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1、(10)申请公布号 CN 102851381 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102851381 A *CN102851381A* (21)申请号 201210355508.4 (22)申请日 2012.09.21 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 武汉真福医药科技发展有限公司 地址 430075 湖北省武汉市东湖开发区高新 大道 666 号光谷生物城创新园区 D1 栋 C 区 (72)发明人 王业富 郑虎 卢晅 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 汪俊锋 (。
2、54) 发明名称 快速检测单增李斯特菌的 LAMP 试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种快速检测工业食品中单增 李斯特菌的 LAMP 试剂盒， 由 LAMP 反应液、 标准阳 性模板、 阴性质控标准品组成 ； LAMP 反应液含有 Bst DNA 聚合酶大片段、 引物、 LAMP10buffer、 dNTPs 溶液、 MgSO4溶液和甜菜碱。引物分为正向 引物和反向引物。本发明具有特异性好， 灵敏度 高， 快速简便， 可重复性高以及肉眼可判断结果等 优点， 可对工业食品中单增李斯特菌进行快速定 性检测， 可替代一直沿用的传统的培养法和血清 学诊断方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 。
3、2 页 说明书 7 页 序列表 6 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 6 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 一种快速检测单增李斯特菌的 LAMP 试剂盒， 其特征在于 , 试剂盒包括 ： a)LAMP 反应液， b) 标准阳性模板， c) 阴性质控标准品 ； 所述 LAMP 反应液含有引物， 引物为以下 5 组特异性引物中的任意一组 : （1） 上游外引物 F3 ： 5 -TGTTACTAAAGAGCAGTTGC-3 ； 下游外引物 B3 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ； 上游。
4、内引物 FIP ： 5 TAAACTTGACGGCCATACGCCGCTTGGAGTGAATGCAGAA-3 ； 下游内引物 BIP ： 5 - CTGCTTTTGATGCTGCCGTATATTTGTTAGTTCTACATCACCTGA-3 ； （2） 上游外引物 F3 ： 5 -GAACCTACAAGACCTTCCA-3 ； 下游外引物 B3 ： 5 -AGATTTTCCGCTTACGGC-3 ； 上游内引物 FIP ： 5 GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGT-3 ； 下游内引物 BIP ： 5 - TCCTGCATATATCTCAAGTG。
5、TGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT-3 ； （3） 上游外引物 F3 ： 5 -GAACCTACAAGACCTTCCA-3 ； 下游外引物 B3 ： 5 -AGATTTTCCGCTTACGGC-3 ； 上游内引物 FIP ： 5 - GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGTT-3 ； 下游内引物 BIP ： 5 - TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT-3 ； （4） 上游外引物 F3 ： 5 -GCTGTTACTAAAGAGCAGTTG-3 ； 下游外引物 B3。
6、 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ； 上游内引物 FIP ： 5 GCCATACGCCACACTTGAGACAAGCGCTTGGAGTGAAT-3 ； 下游内引物 BIP ： 5 - AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC-3 ； （5） 上游外引物 F3 ： 5 -TGTTACTAAAGAGCAGTTGC-3 ； 下游外引物 B3 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ； 上游内引物 FIP ： 5 -TAAACTTGACGGCCATACGCCGGAGTGAATGCAGAAAATCCT-3 ； 下游。
7、内引物 BIP ： 5 - AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC-3。 2. 根据权利要求 1 所述的 LAMP 试剂盒， 其特征是， 所述 LAMP 反应液是由 Bst DNA 聚 合酶大片段、 LAMP 10buffer、 10mol/L 的外引物、 10mol/L 的内引物、 5mol/L 甜菜碱、 50mmol/L MgSO4和 10mmol/L dNTPs 组成。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的 LAMP 试剂盒。其特征是标准阳性模板是含有单增李斯 特菌高度保守基因 hlyA 基因 356 个碱基对的核苷酸片段构成的 。
8、pMD18-T-hlyA 载体， hlyA 基因的核苷酸序列为 SEQ ID No.21 所示。 4. 使用权利要求 1 3 所述的 LAMP 试剂盒检测单增李斯特菌的方法， 其特征在于， 包 括以下步骤 ： 用缓冲蛋白胨水按照国标法培养待检样品 1-4h ； 用水煮法从待测样品中提取 DNA ； 权 利 要 求 书 CN 102851381 A 2 2/2 页 3 将 DNA 加入到 LAMP 试剂盒的反应体系中， 65保温 1h ； 反应结束后， 离心， 肉眼观察沉淀， 对样品进行定性分析。 权 利 要 求 书 CN 102851381 A 3 1/7 页 4 快速检测单增李斯特菌的 LA。
9、MP 试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种快速检测单增李斯特菌的 LAMP 试剂盒 , 属于食品检测领域。 背景技术 0002 单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种人畜共患病的病原菌， 它广泛存 在于自然界中。 该菌在4的环境中仍可生长繁殖， 是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌 之一。 食品中存在的单增李斯特菌威胁着人类的健康， 感染后主要表现为败血症、 脑膜炎和 单核细胞增多。因此， 在食品卫生微生物检验中， 必须加以重视。 0003 近 年 来 发 展 起 来 的 环 介 导 等 温 扩 增 (loop-mediated isothermal ampli。
10、fication,LAMP) 技术以其灵敏度高、 速度快、 特异性强等优点在基因定性检测方面得 到广泛应用， 并且已经成为当前病毒核酸定性检测的重要方法之一。 0004 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种 新型等温核酸扩增方法 , 该法针对靶基因的 6 个区域设计 4 条特异引物 , 利用一种具有链 置换活性的 DNA 聚合酶 (Bst DNA 聚合酶 ), 在恒温条件 (65左右 ) 保温约 60min, 即可 完成核酸扩增反应 , 产生肉眼可见的反应副产物 - 白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要 PCR 仪、 。
11、扩增产物不需要开盖， 用肉眼即可判断结果及反应时间短， 特异性强， 灵敏度高等优 点。 0005 传统检测单增李斯特菌的方法 , 需要分离、 筛选和生化鉴定 , 必要时还需要血清 学鉴定 , 一般为 4 6d, 费时费力， 具有灵敏度低、 特异性差、 假阳性、 耗时费力等缺点。各 种常规 PCR 方法具有敏感性强、 特异性高、 简便、 快速等优点 , 有较多应用于单增李斯特菌 检测的报道， 但由于存在 PCR 后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设 备而限制了其在基层单位的应用。 因此焏待开发精确、 灵敏、 快速、 无污染的临床检验方法。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术。
12、问题是针对现有技术存在的不足， 提供一种快速检测单增 李斯特菌的 LAMP 试剂盒及其使用方法。 0007 本发明提供一种快速检测单增李斯特菌的 LAMP 试剂盒， 试剂盒包括 ： a)LAMP 反应 液， b) 标准阳性模板， c) 阴性质控标准品 ； 0008 LAMP 反应液含有引物， 引物为以下 5 组特异性引物中的任意一组 : 0009 （1） 上游外引物 F3 ： 5 -TGTTACTAAAGAGCAGTTGC-3 ；（SEQ ID No.1） 0010 下游外引物 B3 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ；（SEQ ID No.2） 0011 上游内引物FIP。
13、 ： 5TAAACTTGACGGCCATACGCCGCTTGGAGTGAATGCAGAA-3；（SEQ ID No.3） 0012 下游内引物 BIP ： 5 - 0013 CTGCTTTTGATGCTGCCGTATATTTGTTAGTTCTACATCACCTGA-3 ；（SEQ ID No.4） 0014 （2） 上游外引物 F3 ： 5 -GAACCTACAAGACCTTCCA-3 ；（SEQ ID No.5） 说 明 书 CN 102851381 A 4 2/7 页 5 0015 下游外引物 B3 ： 5 -AGATTTTCCGCTTACGGC-3 ；（SEQ ID No.6） 0016。
14、 上 游 内 引 物 FIP ： 5 GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGT-3 ； （SEQ ID No.7） 0017 下游内引物 BIP ： 5 - 0018 TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT-3 ；（SEQ IDNo.8） 0019 （3） 上游外引物 F3 ： 5 -GAACCTACAAGACCTTCCA-3 ；（SEQ ID No.9） 0020 下游外引物 B3 ： 5 -AGATTTTCCGCTTACGGC-3 ；（SEQ ID No.10） 0021 上游内引物 。
15、FIP ： 5 - 0022 GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGTT-3 ；（SEQ ID No.11） 0023 下游内引物 BIP ： 5 - 0024 TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT-3 ；（SEQ IDNo.12） 0025 （4） 上游外引物 F3 ： 5 -GCTGTTACTAAAGAGCAGTTG-3 ；（SEQ ID No.13） 0026 下游外引物 B3 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ；（SEQ ID No.14） 0027 上游内引。
16、物F I P ： 5GCCATACGCCACACTTGAGACAAGCGCTTGGAGTGAAT-3；（SEQ ID No.15） 0028 下游内引物 BIP ： 5 - 0029 AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC-3 ；（SEQ ID No.16） 0030 （5） 上游外引物 F3 ： 5 -TGTTACTAAAGAGCAGTTGC-3 ；（SEQ ID No.17） 0031 下游外引物 B3 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ；（SEQ ID No.18） 0032 上 游 内 引 物 FIP ： 5 。
17、-TAAACTTGACGGCCATACGCCGGAGTGAATGCAGAAAATCCT-3 ； （SEQ ID No.19） 0033 下游内引物 BIP ： 5 - 0034 AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC-3。 （SEQ ID No.20） 0035 具体地说， 0036 a） LAMP 反应液 0037 LAMP 反应液是由 Bst DNA 聚合酶大片段、 LAMP 10buffer、 10mol/L 的外 引 物 和 内 引 物、 5mol/L 甜 菜 碱、 50mmol/L MgSO4和 10mmol/L dNTPs 组。
18、 成。 在 本 发 明 的一个具体方案中， LAMP 反应液由 LAMP 10buffer 2.5l， 10mol/L 内引物 FIP、 BIP 各 2.0l， 10mol/L 外 引 物 F3、 B3 各 1.0l， 10mmol/L dNTPs3.0l,50mmol/L MgSO43.0l,5.0mol/L 甜菜碱 4.5l， Bst DNA 聚合酶大片段 1.0l 组成， 反应液总体积 20l。 0038 b） 标准阳性模板 0039 标准阳性模板是含有单增李斯特菌高度保守基因 hlyA 基因 356 个碱基对的核苷 酸片段构成的 pMD18-T-hlyA 载体， 该载体可在大肠杆菌 D。
19、H5 中增殖。 0040 hlyA 基因的核苷酸序列为 ： 0041 5 -TAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCG CTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATC AACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTA GAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTA。
20、ATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAA 说 明 书 CN 102851381 A 5 3/7 页 6 TCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGCGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAG-3 。 （SEQ ID No.21） 0042 实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒 pMD18-T-hlyA， 该质粒转化大肠杆 菌 DH5 增殖后用碱裂解法提取， 经 DNA 纯化试剂盒纯化， -20保存。 0043 c) 阴性质控标准品 0044 阴性质控标准品为无菌双蒸水。 0045 本试剂盒的工作原理 ： 0046 使用本发。
21、明提供的快速可视化检测单增李斯特菌 LAMP 试剂盒， 在恒温条件下 (65左右 ) 保温约 60min, 即可完成核酸扩增反应， 并伴随产生肉眼可见的反应副产 物 - 白色焦磷酸镁沉淀。反应结束后， 12000r/min 离心 30s， 即可用肉眼观察管底白色沉 淀。在本发明提供的快速检测单增李斯特菌 LAMP 试剂盒中， 针对单增李斯特菌检测中的特 殊性， 对不同的靶片段进行反应体系， 如引物、 dNTPs、 Mg2+浓度、 甜菜碱等的优化， 通过优化 方案， 反复实验， 建立了检测单增李斯特菌的环介导等温扩增方法， 并研制出检测单增李斯 特菌的LAMP试剂盒， 该试剂盒的灵敏度可在每个反。
22、应体系中检出10拷贝， 可以满足快速检 测单增李斯特菌的要求。 0047 本发明还提供前述的 LAMP 试剂盒检测单增李斯特菌的方法， 包括以下步骤 ： 0048 用缓冲蛋白胨水 （BPW） 按照国标法培养待检样品 1-4h ； 0049 用水煮法从待测样品中提取 DNA ； 0050 将 DNA 加入到 LAMP 试剂盒的反应体系中， 65保温 1h ； 0051 反应结束后， 离心， 肉眼观察沉淀， 即可对样品进行定性分析。 0052 本发明中提供的快速检测单增李斯特菌的 LAMP 试剂盒可对单增李斯特菌进行定 性检测， 替代一直沿用的传统的培养法和血清法检测方法。与现有技术相比具有以下优。
23、点 和效果 ： 0053 1、 与传统培养法相比， 检测速度快， 仅 1h， 加上样品 DNA 的提取制备， 总共不超过 5h。 0054 2、 特异性好， 灵敏度高 ； 0055 3、 步骤简单， 可重复性高 ； 0056 4、 可同时进行多个样品检测。 附图说明 0057 图 1 为实施例 1 中单增李斯特菌离心后观察白色沉淀结果， 图中 ： 0058 1标准阳性模板， 2阴性对照， 3单增李斯特菌阴性样本， 4单增李斯特菌阴 性样本， 5单增李斯特菌阴性样本， 6单增李斯特菌阳性样本， 7单增李斯特菌阳性样 本， 8单增李斯特菌阳性样本。 0059 图 2 为实施例 1 中单增李斯特菌 。
24、1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测结果图， 图中 ： 0060 M-DNA Marker， 1- 标准阳性模板， 2- 阴性对照， 3- 单增李斯特菌阳性样本， 4单 增李斯特菌阳性样本， 5单增李斯特菌阳性样本， 6单增李斯特菌阴性样本， 7单增李 斯特菌阴性样本， 8单增李斯特菌阴性样本。 0061 图 3 为实施例 2 中单增李斯特菌离心后观察白色沉淀结果， 图中 ： 说 明 书 CN 102851381 A 6 4/7 页 7 0062 1标准阳性模板， 2阴性对照， 3单增李斯特菌阴性样本， 4单增李斯特菌阴 性样本， 5单增李斯特菌阴性样本， 6单增李斯特菌阳性样本， 7单增李斯特菌阳性。
25、样 本， 8单增李斯特菌阳性样本。 0063 图 4 为实施例 3 中单增李斯特菌离心后观察白色沉淀结果， 图中 ： 0064 1标准阳性模板， 2阴性对照， 3单增李斯特菌阴性样本， 4单增李斯特菌阴 性样本， 5单增李斯特菌阴性样本， 6单增李斯特菌阳性样本， 7单增李斯特菌阳性样 本， 8单增李斯特菌阳性样本。 0065 图 5 为实施例 4 中单增李斯特菌离心后观察白色沉淀结果， 图中 ： 0066 1标准阳性模板， 2阴性对照， 3单增李斯特菌阴性样本， 4单增李斯特菌阴 性样本， 5单增李斯特菌阴性样本， 6单增李斯特菌阳性样本， 7单增李斯特菌阳性样 本， 8单增李斯特菌阳性样本。
26、 ； 0067 图 6 为实施例 5 中单增李斯特菌离心后观察白色沉淀结果， 图中 ： 0068 1标准阳性模板， 2阴性对照， 3单增李斯特菌阴性样本， 4单增李斯特菌阴 性样本， 5单增李斯特菌阴性样本， 6单增李斯特菌阳性样本， 7单增李斯特菌阳性样 本， 8单增李斯特菌阳性样本。 0069 图 7 为实施例 6 中单增李斯特菌 LAMP 试剂盒特异性实验观察白色沉淀结果， 图 中 ： 0070 1标准阳性模板， 2阴性对照， 3单核细胞增生李斯特氏菌样本， 4绵羊李斯 特氏菌样本， 5痢疾志贺氏菌样本， 6甲型副伤寒沙门氏菌样本， 7金黄色葡萄球菌样 本， 8大肠杆菌样本。 0071 。
27、图 8 为实施例 7 中单增李斯特菌 LAMP 试剂盒灵敏度实验观察白色沉淀结果， 图 中 ： 0072 1稀释10-1倍， 2稀释10-2倍， 3稀释10-3倍， 4稀释10-4倍， 5稀释10-5倍， 6稀释 10-6倍， 7稀释 10-7倍， 8稀释 10-8倍， 9稀释 10-9倍， 10稀释 10-10倍。 具体实施方式 0073 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应当理解， 这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明要求保护的范围， 下列实施例中未注明的具体实验条件和方法， 按照常规条件如 ： J. 萨姆布鲁克等主编， 科学出版社， 1992， 分子克隆实验指南 （第二版。
28、） ； D.L. 斯佩克特等， 科学出版社， 2001， 细胞实验指南 ； 吕鸿声， 科学出版社， 1982， 或接照制 造厂商所建议的条件。 0074 实施例 1 ： 0075 1快速检测单增李斯特菌 LAMP 试剂盒组成与配制 0076 a） LAMP 反应混合液 0077 LAMP 反 应 混 合 液 由 LAMP 10buffer 2.5l， 10mol/L 内 引 物 FIP、 BIP 各 2.0l， 10mol/L 外引物 F3、 B3 各 1.0l， 10mmol/L dNTPs 3.0l,50mmol/ LMgSO43.0l,5.0mol/L甜菜碱4.5l， Bst DNA聚合。
29、酶大片段1.0l组成， 反应液总体积 20l。 0078 其中引物序列如下 ： 说 明 书 CN 102851381 A 7 5/7 页 8 0079 上游外引物 F3 ： 5 -TGTTACTAAAGAGCAGTTGC-3 ； 0080 下游外引物 B3 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ； 0081 上游内引物 FIP ： 5 -TAAACTTGACGGCCATACGCCGCTTGGAGTGAATGCAGAA-3 ； 0082 下游内引物 BIP ： 5 - 0083 CTGCTTTTGATGCTGCCGTATATTTGTTAGTTCTACATCACCTGA-3 ； 0。
30、084 b） 标准阳性模板 0085 标准阳性模板 pMD18-T-hlyA 是含有单增李斯特菌高度保守基因 hlyA 基因 356 个 碱基对的核苷酸片段构成的 pMD18-T-hlyA 载体， 该载体可在大肠杆菌 DH5 中增殖 ； 实验 所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒 pMD18-T-hlyA， 该质粒转化大肠杆菌 DH5 增殖 后用碱裂解法提取， 经 DNA 纯化试剂盒纯化， -20保存。 0086 c) 阴性质控标准品 0087 阴性质控标准品为无菌双蒸水。 0088 2. 使用制得 LAMP 试剂盒检测单增李斯特菌， 包括以下步骤 ： 0089 a、 食物样品预处理 ： 取 。
31、3 份经传统培养法鉴定的单增李斯特菌阳性食品， 3 份单 增李斯特菌阴性食品， 分别称取 25g 样品放入盛有 225mL BPW 的无菌均质杯中， 以 8000r/ min 10000r/min 均质 1min 2min， 或置于盛有 225mL BPW 的无菌均质袋中， 用拍击式均 质器拍打 1min 2min。若样品为液态， 不需要均质， 振荡混匀即可。无菌操作将样品转至 500mL锥形瓶中， 如使用均质袋， 可直接进行培养， 于361培养1-4h。 如为冷冻产品, 应在 45以下不超过 15min 解冻。 0090 b、 细菌模板 DNA 的制备 ： 分别取 100L 细菌培养物， 1。
32、2000r/min 离心 2min， 去上 清， 加入 50L 无菌水， 充分混匀， 100水浴 10min,12000r/min 离心 2min， 上清即为模板 DNA。 0091 c、 LAMP 反应 ： 分别取 5l b） 步中样本上清加入到 20l LAMP 反应液中， 65恒 温扩增 60min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。 0092 d、 结果判定 ： 待反应结束后12000r/min离心30S， 观察有无沉淀产生(见附图1)。 取5l LAMP产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测， 阳性样本都有条带， 阴性样本则无条带 （见 附图 2） 。附图 1 为。
33、离心后观察白色沉淀结果， 附图 2 为 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测结果。 0093 e、 结论 ： 反复重复试验 3 次， 所得检测结果相同， 实验组均有沉淀或电泳条带， 对 照组均无沉淀或电泳条带， 与预期结果一致。 说明本试剂盒检测单增李斯特菌效果良好， 沉 淀观察法与电泳检测法效果一致， 并且不同批次之间的检测结果具有可比性， 具有良好的 重复性。 0094 实施例 2 ： 0095 1.新型快速可视化检测单增李斯特菌LAMP试剂盒组成与配制， 与实施例1所述试 剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同， 本试剂盒的引物序列如下 ： 0096 上游外引物 F3 ： 5 -GAACCTACA。
34、AGACCTTCCA-3 ； 0097 下游外引物 B3 ： 5 -AGATTTTCCGCTTACGGC-3 ； 0098 上游内引物 FIP ： 5 -GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGT-3 ； 0099 下游内引物 BIP ： 5 - 0100 TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT-3 ； 说 明 书 CN 102851381 A 8 6/7 页 9 0101 2. 使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中单增李斯特菌的 PCR 试剂盒检测单增李斯特菌的方法与实施例1所。
35、述方法完全相同， 反复重复试验3次， 所得检 测结果相同， 实验组均有沉淀， 对照组均无沉淀 （见附图3） ， 与预期结果一致。 说明本试剂盒 检测单增李斯特菌效果良好， 并且不同批次之间的检测结果具有可比性， 具有良好的重复 性。 0102 实施例 3 ： 0103 1.新型快速可视化检测单增李斯特菌LAMP试剂盒组成与配制， 与实施例1所述试 剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同， 本试剂盒的引物序列如下 ： 0104 上游外引物 F3 ： 5 -GAACCTACAAGACCTTCCA-3 ； 0105 下游外引物 B3 ： 5 -AGATTTTCCGCTTACGGC-3 ； 0106 上。
36、游内引物 FIP ： 5 - 0107 GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGTT-3 ； 0108 下游内引物 BIP ： 5 - 0109 TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT-3 ； 0110 2. 使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中单增李斯特菌的 PCR 试剂盒检测单增李斯特菌的方法与实施例1所述方法完全相同， 反复重复试验3次， 所得检 测结果相同， 实验组均有沉淀， 对照组均无沉淀 （见附图4） ， 与预期结果一致。 说明本试剂盒 检测单增李斯特菌效果良好， 并。
37、且不同批次之间的检测结果具有可比性， 具有良好的重复 性。 0111 实施例 4 ： 0112 1.新型快速可视化检测单增李斯特菌LAMP试剂盒组成与配制， 与实施例1所述试 剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同， 本试剂盒的引物序列如下 ： 0113 上游外引物 F3 ： 5 -GCTGTTACTAAAGAGCAGTTG-3 ； 0114 下游外引物 B3 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ； 0115 上游内引物 FIP ： 5 -GCCATACGCCACACTTGAGACAAGCGCTTGGAGTGAAT-3 ； 0116 下游内引物 BIP ： 5 - 0117 A。
38、AGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC-3 ； 0118 2. 使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中单增李斯特菌的 PCR 试剂盒检测单增李斯特菌的方法与实施例1所述方法完全相同， 反复重复试验3次， 所得检 测结果相同， 实验组均有沉淀， 对照组均无沉淀 （见附图5） ， 与预期结果一致。 说明本试剂盒 检测单增李斯特菌效果良好， 并且不同批次之间的检测结果具有可比性， 具有良好的重复 性。 0119 实施例 5 ： 0120 1.新型快速可视化检测单增李斯特菌LAMP试剂盒组成与配制， 与实施例1所述试 剂盒的不同之处在于特。
39、异性引物序列不同， 本试剂盒的引物序列如下 ： 0121 上游外引物 F3 ： 5 -TGTTACTAAAGAGCAGTTGC-3 ； 0122 下游外引物 B3 ： 5 -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3 ； 0123 上游内引物 FIP ： 5 -TAAACTTGACGGCCATACGCCGGAGTGAATGCAGAAAATCCT-3 ； 0124 下游内引物 BIP ： 5 - 说 明 书 CN 102851381 A 9 7/7 页 10 0125 AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC-3 ； 0126 2. 使用所述。
40、基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中单增李斯特菌的 PCR 试剂盒检测单增李斯特菌的方法与实施例1所述方法完全相同， 反复重复试验3次， 所得检 测结果相同， 实验组均有沉淀， 对照组均无沉淀 （见附图6） ， 与预期结果一致。 说明本试剂盒 检测单增李斯特菌效果良好， 并且不同批次之间的检测结果具有可比性， 具有良好的重复 性。 0127 实施例 6 ： 快速检测单增李斯特菌的 LAMP 试剂盒的特异性实验 0128 a、 DNA 模板的制备 ： 分别取经过 DNA 有效性验证的单核细胞增生李斯特氏菌、 绵羊李斯特氏菌、 痢疾志贺氏菌、 甲型副伤寒沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌的。
41、 菌液 10l， 12000r/min 离心 2min， 去上清， 加入 50L 无菌水， 充分混匀， 100水浴 10min,12000r/min 离心 2min， 上清即为模板 DNA。 0129 b、 LAMP 反应 ： 分别取 5l a） 步中样本上清加入到 20l LAMP 反应液中， 65恒 温扩增 60min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。 0130 c、 结果判定 ： 待反应结束后 12000r/min 离心 30S， 观察有无沉淀产生 （见附图 7） 。 附图 7 为单增李斯特菌 LAMP 试剂盒特异性实验观察白色沉淀结果。 0131 d、 结论。
42、 ： 结果显示只有阳性对照组、 单核细胞增生李斯特氏菌、 绵羊李斯特氏菌有 白色沉淀， 而痢疾志贺氏菌、 甲型副伤寒沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌和阴性对照 没有白色沉淀。 0132 上述实验说明本试剂盒具有良好的特异性。 0133 实施例 7 ： 快速检测单增李斯特菌 LAMP 试剂盒灵敏度实验 0134 a、 取 1ml 过夜培养的单增李斯特菌培养液做 10 倍倍比稀释， 稀释至 10-9。取每个 稀释度的菌液10l， 12000r/min离心2min， 去上清， 加入50L无菌水， 充分混匀， 100水 浴 10min,12000r/min 离心 2min， 上清即为模板 DNA。
43、。 0135 b、 LAMP 反应 ： 取 5l a） 步中样本上清加入到 20l LAMP 反应液中， 65恒温扩 增 60min。 0136 c、 结果判定 ： 反应结束后， 12000r/min 离心 30s 观察管底是否产生白色沉淀， 结果 显示 10-1-10-8样本管底均有白色沉淀， 10-9-10-10样本管底则没有白色沉淀 （见附图 8） 。附 图 8 为单增李斯特菌 LAMP 试剂盒灵敏度实验观察白色沉淀结果。 0137 d、 结论 ： 结果显示当菌液稀释至 10-8时仍能检测出， 最低检测极限为 50CFU/ml。 0138 上述实验说明本试剂盒具有良好的灵敏度。 0139。
44、 从上述实例可以说明， LAMP 检测试剂盒特异性好， 灵敏度高， 重复性好， 操作简便， 而且 LAMP 检测试剂盒对样品的检测仅需不到 5 个小时就能完成， 而传统的培养法约需 1 周 左右才能完成， 因此， 使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。 0140 该试剂盒的操作只需 1 人即可完成整个操作过程， 一次可检测多个 （由实际检测 需要决定） 样品， 这样也减少了人力资源的浪费。 说 明 书 CN 102851381 A 10 1/6 页 11 SEQUENCE LISTING 武汉真福医药科技发展有限公司 快速检测单增李斯特菌的 LAMP 试剂盒 21 PatentIn version。
45、 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 tgttactaaa gagcagttgc 20 2 19 DNA 人工序列 2 ttacggcttt gaaggaaga 19 3 40 DNA 人工序列 3 taaacttgac ggccatacgc cgcttggagt gaatgcagaa 40 序 列 表 CN 102851381 A 11 2/6 页 12 4 45 DNA 人工序列 4 ctgcttttga tgctgccgta tatttgttag ttctacatca cctga 45 5 19 DNA 人工序列 5 gaacctacaa gaccttcca 19 6 18 DNA 。
46、人工序列 6 agattttccg cttacggc 18 7 43 DNA 人工序列 7 ggattttctg cattcactcc aagcgatttt tcggcaaagc tgt 43 8 49 序 列 表 CN 102851381 A 12 3/6 页 13 DNA 人工序列 8 tcctgcatat atctcaagtg tggcgctttt actttagtac tatgggaat 49 9 19 DNA 人工序列 9 gaacctacaa gaccttcca 19 10 18 DNA 人工序列 10 agattttccg cttacggc 18 11 44 DNA 人工序列 1。
47、1 ggattttctg cattcactcc aagcgatttt tcggcaaagc tgtt 44 12 49 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102851381 A 13 4/6 页 14 12 tcctgcatat atctcaagtg tggcgctttt actttagtac tatgggaat 49 13 21 DNA 人工序列 13 gctgttacta aagagcagtt g 21 14 19 DNA 人工序列 14 ttacggcttt gaaggaaga 19 15 38 DNA 人工序列 15 gccatacgcc acacttgaga caagcgcttg gagtgaat 38 16 47 DNA 人工序列 16 aagtaaaagc tgcttttgat gctggttagt tctacatcac ctgagac。