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1、(10)申请公布号 CN 102864092 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864092 A *CN102864092A* (21)申请号 201210011523.7 (22)申请日 2012.01.15 CCTCC NO:M2011448 2011.12.08 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 河南科技大学 地址 471003 河南省洛阳市涧西区西苑路 48 号 (72)发明人 李永丽 周。
2、洲 崔林开 胡艳红 李凡 于雪 (74)专利代理机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 代理人 牛爱周 (54) 发明名称 一种能够促进番茄生长并拮抗三种病害的内 生细菌及其分离方法 (57) 摘要 本发明涉及一种能够促进番茄生长并拈抗 三种病害的内生细菌及其分离方法， 内生细菌 Fb9(Bacillum sp.)， 保藏日期为 2011 年 12 月 8 日， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号 为 ： CCTCC NO ： M 2011448。本发明通过平板对峙 试验筛选出对三种病菌抑菌效果最好的 Fb9 菌 株， 对番茄早疫病菌、 番茄菌核病菌、 黄瓜枯萎病 菌抑菌率分别。
3、为 70.81、 74.35、 65.17。Fb9 菌株对番茄的生长具有促进作用， 对番茄早疫病 的室内盆栽防治效果为 63.7。经试验 ： 通过分 离筛选获得对番茄早疫病具有防治效果的番茄内 生细菌菌株， 并鉴定出该菌株对番茄的生长具有 促进作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种能够促进番茄生长并拈抗三种病害的内生细菌 Fb9(Bacillum sp.)， 保藏日期 为2011年12月8日， 保藏于中国典型培养物保藏中心。
4、， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 2011448。 2. 一种能够促进番茄生长并拈抗三种病害的内生细菌的分离方法， 其特征在于 ： 包括 以下步骤 ： 采集健康番茄植株的根、 茎、 叶各 3g， 在 75的酒精中浸泡 30s， 然后用 0.1的 升汞消毒3min， 用无菌水冲洗5次后， 于灭菌的研钵中研磨， 加入5ml无菌水混匀， 分别取最 后一次的冲洗液和研磨液 200ul， 涂布于 NB 培养基平板上， 在 28下培养， 逐日观察， 如最 后一次冲洗液涂布的培养基中无菌落， 在研磨液涂布的培养基中长出的菌落为内生细菌， 进行纯化培养后， 4冰箱中保存备用。 3. 根据权利要求 。
5、2 所述的能够促进番茄生长并拈抗三种病害的内生细菌的分离方法， 其特征在于 ： 所述的冲洗液为 ： 75的酒精中浸泡 30s， 0.1的升汞消毒 3min， 无菌水冲洗 5 次， 无菌水是经过高压蒸汽灭菌锅灭菌的蒸馏水。 4. 根据权利要求 2 所述的能够促进番茄生长并拈抗三种病害的内生细菌的分离方法， 其特征在于 ： 所述的研磨液是无菌水， 无菌水是经过高压蒸汽灭菌锅灭菌的蒸馏水。 5. 根据权利要求 2 所述的能够促进番茄生长并拈抗三种病害的内生细菌的分离方 法， 其特征在于 ： 所述的 NB 培养基组成为牛肉浸膏 5g， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 加蒸馏水至 1000mL。 6.。
6、 根据权利要求 5 所述的能够促进番茄生长并拈抗三种病害的内生细菌的分离方法， 其特征在于 ： 向 NB 培养基中加入琼脂条 18g， 为固体培养基。 权 利 要 求 书 CN 102864092 A 2 1/3 页 3 一种能够促进番茄生长并拮抗三种病害的内生细菌及其分 离方法 技术领域 0001 本发明涉及一种内生细菌， 尤其涉及一种能够促进番茄生长并拮抗三种病害的内 生细菌， 同时还涉及一种该内生细菌的分离方法。 背景技术 0002 番茄早疫病是由半知菌亚门茄链格孢菌 (Alternaria solani) 引起， 在全国各地 都有发生， 是番茄的主要病害之一。 目前对于该病的防治主要依。
7、靠化学药剂， 然而随着对环 境保护意识的增强， 人们越来越重视化学农药所造成残留和环境污染问题。生物防治已经 成为控制病害的重要手段， 而植物内生细菌作为植物病害生物防治的潜在资源菌具有独特 的优势， 并且已经显示出很好的利用前景。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种能够促进番茄生长并拮抗三种病害的内生细菌。 0004 同时， 本发明的目的还在于提供一种该内生细菌的分离方法。 0005 为了实现上述目的， 本发明的技术方案采用了一种能够促进番茄生长并拮抗三种 病害的内生细菌， 命名为 Fb9(Bacillum sp.)， 保藏于位于中国， 武汉， 武汉大学的中国典型 培养物保藏中心，。
8、 保藏日期为 2011 年 12 月 8 日， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 2011448。 0006 本发明的技术方案采用了一种内生细菌的分离方法， 包括以下步骤 ： 采集健康番 茄植株的根、 茎、 叶各 3g， 在 75的酒精中浸泡 30s， 然后用 0.1的升汞消毒 3min， 用无菌 水冲洗 5 次后， 于灭菌的研钵中研磨， 加入 5ml 无菌水混匀， 分别取最后一次的冲洗液和研 磨液 200ul， 涂布于 NB 培养基平板上， 在 28下培养， 逐日观察， 如最后一次冲洗液涂布的 培养基中无菌落， 在研磨液涂布的培养基中长出的菌落为内生细菌， 进行纯化培养后， 4 冰箱。
9、中保存备用。 0007 所述的冲洗液组成为 ： 75的酒精中浸泡 30s， 1的升汞消毒 3min， 无菌水冲洗 5 次， 无菌水是经过高压蒸汽灭菌锅灭菌的蒸馏水。 0008 所述的研磨液为无菌水， 无菌水是经过高压蒸汽灭菌锅灭菌的蒸馏水。 0009 所述的 NB 培养基组成为牛肉浸膏 5g， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 琼脂条 18g， 加蒸馏 水至 1000mL。 0010 本发明利用稀释分离法， 从健康的番茄植株中分离得到 11 个细菌菌株。通过平板 对峙试验筛选出对三种病菌抑菌效果最好的 Fb9 菌株， 对番茄早疫病菌、 番茄菌核病菌、 黄 瓜枯萎病菌抑菌率分别为 70.81、 。
10、74.35、 65.17。Fb9 菌株对番茄的生长具有促进作 用， 对番茄早疫病的室内盆栽防治效果为 63.7。经试验 ： 通过分离筛选获得对番茄早疫 病具有防治效果的番茄内生细菌菌株， 并鉴定出该菌株对番茄的生长具有促进作用。 0011 本发明的内生细菌， 命名为 Fb9（Bacillum sp.)， 保藏于位于中国， 武汉， 武汉大 学的中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为 2011 年 12 月 8 日， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 说 明 书 CN 102864092 A 3 2/3 页 4 2011448。 0012 0013 0014 0015 0016 具体实施方式。
11、 0017 本发明的内生细菌的具体分离过程如下 ： 0018 1. 材料与方法 0019 1.1 供试菌株与番茄品种 0020 番茄早疫病菌 Alternaria solani 和黄瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum 从田间 发病植株上分离得到， 番茄菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum由河南科技大学林学院植 保系实验室保存 ； 供试番茄品种为 中蔬四号 。 0021 1.2 培养基 0022 细菌培养用 NB 培养基， 真菌培养及平板对峙试验用 PDA 培养基。 0023 1.3 番茄内生细菌的分离 0024 采集健康番茄植株的根、 茎、 叶各3g， 在75。
12、的酒精中浸泡30s， 然后用1的升汞 消毒3min， 用无菌水冲洗5次后， 于灭菌的研钵中研磨， 加入5ml无菌水混匀， 分别取最后一 次的冲洗液和研磨液 200ul， 涂布于 NB 培养基平板上， 在 28下培养， 逐日观察， 如最后一 次冲洗液涂布的培养基中无菌落， 在研磨液涂布的培养基中长出的菌落是内生菌， 进行纯 化培养后， 4冰箱中保存备用。 0025 1.4 拮抗活性测定 0026 番茄早疫病菌、 番茄菌核病菌、 黄瓜枯萎病菌活化培养， 制成 8mm 的菌饼放置于 PDA 培养基中心， 四周 40mm 处分别放置三片 8mm 大小含有内生细菌的滤纸片， 置于 28培 养箱内培养 4。
13、 5 天， 测量抑菌圈半径并计算抑菌率。 0027 0028 1.5 种子发芽试验 0029 挑选饱满的番茄种子分别浸泡于Fb9菌培养液稀释5、 10、 50、 100、 500倍的稀释液 中 30min 后， 均匀放置于铺有滤纸的培养皿中， 每个培养皿放 20 粒种子， 以清水和 NB 培养 基作为对照， 每个处理重复 3 次。将培养皿放置于 28恒温箱中培养， 3 天后测芽长和根 长。 0030 1.6 盆栽防治试验 0031 番茄种子催芽后种植于培养钵中， 每钵 3 棵， 待其长至 4 叶时， 将番茄早疫病菌的 孢子悬浮液喷雾接种其上， 然后用 4108cfumL-1Fb9 菌株培养液喷。
14、雾， 以清水作为对照， 每个处理 3 盆， 3 次重复。接种后 7d 调查番茄的发病情况， 病情分级采取 5 级标准。 0032 2. 结果与分析 说 明 书 CN 102864092 A 4 3/3 页 5 0033 2.1 内生细菌 Fb9 的筛选 0034 从健康番茄的根、 茎、 叶中共分离出11株内生细菌， 其中从叶片中分离的Fb9抑菌 活性最强， 对番茄早疫病菌抑菌率达 70.81%。对番茄菌核病菌抑菌率达 74.35%。对黄瓜枯 萎病菌抑菌率达 65.17%。 0035 2.2Fb9 对番茄种子发芽的影响 0036 经内生菌 Fb9 菌株处理的番茄种子发芽率、 根长和芽长均高于清水。
15、对照， 其中以 Fb9 菌株稀释 100 倍的效果最好， 发芽率、 根长和芽长比清水对照分别增长 12.44%、 21.66% 和16.87%。 而作为对照的NB培养基对番茄种子的发芽率、 根和芽生长的影响反而不如清水 对照。 0037 2.3 盆栽防治效果 0038 试验结果表明 ： 接种番茄早疫病菌后接种 Fb9 菌株的番茄植株比用清水处理的发 病率下降 41.3 个百分点， 病情指数降低 21.3， 防治效果为 63.7。 0039 3 结论与讨论 0040 研究表明， 植物内生细菌在与宿主植物协同进化的过程中， 形成了稳定的生态关 系。内生细菌不但可以产生生长调节物质促进植物生长， 而且通过自身产生或诱导宿主 产生一些抗菌的物质， 或通过与植物病原菌竞争生态位和营养物质对植物病害起到防治作 用。 说 明 书 CN 102864092 A 5 。