的分散性，CRC具显著(p值1.43×10‑25)降低的平均值(FC 1.27)。
在前18个DEG中，观察到4个膜白细胞标记物，显示与CNC相比在CRC患者的外周血中不同的表达水平：更低水平的CD2和CD226，其分别由T细胞和主要由NK细胞表达；更高水平的CD163和CD11B(ITGAM)，其分别主要由单核细胞和许多涉及先天性免疫系统的白细胞表达。同样有趣的是在细胞毒性T淋巴细胞和天然杀伤(NK)细胞中由GZMB基因编码的颗粒酶B，在CRC样品中的更低表达。其它的基因像INSR、SPRY4、DUSP2、PDE4D和ITPRIPL2被报告为不同的信号通路的一部分，SH2D2A被报告为T细胞特异的。已报告VCAN在单核细胞中表达，并且其在CRC样品中更高的表达水平和CD163和ITGAM一起会与这些患者与CNC相比在外周血中的循环单核细胞的某种活化相关。
已通过使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)对327个DEG进行分析，其返回321个定位的ID，其适合于解释相关的生物学功能(Bio Fuctions)和经典途径。对于生理学系统发育和功能(Physiological SystemDevelopmentand Function)，观察到免疫细胞运输(Immune Cell Trafficking)具高分(p值从1.44×10‑12至1.57×10‑02，包括50种分子)，其涵盖了多种免疫细胞的活化、迁移、积累、内流、趋化性、细胞扩散、细胞运动、化学诱导(chemoattraction)、预激(priming)和粘附。对于经典途径有趣的是，天然杀伤细胞信号转导(Natural Killer Cell Signaling)是具有最低P值(2.55×10‑05)的一项，其包括10个基因：CD247、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRD1、KLRK1、LCK、PRKCH、RRAS2和SH2D1D。5个NK细胞特异的膜受体(KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRD1、KLRK1)的涉及非常强烈地表明在CRC患者的外周血中在基因表达水平的特定的NK细胞组分差异。在CRC中所有的NK细胞基因表达降低。结果概述于下述的表2和3中。
表2：在结肠直肠癌(CRC)和结肠镜检阴性的对照(CNC)患者样品之间差异表达的前18个基因(DEG)；基因描述，T检验P值和倍数变化相关的信息
*来自NetAffxTM和来自Ingenuity Pathway 8.5版的基因描述
表3：NK细胞得分：选择的基因，T检验P值和倍数变化相关信息
*来自NetAffxTM和来自Ingenuity Pathway 8.5版的基因描述
对这10个NK细胞相关的基因，观察到在CRC组中更低表达水平，提示循环NK细胞数目降低，或这样的细胞向其它器官/组织区室尤其是肿瘤位置外流。观察到更低水平的GZMB表达也是值得注意的，代表在CRC患者中发生在细胞毒性水平的主要事件。
排名最前的经典途径涉及T细胞受体信号传导(T Cell ReceptorSignaling)、先天性和适应性免疫细胞之间的联系(Communication betweenInnate and Adaptive Immune Cells)和T辅助细胞中的iCOS‑iCOSL信号传导(iCOS‑iCOSL Signaling in T Helper Cells)，其分别具有9.08×10‑05、2.85×10‑04和5.78×10‑04的P值。
有趣的是，对119个CRC患者的样品中的51个，观察到低于前四分之一的低NK细胞得分，而在101个CNC患者样品中仅4个。使用这样直接的截断值，这种判别的性能可表达为43%的灵敏度和96%的特异性。另外，当根据肿瘤TNM期(I期、II期、III期或IV期)区分CRC患者时，我们观察到该NK细胞得分在CRC患者中从I期到IV期逐渐降低(图1)。主要在CNC和II期、III期与IV期CRC之间，和在I期CRC与II‑III和IV期CRC之间观察到统计学显著的差异。
这项研究显示了转录组发现外周血中生物学标记物的潜力，并对结肠直肠癌中的免疫应答提供了新的了解。除了对现有筛选模式准备可能的替代/互补之外，这些结果还显示了对例如与NK细胞相关的基因的表达分析使得可以区分患有结肠直肠癌的患者，从而开启了个性化医疗的大门。
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