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1、(10)申请公布号 CN 102864088 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864088 A *CN102864088A* (21)申请号 201110186793.7 (22)申请日 2011.07.05 CCTCC NO:M2011171 2011.05.17 C12N 1/20(2006.01) A61K 35/74(2006.01) A61P 13/12(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (71)申请人 中南大学湘雅二医院 地址 410011 湖南省长沙市人民中路 139 号 (72)发明人 蒋。
2、云生 王芳 向大雄 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 卢宏 (54) 发明名称 一种基因工程乳酸杆菌及其应用 (57) 摘要 本发明用物理化学诱变育种一种新型的能够 分解多种尿毒素的乳酸工程菌， 是将尿毒症患者 血清作定向诱导， 经双重多次诱变改变乳酸杆菌 的基因而获得， 可以将其制成生物制剂口服， 让其 定植于肠粘膜， 持续分解尿毒素， 用于治疗尿毒症 或慢性肾功能衰竭。 乳酸杆菌是人体肠道益生菌， 定植于肠粘膜内层， 其本身有增强免疫抑制病原 菌， 合成多种维生素及降胆固醇等功能。 乳酸杆菌 基因工程菌在降低多种尿毒素的基础上弥补了慢 性肾衰患者免。
3、疫力低下、 维生素缺乏和脂肪代谢 紊乱的缺陷。为慢性肾衰提供一种综合治疗的生 物制剂。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 8 页 1/1 页 2 1. 一种基因工程乳酸杆菌， 具有保藏号为 ： CCTCC NO ： M2011171。 2. 根据权利要求 1 所述的基因工程乳酸杆菌， 其特征在于所述的基因工程菌是在保加 利亚乳酸杆菌经物理化学诱变改变其基因， 使其具有分解多种尿毒素的能力。 3. 一种治疗尿毒症的药物， 其特征在于含。
4、有权利要求 1- 所述的基因工程乳酸杆菌。 4. 权利要求 1 或 2 所述基因工程乳酸杆菌的制备方法， 其特征在于以下步骤 ： 运用尿毒症患者血清定向诱导原始保加利亚乳杆菌， 使其对各种尿毒素具有一定的降 解能力 ； 以定向诱导后分解能力最强的保加利亚乳杆菌诱导株为出发菌株， 运用紫外线及 硫酸二乙酯对其进行双重多次诱变， 在尿毒素症患者血清中筛选出产多种尿毒素分解酶的 基因工程乳酸杆菌。 5. 根据权利要求 4 所述的基因工程乳酸杆菌的制备方法， 其特征在于紫外线诱变的条 件为 ： 取细菌对数生长期的中后期 14 16h 为诱变的时间点， 细菌浓度为 1.5108cfu/ml 为诱变浓度，。
5、 30W 紫外灯， 照射距离 30cm， 照射时间为 10 20s 进行诱变。 6. 根据权利要求 4 所述基因工程乳酸杆菌的制备方法， 其特征在于， 硫酸二乙酯诱变 条件为 ： 取细菌对数生长期的中后期 12 14h 为诱变的时间点， 细菌浓度 1.5108cfu/ml 为诱变浓度， DES 浓度为 1， 处理时间为 10 30min 进行诱变。 权 利 要 求 书 CN 102864088 A 2 1/8 页 3 一种基因工程乳酸杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种突变的乳酸杆菌， 具体涉及一种通过人为干预手段使乳酸杆菌突 变后获得的一种基因工程菌。 0002 本发明还涉及该基。
6、因工程菌的制备过程。 0003 本发明还进一步涉及该基因工程菌的用途。 背景技术 0004 慢性肾衰关键致病环节是尿毒症毒素在体内的过度潴留。而潴留于患者体内的 尿毒素主要为尿素、 肌酐、 尿酸， 其他毒素多为由此三种转化， 衍生、 结合的产物， 如尿素可 衍生为胍类和氨基甲酰化合物， 肌酐可衍变为氢氧化肌酐和甲基胍。三种毒素及其衍生物 在尿毒症患者体内蓄积， 可导致心肌损伤， 肾小球功能进行性丧失， 血小板功能障碍， 高血 压， 神经系统损害以及甲状腺功能紊乱等， 是引起尿毒症症状， 导致机体内环境紊乱， 器官 损害包括肾功能进行性恶化、 判断透析疗效及病人预后的主要物质。因此， 清除这些尿。
7、毒 素对于慢性肾衰的治疗是十分重要的。目前， 慢性肾衰仍缺乏满意的治疗， 主要靠血透、 腹 透和肾移植治疗。但这些治疗均存在其固有的弊端。由于经济费用高， 耗时长， 操作复杂， 全世界仅有 15的肾衰患者可以接受透析治疗， 某些尿毒素在血液中与白蛋白结合， 血透 难以将其清除， 如硫酸吲哚酚和同型半胱氨酸， 它们能刺激血管平滑肌细胞增殖， 减少肾脏 清除超氧化物质， 不仅加重残余肾衰竭而且是并发心血管病变的主要危险因素。且血透并 发症较多， 在美国大约每年有 80000 肾衰患者死于透析相关的各种并发症。肾移植供求矛 盾尖锐， 在美国肾源和需要移植的比例为 1 8， 接受透析的病人中， 因存在。
8、至今尚未突破 的医疗难题， 透析患者中约有 50在 3 年内死亡。由于在我国大部份地区仍处于发展中甚 至贫困状态， 能接受透析和肾移植的 CRF 患者仅达 15， 而 85的 CRF 患者得不到有效的 救治。 而另一类不可忽视的状况是已出现肾功能不全但未达到透析标准的病人比需要透析 病人多 5-10 倍。而对于这一部分病人的治疗， 疗效被公认的是用血管紧张素转化酶抑制 剂 (Angiotension converting enzyme inhibitors， ACEI) 和血管紧张素 II 受体拮抗剂 (Angiotensin II receptor antagonists， ARB)， 这两。
9、类药主要通过降低肾小球内高压力， 高灌注和高滤过， 延缓肾功能恶化， 但忽略了已积聚在体内的代谢产物对包括肾脏在内的 所有组织细胞的损害和功能恶化。 因而探索 一种经济、 创伤小的慢性肾衰替代治疗显得尤 为重要。 发明内容 0005 本发明的目的旨在提供一种能表达多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌， 能 使之应用于持续分解多种尿毒素， 从而提供一种能用于治疗慢性肾脏衰竭、 尿毒症等疾病 的药物。 0006 本发明提供了具有保藏号为 ： CCTCC NO ： M2011171 的基因工程乳酸杆菌。 0007 其保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心， 地址为中国武汉武汉大学 ( 邮编 ： 说 明。
10、 书 CN 102864088 A 3 2/8 页 4 430072)。 保藏菌种的分类命名为保加利亚乳杆菌突变株25号(Lactobacillus bulgaricus mutant 25 号 )。保藏日期为 2011 年 5 月 17 日。 0008 本发明提供的基因工程乳酸杆菌是可以用保加利亚乳酸杆菌经尿毒症患者血清 定向诱导后， 再经紫外线和硫酸二乙酯双重多次诱变后， 通过尿毒素筛选平板反复筛选获 得。 0009 一种产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌的制备方法如下 ： 0010 运用尿毒症患者血清定向诱导原始保加利亚乳杆菌 (L.Bulgaria， L.B)， 使其对各 种尿毒素。
11、均具有一定的降解能力(见图1)。 以定向诱导后分解能力最强的L.B诱导株为出 发菌株， 运用紫外线 (UltraViolet， UV) 及硫酸二乙酯 (Diethylsulfate， DES) 对其进行双 重多次诱变， 在尿毒素筛选培养基中筛选出具有高效分解尿毒素能力的 L.B 突变株 ( 见图 2)。 0011 所述的定向诱导方法为 ： 使 L.B 在尿毒症患者血清中连续培养 25 代。 0012 所述的双重多次诱变的具体方案见图 14 ： 0013 UV 诱变的条件为 ： 取细菌对数生长期的中后期 14-16h 为诱变的时间点， 细菌浓 度为 1.5108cfu/ml 为诱变浓度， 30W。
12、 紫外灯， 照射距离 30cm， 照射时间为 15s 进行诱变。 0014 DES 诱变条件为 ： 取细菌对数生长期的中后期 12-14h 为诱变的时间点， 细菌浓度 1.5108cfu/ml 为诱变浓度， DES 浓度为 1， 处理时间为 20min 进行诱变。 0015 所述的初筛平板1为尿毒素浓度梯度MRS培养基， 其具体配制方法为 ： 先倒入普通 MRS 琼脂培养基， 倾斜培养皿约 15， 待凝固后平放， 再倒入含 20 (v/v) 尿毒症患者血清 的 MRS 琼脂培养基。冷却凝固后， 倒置于 4贮存。 0016 所述的初筛平板 2 为尿毒素为唯一氮源培养基， 其具体配制方法为 ： 葡。
13、萄糖 20g， 乙酸钠 5.0g， 柠檬酸二铵 2.0g， 吐温 801ml， MgSO47H2O 0.2g， MnSO44H2O 0.05g， K2HPO4 2.0g， 琼脂 15g， 调 pH 值到 6.12 6.2， 蒸馏水定容至 1.0L， 115高压灭菌 20min。待液体 冷却到 45左右， 加入过滤除菌的尿毒症患者血清， 使其终浓度为 20 (v/v)， 再铺平板。 冷却凝固后， 倒置于 4贮存。 0017 所述的复筛培养基为 ： 尿毒症患者血清。 0018 本发明提供的产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌的具体制备步骤如 下 ： 0019 1、 产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的定。
14、向诱导 ： 将活化的 L.B 以 4 (v/v) 接种于 尿毒症患者血清中， 振荡混匀后厌氧培养24小时， 为第1代。 混匀后取1置于新的尿毒症 患者血清中， 振荡混匀后 37厌氧培养 24h， 为第 2 代。如此反复传代至 25 代后取出检测 该菌分解尿毒素的能力。 0020 2、 产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的双重多次诱变 ： 选择定向诱导后， 分解尿毒素 能力最强的 L.B 诱导株作为出发菌株， 根据前述的诱变方案进行双重多次诱变。取细菌对 数生长期的中后期 (16 小时 ) 为诱变的时间点， 细菌浓度为 1.5108cfu/ml， 30W 紫外灯， 照射距离 30cm， 照射时间为 15。
15、s 进行紫外线诱变， 反复诱变 3 次后， 涂布初筛平板 1 和 2。 分别挑取尿毒素筛选平板 1 上尿毒素浓度高的部位、 生长直径较大的菌落以及尿毒素筛选 平板 2 上生长良好的菌落 400 株接种于尿毒症患者血清中培养 24h， 每株 1 管， 检测培养前 后， 血清中尿毒素的浓度， 计算尿毒素转化率 尿毒素转化率 ( ) ( 培养基中尿毒素 说 明 书 CN 102864088 A 4 3/8 页 5 初含量 - 培养基中尿毒素终含量 )/ 培养基中尿毒素初含量 。挑选出尿毒素转化率较出 发菌株提高大于 5的菌株 50 株， 接种于尿毒症患者血清中培养 24h， 每株 4 管， 检测培养。
16、 前后， 血清中尿毒素的浓度， 计算尿毒素转化率。选择尿毒素转化率最高的一株作为进一 步 DES 诱变的出发菌株。取细菌对数生长期的中后期 (14h) 为诱变的时间点， 细菌浓度为 1.5108cfu/ml， DES 浓度为 1， 处理时间为 20min 进行 DES 诱变。反复诱变 3 次后， 涂布 初筛平板1和2。 分别挑取尿毒素筛选平板1上尿毒素浓度高的部位、 生长直径较大的菌落 以及尿毒素筛选平板 2 上生长良好的菌落 400 株接种于尿毒症患者血清中培养 24h， 每株 1 管， 检测培养前后， 血清中尿毒素的浓度， 计算尿毒素转化率。挑选出尿毒素转化率较出发 菌株提高大于 5的菌株。
17、 50 株， 接种于尿毒症患者血清中培养 24h， 每株 4 管， 检测培养前 后， 血清中尿毒素的浓度， 计算尿毒素转化率。 选择尿毒素转化率最高的一株为我们的目的 菌株。 0021 目的菌株降解尿毒素的能力较非诱变 L.B 显著提高， 高浓度尿毒素血清中可以持 续分解多种尿毒素。 0022 本申请人还发现， 本发明提供的乳酸杆菌， 与非变异的乳酸杆菌一样， 可以在动物 体肠道存活、 繁殖， 并持续发挥治疗慢性肾功能衰竭的作用。 0023 鉴于此， 本申请人认为， 该基因工程乳酸杆菌可以用于制备治疗慢性肾衰竭、 尿毒 症等疾病的药物。本申请人通过实验证明前述推论。 附图说明 0024 图 1。
18、 ： 尿毒症患者血清诱导 L.B 25 代之后对尿毒症毒素的作用 (n 5)。a， 诱导 L.B 肌酐的作用 ； b， 诱导 L.B 对尿素的作用。A. 空白对照组 ； B. 诱导 L.B 组。*P 0.05vs 空白对照组。 0025 图 2 ： 双重多次诱变后 L.B 对尿毒症毒素的作用 (n 4)。a ： 诱变 L.B 对肌酐的作 用 ； b ： 诱变L.B对尿素的作用。 A.空白对照组 ； B.诱导L.B组。 C.诱变L.B组。 *P0.05vs 空白对照组， #P 0.01vs 诱导 L.B 组。 0026 图 3 ： L.B 的生长曲线图 0027 图 4 ： 诱导 L.B 行 U。
19、V 诱变的致死率曲线 0028 图 5 ： 诱导 L.B 行 DES 诱变的致死率曲线 0029 图 6 ： 产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌遗传稳定性试验。a ： 产肌酐水 解酶 L.B 稳定性研究 ； b ： 产尿素酶 L.B 稳定性研究。 *P 0.05vs 空白对照组，#P 0.01vs 诱导 L.B 组。 0030 图 7 ： 产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌脲酶活性检测。 0031 图8 ： 各组大鼠不同时间点血肌酐， 尿素氮水平。 A ： 各组大鼠不同时间点血肌酐水 平 ； B ： 各组大鼠不同时间点血尿素氮水平。 *P 0.01vs 假手术组，#P 0.01vs 模。
20、型组，P 0.05vs 保加利亚乳杆菌组。 0032 图 9 ： 各组大鼠不同时间点血脂的变化。A ： 各组大鼠 0 8w 血 TG 变化， B ： 各组 大鼠 0 8w 血 TC 变化， C ： 各组大鼠 0 8w 血 HDL 变化。模型组大鼠血 TG、 TC 明显升高， HDL 明显下降， 饲菌组血 TG、 TC 较模型组明显升高， HDL 较模型组明显下降 *P 0.05vs 假 手术组， #P 0.05vs 模型组 说 明 书 CN 102864088 A 5 4/8 页 6 0033 图 10 ： 各组大鼠肾脏组织病理改变。A ： (a-d) 各组大鼠肾组织 HE 染色 (200) 。
21、； (e-h) 各组大鼠肾组织 Masson 染色 (200)。 0034 图 11 ： 肾间质损伤系数评分。*P 0.05， 与假手术组比较， #P 0.05，P 0.01 与模型组比较， P 0.05 与保加利亚乳杆菌组比较。 0035 图 12 ： 肾间质胶原面积评分。*P 0.05， 与假手术组比较， #P 0.05，P 0.01 与模型 组比较， P 0.05 与保加利亚乳杆菌组比较。 0036 图 13 ： 免疫组化检测各组大鼠肾脏组织中 TGF-1及 FN 表达情况。A ： (a-d) 各组 大鼠肾组织 TGF-1表达情况 (400) ； (e-h) 各组大鼠肾组织 FN 表达情。
22、况 (400). 免疫 组化 ： 模型组大鼠肾组织 TGF-1及 FN 表达明显上调， 饲菌组 TGF-1及 FN 的表达较模型 组明显下调。 (400) ； B ： 肾组织TGF-1免疫组化半定量分析， C ： 肾组织FN免疫组化半定 量分析。*P 0.05， 与假手术组比较， #P 0.05，P 0.01 与模型组比较，P 0.05 与 保加利亚乳杆菌组比较。 0037 图 14 ： 双重多次诱变的具体方案流程图。 具体实施方式 0038 以下实施方式及实施例旨在说明本发明， 而不是对本发明的进一步限定。 0039 实施例 1 0040 1、 产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的定向诱导 ： 将活。
23、化的 L.B 以 4 (v/v) 接种于 尿毒症患者血清中， 振荡混匀后厌氧培养24小时， 为第1代。 混匀后取1置于新的尿毒症 患者血清中， 振荡混匀后 37厌氧培养 24h， 为第 2 代。如此反复传代至 25 代后取出检测 该菌分解肌酐、 尿素的能力。 0041 2、 产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的双重多次诱变 0042 选择定向诱导后， 分解尿毒素能力最强的 L.B 诱导株作为出发菌株， 根据权利要 求 4 所述的诱变方案进行双重多次诱变。 0043 1)UV 多次诱变 ： 取细菌对数生长期的中后期 (16h) 为诱变的时间点， 细菌浓度为 1.5108cfu/ml， 30W 紫外灯， 。
24、照射距离 30cm， 照射时间为 15s 进行紫外线诱变， 反复诱变 3 次后， 涂布初筛平板 1 和 2。 0044 2)DES 多次诱变 ： 选择尿毒素转化率最高的 UV 诱变株作为进一步 DES 诱变的出发 菌株。取细菌对数生长期的中后期 (14h) 为诱变的时间点， 细菌浓度为 1.5108cfu/ml， DES 浓度为 1， 处理时间为 20min 进行 DES 诱变。反复诱变 3 次后， 涂布初筛平板 1 和 2。 0045 3) 初筛 ： 分别挑取尿毒素筛选平板 1 上尿毒素浓度高的部位、 生长直径较大的菌 落以及尿毒素筛选平板 2 上生长良好的菌落 400 株接种于尿毒症患者血。
25、清中培养 24h， 每 株 1 管， 检测培养前后， 血清中肌酐、 尿素氮的浓度， 计算肌酐转化率 肌酐转化率 ( ) (培养基中肌酐初含量-培养基中肌酐终含量)/培养基中肌酐初含量和尿素转化率尿 素转化率()(培养基中尿素氮初含量-培养基中尿素氮终含量)/培养基中尿素氮初 含量 。 0046 复筛 ： 挑选出肌酐、 尿素氮转化率较出发菌株提高大于 5的菌株 50 株， 接种于尿 毒症患者血清中培养 24h， 每株 4 管， 检测培养前后， 血清中尿毒素的浓度， 计算肌酐、 尿素 转化率。选择肌酐、 尿素转化率最高的一株进行下述的试验。 说 明 书 CN 102864088 A 6 5/8 页。
26、 7 0047 实施例 2 0048 细菌分解肌酐、 尿素能力的测定 ： 将实施例 1 得到的 L.B 活化， 制成菌液， 按 4的 量接种于 MRS 肉汤培养基充分混匀后， 37厌氧培养至对数期后取出， 用无菌生理盐水反 复洗涤， 离心3次后， 生理盐水重悬， 麦氏比浊法调整各管悬菌液OD625为0.080.1， 约为 1.5108cfu/ml， 各取 200ul 悬菌液加入 800ul 尿毒症患者血清中， 37厌氧培养， 分别于 24h， 48h 取出， 40000rmp/min， 离心 5min， 取上清液检测肌酐、 尿素氮浓度。取 200ul 生理盐 水加入上述培养基中作为对照组， 每。
27、组设 5 个平行管。培养前后运用 jaffe 氏法、 UV-GLDH 法， 用 Hitachi7170A 型全自动生化仪上检测培养基中的肌酐或尿素氮的浓度。结果见图 2。 0049 出发菌株生长曲线的测定 ： 将活化好的L.B菌株接种于MRS肉汤培养基中， 37培 养 32h， 按 3接种量接种到 MRS 肉汤培养基三角瓶中， 置于厌氧培养罐中， 37恒温培养。 每间隔2h取3mL发酵液， 在600nm波长下测定OD值， 以时间为横坐标， OD值为纵坐标作图， 得到该菌株的生长曲线。见图 3。 0050 细胞悬浮液的制备 ： 将 L.B 于 MRS 肉汤培养基中培养至对数生长期的中后期， 在 。
28、10000rpm/min 条件下离心 10min， 收集沉淀得菌体。用 0.85的生理盐水 ( 已灭菌 ) 将菌 体制成悬浮液， 再离心、 洗涤菌体 3 次。将菌悬液适当稀释， 用麦氏比浊法制备成 108cfu/ mL， 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内， 振荡 20 30min， 以充分打散细胞， 备用。 0051 UV 诱变处理 ： 紫外灯照射前， 先开灯预热 20min 30min， 然后取 6mL 菌悬液置于 直径9cm的培养皿中， 在磁力搅拌器搅拌的过程时， 静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行 搅拌， 然后打开皿盖， 用30W紫外灯分别照射5s、 15s、 30s、 45s。
29、、 60s、 75s、 90s和120s， 紫外灯 距离30cm下， 照射完毕后先盖上皿盖， 再关闭搅拌和紫外灯(开启培养皿盖同时记时， 达到 要求时间后立即盖上皿盖 )。 0052 DES 诱变处理 ： 取 4ml 悬菌液， 加入 16ml pH7.0PBS， 加入 0.2ml DES( 比重 1.18， 分子量 154)， 使其终浓度分别为 1.0。于 37震荡处理 5、 10、 15、 20、 30、 40min， 诱变结束 后， 加入 2.5 倍 25的硫代硫酸钠终止反应。 0053 测定相应的致死率 ： 取 0.1ml 诱变后的菌液进行适当稀释分离， 取三个合适的稀 释度 (-4、 。
30、-5、 -6) 倾注 MRS 平板进行计数 ( 避光培养 )。致死率 ( 未经处理的每毫升活 菌数 - 经处理的每毫升活菌数 )/ 未经处理的每毫升活菌数。UV 致死率见图 4， DES 致死率 见 图 5。 0054 实施例 2 0055 本发明提供的产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌稳定性研究 ： 将诱变得到的目的菌株 在尿毒素MRS肉汤培养基中培养， 然后按4的量传代， 培养24h为1代， 每间隔1代取出一 定悬菌液， 用生理盐水洗涤后， 重悬， 用麦氏比浊法调整各管悬菌液浓度为 108cfu/ml， 各取 200ul 悬菌液加入 800ul 尿素或者肌酐 MRS 肉汤培养基中， 37培养 24。
31、h， 40000rmp/min， 离 心 5min， 取上清液检测肌酐、 尿素氮浓度。取 200ul 生理盐水加入 800ul 尿素或者肌酐 MRS 肉汤培养基中作为对照组， 每个菌株设 5 个平行管。见图 6。 0056 粗酶液的制备 0057 分别将非诱变 L.B 及诱变 L.B 在尿毒素 MRS 肉汤培养基中 37培养 16 小时后 说 明 书 CN 102864088 A 7 6/8 页 8 挑取单菌落分别接种于 2mLMRS 肉汤中， 过夜再培养。 0058 过夜培养的高产菌 200ul 接种于 10mL 含 1尿毒素 MRS 肉汤培养基中， 37静 置培养至 OD600 约 1.0。
32、， 随后 4 ( 离心机预冷 )4000g/min， 离心 20min， 弃上清液。 0059 沉淀用冰冷的50mmol/l pH7.5PBS洗涤3次(反复离心， 弃上清， 混匀)， 再用适 量的上述缓冲液重悬菌体。 0060 超声破碎， 功率 300W， 破碎时间 10min( 每开 3 秒， 间停 3 秒 )。整个过程在冰上 进行。 0061 破碎液在 4 10000g/min 离心 30min， 去除细胞碎片， 取上清液， 得到粗酶液。 0062 肌酐水解酶的活性测定 ： 取 0.1mL 上述粗酶液加入到 37预温的 0.9mL 含 100mmol/L肌酸的磷酸缓冲液(50mmol/L，。
33、 pH7.5)中， 混匀， 37反应10min。 迅速移取0.1mL 反应液至 1mol/LNaoH 和 0.5苦味酸中 ( 各 1m) 中终止反应， 加入 0.9mL 蒸馏水， 于 25 显色 10min 后于 520nm 处测吸光值为 ODtest。同时， 取 0.1mL 50mmol/l PH7.5PBS 加入到 37预温的 0.9mL 含 100mmol/L 肌酸的磷酸缓冲液 (50mmol/L， PH7.5) 中， 混匀， 37反应 10min。迅速移取 0.1mL 反应液至 1mol/LNaoH 和 0.5苦味酸中 ( 各 1m) 中终止反应， 加入 0.9mL 蒸馏水， 于 25。
34、显色 10min 后于 520nm 处测吸光值为 ODblank。按下式计算酶活力 ： 0063 酶活力 (u/mL) (Atest-Ablank)xVtxB/4.65xDxTxVe 0064 式中 ： Vt 显色反应液总体积 (3mL) ； B 酶反应液体积 (1mL)/ 显色样品液 (0.1mL) ； 4.65 橘红色物质的微摩尔消光系数 ； D 比色杯光径 (1cm) ； T 酶反应时间 (10min) ； Ve 酶液 体积 (0.1mL)。 0065 酶活力定义 ： 37、 pH7.5， 每分钟催化生成 1umol 肌酐所需酶量为一个酶活力单 位 (u)。 0066 蛋白浓度用 BCA。
35、 蛋白浓度测定试剂盒测定。 0067 酶比活 (u/mg) ： 每毫克酶蛋白所具有的酶活性。酶比活酶活性 / 蛋白浓度。见 表 1。 0068 表 1 肌酐水解酶活性检测结果 0069 0070 脲酶活力测定 ： 取 50 100uL 提取的脲酶蛋白液加入尿素缓冲液 (50mmol/L 尿 素， 50mmol/L EDTA， 50mmol/L HEPES， pH 7.4) 中， 使终体积为 1mL， 37水浴温育 6h。每隔 2h 吸取反应液， 转入加有 1.5mL 酚 - 硝普纳的离心管中， 并加入 1.5mL 碱 - 次氯酸钠， 均匀 混合。37水浴温育 30min 后， 用分光光度计测定。
36、 625nm 波长下 OD 值。利用煮沸后的上清 液作为空白对照。配制不同稀释倍数氨溶液做氨标准曲线 ( 采用 2 1 摩尔数的 NaOH 和 (NH4)2SO4 配制成 1.0mM、 2.5mM、 5.0mM、 10mM、 25mM、 50mM、 100mM 和 500mM 标准 NH3 溶液 )。 说 明 书 CN 102864088 A 8 7/8 页 9 脲酶活力定义为 ： 1U/g 等于 1g 酶蛋白 1min 释放 1molNH3。见图 7。 0071 实施例 3 0072 诱变菌株治疗实验性肾衰的疗效观察 0073 肾切除模型建立 ： 30 只雄性 6 周龄 SD 大鼠， 体重 。
37、170-190g， 适应性喂养 1 周， 根据 该周的饲料消耗量来决定实验开始时的饲料供给量。随机抽取 8 只作为假手术组， 其余 32 只进行5/6肾切除。 5/6肾切除模型制备方法 ： 第一步手术左肾2/3切除 ： 称重后按10 水合氯醛 0.35mL/100g 麻醉， 于下腹正中偏外消毒皮肤， 抽药 1mL 皮试针垂直刺入腹壁， 回 抽无血液和尿液， 即注入。麻醉成功后将四肢俯卧位固定于手术板。先触摸到左肋脊角， 再 确定左肋脊角下 1cm、 脊柱外 0.8cm 为中心向上下作切口， 局部剪毛、 碘伏消毒。带无菌手 套， 铺无菌洞巾。 切开皮肤后， 于皮下背肌红白交界处作为解剖标志， 以。
38、平行脊柱作小切口， 然后向深部分离肾周脂肪组织， 即可在腹膜外分离出肾脏。 剥离肾包膜后， 于上极和下极以 与水平线呈 30角等量切除肾， 切除总量占左肾 2/3。立即以小块明胶海绵贴于创面， 用镊 子夹在贴有明胶海绵的上下两极， 轻轻还纳。肌层用 4 号缝合丝线、 皮肤用 7 号缝合丝线缝 合创口， 单笼喂养 7 天后合笼， 术后当日始腹 腔注射青霉素 72 万 u/kg， 每天 1 次， 连用 3 天。第二步手术右肾全切除 ： 第一步手术 1 周后进行， 称重、 麻醉、 固定、 剪毛、 消毒、 切开 皮肤皮下组织及分离出肾脏同第一步手术， 剥离肾包膜至肾蒂近端， 止血钳于肾蒂近端钳 夹肾蒂。
39、， 4 号缝合丝线结扎肾蒂， 再于远端切除肾脏。分别以 4 号和 7 号线缝合皮下组织及 皮肤。单笼喂养 7 天后合笼， 术后当日始腹腔注射青霉素 72 万 u/kg， 每天 1 次， 连用 3 天。 假手术组同期也进行两步手术， 第一步只分离出左肾， 剥离肾包膜后， 不作任何切除即还 纳肾脏， 其余同 5/6 肾切除第一步造模手术 ； 第二步只分离出右肾， 剥离肾包膜后， 不作任 何切除即还纳肾脏， 缝合切口。单笼喂养 7 天后合笼， 术后当日始腹腔注射青霉素 72 万 u/ kg， 每天 1 次， 连用 3 天。 0074 实验分组 ： 假手术组 (n 8) ： 无菌生理盐水 2mL/d，。
40、 灌胃， 每天 1 次 ； 5/6 肾 切除模型组(n8)， 简称模型组 ： 无菌生理盐水2mL/d， 灌胃， 每天1次 ； 保加利亚乳杆菌 组 (n 7) ： 原始非诱变保加利亚乳杆菌悬菌液 1.5108cfu/ml2ml/d， 灌胃， 每天 1 次 ； 基因工程乳酸杆菌组(n7)， 基因工程乳酸杆菌悬菌液1.5108cfu/ml2ml/d， 灌胃， 每天 1 次。 0075 各组大鼠不同时间点血肌酐、 尿素氮水平变化 ： 各组分别于给药前及给药后 2， 4， 8 周末， 眼眶取血 1-1.5ml， 用 Hitachi7170A 型自动生化分析仪分别测定血清标本中肌酐 (Cr)、 尿素氮 (。
41、BUN)， 结果见图 8。 0076 各组大鼠不同时间点血脂的变化 ： 各组分别于给药前及给药后 2， 4， 8 周末， 眼眶 取血 1-1.5ml， 用 Hitachi7170A 型自动生化分析仪分别测定血清标本中胆固醇 (TC)、 甘油 三酯 (TG)、 高密度脂蛋白 (HDL)， 结果见图 9。 0077 各组大鼠于给药后 8 周， 10水合氯醛 0.35mL/100g 麻醉大鼠， 手术板固定大鼠， 于腹中线剪开腹部皮肤及腹肌层， 推开肠管残肾， 迅速剥离残肾周围的结缔组织， 摘除残 肾， 沿矢状面剖开残肾， 无菌生理盐水冲洗， 无菌纱布轻轻吸干组织表面水分， 放入 4多聚 甲醛溶液中固。
42、定24h， 再依次浸入70乙醇30min、 80乙醇30min、 95乙醇2次各30min、 无水乙醇 2 次各 30min、 二甲苯透明 2 次各 15min 后， 置于包埋盒中， 60浸蜡 3h。冷却后 切片贴于多聚赖氨酸处理过的洁净玻片上， 60烤片 2h， 2-3m 厚切片供常规 HE， Masson 说 明 书 CN 102864088 A 9 8/8 页 10 染色， 4m 厚切片供免疫组化检测。 0078 各组大鼠肾脏组织病理改变 ： 苏木素-伊红(HE)染色 ： 2-3m厚石蜡切片常规 脱蜡， 经各级乙醇至水， 苏木素室温染核 7min， 快速自来水冲 30 60 秒， 1盐酸。
43、酒精分化 数秒， 自来水冲洗 1min， 伊红室温染 2min， 自来水冲洗 1 分钟。梯度酒精脱水， 二甲苯透明 1 分钟， 中性树胶封片。结果核染蓝色， 胞浆染红色。 Masson 染色 ： 2-3m 厚石蜡切片 常规脱蜡， 经各级乙醇至水， 苏木素室温染核3min， 快速自来水冲洗3060秒， 丽春红酸性 品红液中染30-60min， 自来水冲洗1分钟， 1磷钼酸中染1min， 不洗直接入2苯胺蓝液染 3-5min， 水速洗， 梯度酒精脱水， 二甲苯透明 1 分钟， 中性树胶封片。胶原纤维染蓝色， 见图 10 肾小管间质损伤评价 ： 在 200 倍光学显微镜下依次观察左上、 左下、 右上。
44、、 右下、 中间共 5 个肾小管间质视野， 按肾间质损伤 8 项指标评分， 这 8 项指标分别为肾小管扩张、 肾小管 萎缩、 肾小管上皮细胞空泡变性、 红细胞管型、 蛋白管型、 间质纤维化、 间质水肿、 间质炎性 细胞浸润， 计算均值作为该标本的肾小管间质损伤指数， 见图 11。肾间质胶原面积评分 ： 在 400 倍光学显微镜下， 每个标本随机观察 20 个不重叠视野， 计算肾间质阳性染色所占视 野的百分比， 将面积百分比进行半定量评分后取均值作为肾间质胶原面积评分见图 12。 0079 免疫组化检测各组大鼠肾脏组织中 TGF-1及 FN 表达情况 ： 石蜡切片脱蜡， 经各 级乙醇至水， 二甲。
45、苯 I 2min， 二甲苯 II 2min， 100酒精 2min， 95酒精 3min， 80酒精 1min， 70酒精 1min， 蒸馏水冲洗 1min， PBS 冲洗 1min。石蜡切片经二甲苯脱蜡、 梯度酒精 入水后， 置于 3 H2O2室温孵育 5 10 分钟， 以消除内源性过氧化物酶的活性， PBS 冲洗， 2min3 次。然后浸入 0.01M 枸櫞酸盐缓冲液 (pH6.0) 中热修复抗原， 冷却后滴加正常山 羊血清封闭， 室温孵育 20 分钟， 继之按卵白素 - 生物素 - 过氧化物酶复合物法 (SP 法 ) 进 行免疫组织化学反应， 滴加一抗抗体稀释液 (4孵育过夜 ) ； P。
46、BS 冲洗， 2min3 次。滴加 生物素标记的羊抗兔 IgG(37孵育 30min) ； 滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液 (37孵育 30min)。最后用葡萄糖氧化酶二氨基联苯胺 (DAB) 硫酸镍胺法显色， 显微镜下掌握显色程 度， 适时蒸馏水终止。苏木素轻度复染， 流水冲洗。依次用 75 80 95 100脱 水、 二甲苯透明、 中性树胶封片、 光镜观察。阴性对照组用 PBS 代替上述一抗进行反应， 阳性 着色为棕黄色颗粒， 见图 13A。图像半定量分析 ： 200 倍显微镜下观察， 每组随机观察 10 个 不含肾小球和动脉的肾小管间质视野， 用Image-Pro PluS Versio。
47、n 6.0图像分析系统分析 各视野下阳性目标光密度和阳性面积百分比， 用平均光密度 (IOD/area) 代表指标表达量， 见图 13B， 13C。 说 明 书 CN 102864088 A 10 1/8 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102864088 A 11 2/8 页 12 图 4 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102864088 A 12 3/8 页 13 图 8 说 明 书 附 图 CN 102864088 A 13 4/8 页 14 图 9 说 明 书 附 图 CN 102864088 A 14 5/8 页 15 图 10 说 明 书 附 图 CN 102864088 A 15 6/8 页 16 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 102864088 A 16 7/8 页 17 图 13 说 明 书 附 图 CN 102864088 A 17 8/8 页 18 图 14 说 明 书 附 图 CN 102864088 A 18 。