凝血因子的纯化.pdf

本发明涉及维生素K依赖性凝血因子例如因子IX(FIX)的纯化。特别地，本发明提供用于从包含所述因子IX种类(其具有不同γ-羧基谷氨酸含量)的混合物的样品中纯化具有所需γ-羧基谷氨酸含量的因子IX的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将所述因子IX样品加入免疫亲和色谱材料中，所述免疫亲和色谱材料与针对γ-羧基谷氨酸的结合部分偶联；(b)洗脱所述因子IX；和(c)选择获自所述洗脱的级分，其中所述级分中的多肽具有所需的γ-羧基谷氨酸含量；其特征在于，所述样品中因子IX的总浓度超过免疫亲和色谱材料的结合能力。

权利要求书一种方法，所述方法用于从包含蛋白质/多肽种类的混合物的样品中将具有不同γ‑羧基谷氨酸含量的蛋白质/多肽的组合物纯化为具有所需γ‑羧基谷氨酸含量的蛋白质/多肽，所述蛋白质/多肽种类具有不同的γ‑羧基谷氨酸含量，所述方法包括以下步骤：
(a) 将所述蛋白质/多肽样品加入免疫亲和色谱材料中，所述免疫亲和色谱材料与针对γ‑羧基谷氨酸的结合部分偶联；
(b) 洗脱所述蛋白质/多肽；和
(c) 选择获自所述洗脱的级分，其中所述级分中的蛋白质/多肽具有所需的γ‑羧基谷氨酸含量；
其特征在于，所述样品中蛋白质/多肽的总浓度超过所述免疫亲和色谱材料的结合能力。
 权利要求1阐述的方法，其中所述蛋白质/多肽为因子IX。
 前述权利要求中任一项的方法，其中超过所述免疫亲和色谱材料结合能力的大于100、105、110、115、120、125、130、140、150、200、250、500、750或1000%中的任一个，特别地大于120%、或大于150%、或大于250%。
 权利要求3阐述的方法，其中超过所述免疫亲和色谱材料结合能力的100‑400%，例如100‑200%，特别为100‑150%。
 权利要求1‑4的方法，其中所述方法包括选择获自所述洗脱的级分，与纯化样品中因子IX的#1‑11‑Gla和/或#1‑12‑Gla形式的比例相比，所述级分中因子IX的#1‑11‑Gla和/或#1‑12‑Gla形式的比例增加。
 权利要求5的方法，其中所述方法包括选择获自所述洗脱的级分，与纯化样品中因子IX的#1‑10‑Gla形式的比例相比，所述级分中因子IX的#1‑10‑Gla形式的比例降低。
 前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液和/或平衡缓冲液具有5.0至8.0之间的pH，例如7.5。
 前述权利要求中任一项的方法，其中氯化钠以10 mM至100 mM之间的浓度，例如50 mM存在于洗脱缓冲液中。
 前述权利要求中任一项的方法，其中针对Gla的结合部分包含Gla‑定向抗体。
 权利要求9的方法，其中在钙、镁或其它二价阳离子存在时所述抗体对Gla结构域的折叠敏感和/或所述抗体识别包含特异性Gla残基的表位。
 权利要求9的方法，其中所述Gla‑定向抗体包含3F14A3B6(SEQ ID NOS：1和2)。
 前述权利要求中任一项的方法，其中所述免疫亲和材料包含琼脂糖珠，例如预‑活化的琼脂糖珠，特别为CNBr‑Sepharose 4 FF。
 前述权利要求中任一项的方法，其中所述平衡缓冲液和洗涤缓冲液额外地包含钙离子，例如氯化钙。
 权利要求13的方法，其中所述钙离子以大于0.5 mM (例如，大于0.5、1.0、1.5或2.0 mM氯化钙，例如3.0、5.0、8.0或10.0 mM氯化钙，特别地2或5 mM氯化钙)的浓度存在，或所述钙离子以0.5‑10 mM、1‑8 mM、1‑5 mM、和2‑5 mM的范围存在。
 前述权利要求中任一项的方法，其中基于免疫亲和的超载方法可与第二步骤组合，在第二步骤中使用基于阴离子色谱的方法进一步分离/纯化Gla种类。

说明书凝血因子的纯化
发明领域
本发明涉及蛋白质/多肽特别是维生素K依赖性凝血因子例如因子IX(FIX)的γ羧化形式的纯化。特别地，本发明涉及利用免疫亲和色谱的方法，通过该方法可纯化蛋白质/多肽特别是维生素K依赖性凝血因子例如因子IX(FIX)的不同的γ羧化形式。
发明背景
凝血是包括多种血液组分或因子的复杂相互作用的过程，这最终导致血纤蛋白凝块。通常，参与被称为凝血“级联”的血液组分为酶原(proenzyme或zymogen)，即通过激活剂的作用而被转变为蛋白水解酶的无酶活的蛋白，所述激活剂本身为活化凝血因子。经过所述转变后的凝血因子通常情况下称作“活性因子”，并通过加上小写“a”后缀来命名(例如因子VIIa)。
需要活化因子X("Xa")来将凝血酶原转变为凝血酶，其随后将血纤蛋白原转变为血纤蛋白，这作为形成血纤蛋白凝块的最后阶段。有两个系统或途径促进因子X的活化。“内源途径”是指通过利用仅存在血浆中的因子而致使凝血酶生成的那些反应。一系列由蛋白酶介导的活化最终生成因子IXa，其与因子VIIIa一起将因子X裂解为因子Xa。相同的蛋白水解通过在凝血的“外源途径”中的因子VIIa与其辅因子，组织因子来实现。组织因子为膜结合蛋白，并且通常不在血浆内循环。然而当血管破裂时，在Ca2+与磷脂存在下，其可与因子VIIa复合以催化因子X活化或因子IX活化。两种凝血途径在止血中的相对重要性尚不明确。
因子IXa (FIXa)是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其通过生成作为X酶复合物一部分的大多数因子Xa而在止血过程中发挥关键作用，凝血期间需要所述因子Xa来支持凝血酶的正确生成(Hoffman M.和Monroe D. M., III (2001) A cell‑based model of hemostasis. Thromb Haemost 85, 958‑965中的综述)。因子IXa活性的先天性缺乏是X‑连锁的出血障碍血友病B的原因，所述血友病B影响约1:100,000的男性。这些血友病患者目前通过用重组或血浆‑来源的凝血因子IX的替代疗法来治疗。
因子IX为维生素K依赖性凝血因子，其在结构上与因子VII、因子X和蛋白C相似。血浆半衰期为约18至30小时的循环的酶原形式由415个氨基酸组成，其可分为4个不同的结构域，所述结构域包括N末端的富含γ‑羧基谷氨酸(Gla)结构域，两个EGF结构域，和C末端胰蛋白酶‑样丝氨酸蛋白酶结构域。因子IX的活化通过以下而发生：在Arg145‑Ala146和Arg180‑Val181的限制性蛋白水解释放35个氨基酸的片段，即所谓的激活肽(Schmidt A. E.和Bajaj S. P. (2003) Structure‑function relationships in Factor IX and Factor IXa. Trends Cardiovasc Med 13, 39‑45)。此激活肽高度糖基化，其包含两个N连接和多达4个O连接聚糖。
γ‑羧基谷氨酸(Gla)是与钙结合的独特氨基酸。其为谷氨酸(Glu)的修饰形式，可通过谷氨酸残基的翻译后修饰在体内产生。这种方式的谷氨酸羧化使钙结合成为可能，并允许蛋白质例如前凝血剂和抗凝剂与磷脂连接。这一酶介导的反应，被称为γ‑羧化(伽马羧化)，需要维生素K作为辅因子。
一些成熟的蛋白质包含富含以所述方式转变为γ‑羧基谷氨酸的氨基酸的结构域。其被称为GLA结构域。所述GLA结构域往往导致蛋白质对钙离子的高亲和力结合。这样的GLA结构域可存在于多种不同的蛋白质中。例如，凝血因子VII、IX和X和凝血酶原均包含含有若干Gla氨基酸残基的GLA结构域。
Van Cott等(1996) Journal of Molecular Recognition 9, 407‑414描述了重组人蛋白C的生物学活性和无活性形式的亲和纯化。
重组生产中FIX的Gla结构域中12个Glu残基的完全γ‑羧化是主要的难题。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产的FIX显示约50%的FIX比活，该活性水平与细胞系表达的FIX的γ‑羧化程度相关。因此有必要开发下游分离方法以去除具有欠佳的γ‑羧化的Gla结构域的FIX种类。
发明概述
本发明人发现分离或纯化不同种类的因子IX是可能的，其中不同种类中γ羧化的量不同或其包含的γ羧基谷氨酸残基数目不同。本发明特别地论述了具有不同γ‑羧基谷氨酸含量的因子IX种类的色谱分离。
因此，本发明提供一种方法，所述方法用于从包含所述因子IX种类(其具有不同γ‑羧基谷氨酸含量)的混合物的样品中纯化具有所需γ‑羧基谷氨酸含量的因子IX的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 将所述因子IX样品加入含有偶联抗体的免疫亲和色谱材料中，所述偶联抗体具有针对γ‑羧基谷氨酸的结合部分；
(b) 洗脱所述因子IX；和
(c) 选择获自所述洗脱的级分，其中该级分中的因子IX多肽具有所需的γ‑羧基谷氨酸含量；
其特征在于，所述样品中因子IX的总浓度超过免疫亲和色谱材料的结合能力。
所述方法可包括选择获自所述洗脱的级分，所述级分与纯化样品中因子IX 的#1‑11‑Gla和/或#1‑12‑Gla形式的比例相比，其因子IX的#1‑11‑Gla和/或#1‑12‑Gla形式的比例增加。
所述方法也可包括选择获自所述洗脱的级分，所述级分与纯化样品中因子IX的#1‑10‑Gla形式的比例相比，其因子IX的#1‑10‑Gla形式的比例下降。
本发明也延伸至通过如本文所述方法获得的因子IX配方(formulation)，即改变了一种或多种因子IX的量的配方，其中种类之间γ羧化程度不同或其包含的γ羧基谷氨酸残基数目不同。
附图简述
图1A显示了标出亚域的人因子IX的一级结构。GLA结构域存在于氨基酸1‑46；EGF1结构域存在于氨基酸47‑83，EGF2结构域存在于氨基酸84到124，活化肽存在于氨基酸146到180，蛋白酶结构域存在于氨基酸181到415。Gla结构域中可能发生γ‑羧化的12个氨基酸标记为“γ”，位于氨基酸7、8、15、17、20、21、26、27、30、33、36和40。
图1B显示了人因子VII、因子IX和因子X多肽的部分氨基酸序列的比对。这些比对来源于这些多肽中每一个的GLA结构域且Gla残基的位置显示为*。
图2显示了如在实施例1描述的ELISA测定中评估的FIX Gla#1‑8 – #1‑12与Gla‑定向的(Gla‑directed) mAB 3F14A3B6的钙依赖性结合。 
图3显示了从实施例2所描述的FIX样品的免疫亲和色谱中获得的色谱图。
发明详述
本发明来源于以下发现：γ羧化水平不同的因子IX种类可具有不同的活性水平且这些不同种类可用免疫亲和色谱纯化或分离。通过增加较高活性因子IX种类的比例，和/或通过降低样品中较低活性或无活性因子IX种类的比例，这可导致产生具有增加的比活的纯化的配方。
特别地，图1A显示了人因子IX蛋白质的一级结构。所述蛋白质在氨基酸1到46包含GLA结构域。该结构域包含12个可由谷氨酸修饰为Gla的氨基酸残基。其位于位置7、8、15、17、20、21、26、27、30、33、36和40。因此能够包含多达12个Gla残基。因此依照本发明纯化的多肽为因子IX。图1B显示了基于人因子VII、IX和X蛋白的Gla结构域的比对。各序列中可由谷氨酸修饰为Gla的氨基酸残基的位置被标记为*。
将理解的是，本发明的纯化方法可同样地适用于包含来自已知γ羧化蛋白的GLA结构域的多肽。已知若干包含GLA结构域的多肽。若干凝血和调节蛋白，包括凝血酶原、因子VII、因子IX、因子X、凝血酶原、蛋白C和蛋白S，包含Gla残基。这些蛋白在GLA结构域中可包含10到12个γ羧基谷氨酸残基，且位于成熟蛋白质N‑末端的起始40个残基内。骨蛋白例如骨钙蛋白和基质Gla蛋白以及其它哺乳动物维生素K依赖性蛋白质例如生长停滞‑特异性‑6 (Gas6)、蛋白Z、脯氨酸‑富含‑Gla‑1 (PRGP1)、脯氨酸‑富含‑Gla‑2 (PRGP2)、脯氨酸‑富含‑Gla‑3 (PRGP3)和脯氨酸‑富含‑Gla‑4 (PRGP4)也包含多个Gla残基。γ羧基谷氨酸残基亦存在于非‑哺乳动物蛋白质，例如芋螺肽(conopeptide)芋螺多肽G (Conantokin G)和芋螺多肽T (Conantokin T)中。这些多肽的任一种均可依照本发明纯化。
如下文进一步论述的，本发明的方法允许纯化不同分子种类的因子IX，其中存在不同水平的γ羧化。此处提到的数目为因子IX中可存在的Gla残基总数。即，如果因子IX完全γ羧化，则这些数目表示存在的Gla残基数目。例如，当γ羧化发生在GLA结构域时，这些数目指的是在该GLA结构域中可能的γ羧化位点的总数，例如翻译的因子IX中Glu残基总数或可通过酶例如γ‑谷氨酰羧化酶作用生成的Gla残基的最大数目。也可存在同一因子IX实体的附加种类，其中与所述最大值相比存在较少的γ羧基谷氨酸残基。
因此因子IX在其翻译的氨基酸序列N‑末端的40个残基中可包含多个Glu残基。例如，表达的因子IX的氨基酸序列在与因子IX的N末端最邻近的40个氨基酸中或在与成熟蛋白质的N末端最邻近的40个氨基酸中可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个Glu残基。
γ羧化可使用酶实现。已知这种γ‑谷氨酰羧化酶涉及体内多种多肽的γ羧化。γ‑谷氨酰羧化酶为内质酶，其催化若干维生素K依赖性凝血因子的GLA结构域中Glu到Gla的翻译后修饰。因此本发明中使用的因子IX多肽可通过用γ‑谷氨酰羧化酶确定其是否被γ羧化来鉴定。
认为γ‑谷氨酰羧化酶通过待羧化的谷氨酸残基氨基末端侧的序列基序来结合其底物蛋白。随后该酶可羧化该区域的多个谷氨酸残基，例如GLA结构域的所有谷氨酸残基，然后释放底物。因此本发明中使用的因子IX多肽可包含被γ‑谷氨酰羧化酶或另外的能够进行γ羧化的酶识别的基序或位点。该识别位点可位于因子IX的N‑末端区域，例如在与所翻译的因子IX的N末端或成熟蛋白N末端最邻近的18、19、20、21、22、23、24、25、30、35或40氨基酸中。识别位点可位于待羧化的谷氨酸残基的氨基末端侧(terminal side)。例如，在许多天然存在的γ羧化的蛋白质中，γ‑谷氨酰羧化酶识别并结合前肽区的位点。该区域随后在翻译后加工期间从因子IX的剩余部分裂解。因此成熟蛋白质中可能不存在γ羧化酶识别位点。
在因子IX中，涉及γ‑谷氨酰羧化酶识别的位点被确定为残基‑18、‑17、‑15、‑15和‑10。在其它γ羧化的蛋白质中存在类似的识别位点。羧化酶底物的前肽中‑16位的苯丙氨酸和‑10位的丙氨酸是非常保守的，‑17和‑15位为脂肪族残基例如异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸也一样。‑16位的亮氨酸、缬氨酸或赖氨酸也可支持羧化。将理解的是，本发明方法可同样适用于以下多肽的纯化：其包含来自已知γ羧化蛋白质的γ羧化识别位点，例如来自因子IX、因子X、因子VII或任一其它已知的γ羧化蛋白质的γ羧化识别位点。例如，来自任何所述包含γ羧化识别位点的蛋白质的前肽区可存在于翻译多肽的N末端，以允许γ‑谷氨酰羧化酶对该多肽进行适宜的翻译后加工。
为了进行因子IX的γ羧化，优选在细胞中表达因子IX。本发明中使用的因子IX可通过在这样的细胞中表达合成。优选地，表达因子IX的细胞包含必需的细胞机器以允许因子IX的γ羧化。例如，所述细胞可表达γ‑谷氨酰羧化酶。合成因子IX的细胞优选具有与粗面内质网相关的γ羧化酶。细胞可在酶辅因子例如维生素K存在时培养。优选合成因子IX的细胞包含胞内的维生素K。
本发明的方法涉及从具有不同γ羧化程度的其它种类的因子IX中纯化一种或多种因子IX。当因子IX可在多于一个位点被γ羧化时，可存在不同种类的因子IX，其中存在不同数目的γ羧基谷氨酸氨基酸残基，或其中γ羧基谷氨酸残基存在于因子IX分子内不同的可能位置。
例如，一些种类的因子IX可被完全γ羧化。即，γ羧化在因子IX中所有可能的残基处将谷氨酸转变为γ羧基谷氨酸，例如在GLA结构域中的所有Glu残基处。其它种类的因子IX可被部分γ羧化。即，γ羧化在因子IX中可能的一些但不是全部残基处将谷氨酸转变为γ羧基谷氨酸，例如在GLA结构域的一些但并非全部Glu残基处。
可鉴定多种不同的部分γ脱羧种类。其可按多种方式分类。例如，γ脱羧的水平可通过因子IX中被γ脱羧的残基定义，或可通过多肽中存在的γ羧基谷氨酸氨基酸总数定义。后面的分类可意味着基于其包含的γ羧基谷氨酸残基总数，若干结构不同的因子IX分子种类被归为一起。例如只存在一个可能的γ羧基谷氨酸残基的因子IX种类中可包含多个不同的因子IX亚种，其中谷氨酸保留在可能已被γ羧化的不同位置。
由于γ‑谷氨酰羧化酶的作用机理，γ羧化通常起始于与γ羧化识别位点最邻近的Glu残基并向远离因子IX N末端的方向前进。当因子IX未被完全γ羧化时，这通常因为在将最远的Glu残基转变前，γ羧化停止或酶从因子IX释放。在部分γ羧化的因子IX中通常是距γ羧化结合位点最远或距因子IX N末端最远的Glu残基不被γ羧化。
例如，如图1所示，人因子IX包含多达12个γ羧基谷氨酸残基。不同的多肽分子中Gla残基存在的实际数目不同，这取决于分子经受的γ羧化的翻译后修饰程度。这意味着人因子IX样品可包含完全γ脱羧的因子IX种类，即具有全部的12个可能的γ羧基谷氨酸残基(#1‑12Gla）。
其也可包含具有可能的12个γ羧基谷氨酸残基中的11个的一种或多种因子IX。其中，最有可能的情况是与多肽N末端最邻近的11个Glu残基转变为Gla，但如图1所示40位的第12个Glu残基依然为Glu。因此，在这种情况下，只有Glu残基1到11转变为Gla(#1‑11Gla)。
其也可包含具有可能的12个γ羧基谷氨酸残基中的10个的一种或多种因子IX。其中，最有可能的情况是与多肽N末端最邻近的10个Glu残基转变为Gla，但如图1所示36和40位的第11和12个Glu残基依然为Glu。因此，在这种情况下，只有Glu残基1到10转变为Gla(#1‑10Gla)。
其也可包含具有可能的12个γ羧基谷氨酸残基中的9个的一种或多种因子IX，例如#1‑9Gla。也可包含如下的一种或多种因子IX：具有可能的12个γ羧基谷氨酸残基中的少于9个，例如8、7、6、5、4、3、2、1个或没有一个。
本发明提供用于纯化所述因子IX种类的方法。特别地，可与样品中其它因子IX种类相关来纯化因子IX种类。因此，本发明的方法可导致因子IX样品中目的种类的相对比例增加。这可通过从样品中去除一个或多个不同种类的因子IX来实现，并因此增加由目的种类形成的因子IX整体的比例。这可通过以下实现：从样品中特异性去除一个或多个特定种类，从样品中去除一个或多个非目的种类的种类，或通过去除其中目的种类比例低于原始样品的目的种类比例的样品级分。这些方法的任一种可导致目的种类比例的总体增加。因此本发明方法可导致包含不同种类因子IX混合物的样品中特定种类的因子IX比例增加或降低。
一种因子IX比例的增加可为作为整体的因子IX样品中该种类的比例增加多达5%、多达10%、多达20%、多达30%或更多。一种因子IX比例的降低可为作为整体的因子IX样品中该种类的比例降低多达5%、多达10%、多达20%、多达30%、多达50%、多达70%、多达90%或更多。一种因子IX比例的降低可为与原始样品中存在的量相比该种类存在的量降低多达5%、多达10%、多达20%、多达30%、多达50%、多达70%、多达90%或更多。一种因子IX比例的降低可为从该样品中完全或基本去除该种类。例如，本发明的方法可通过从样品中去除全部或基本上全部可检测到的某特定种类因子IX来纯化因子IX样品。保留在样品中的该种类的量可为原始样品中存在量的小于10%、小于5%、小于2%或小于1%。
因此本发明方法的目的为允许改变因子IX样品中不同种类的相对比例。不同种类可具有不用性质或不同活性。通过改变因子IX样品中所述种类的量或比例，作为整体的样品的性质或活性可被改变。例如，当因子IX的不同种类具有不同的活性水平时，通过改变不同种类的比例以增加具有较高活性水平的种类的比例和/或通过降低具有较低或无活性的种类的比例，可提高样品的比活，例如每个因子IX分子的平均活性或对所述量的因子IX而言最大可能活性的百分比。
例如，已发现重组产生的人因子IX(rhFIX)显示约50%的比活。对所述样品的分级分离显示其包含独特的rhFIX种类，其主要为#1‑8‑、#1‑9‑、#1‑10‑、#1‑11‑和#1‑12‑Gla。血块测定和2‑期活性测定已发现#1‑11‑和#1‑12‑Gla完全活化。#1‑8‑、#1‑9‑和#1‑10‑Gla种类显示降低的活性，降低至约2‑5%、14‑22% 和27‑36%，这取决于所使用的测定法。
因此可以看出不同种类的rhFIX(只有γ羧化的程度不同)显示不同的活性水平。预期#1‑11‑和/或#1‑12‑Gla比例较高的样品与这些种类比例较低的样品相比具有较高的比活。预期#1‑8‑和/或#1‑9‑和/或#1‑10‑Gla比例较高的样品与这些种类比例较低的样品相比具有较低的比活。
因此，通过改变样品内这些种类的比例可改变因子IX样品的总体比活。在这种情况下，可以预见通过以下的任一种或多种可增加因子IX样品的总体比活：
增加样品中#1‑12‑Gla的比例；
增加样品中#1‑11‑Gla的比例；
降低样品中#1‑10‑Gla的比例；
降低样品中#1‑9‑Gla的比例；
降低样品中#1‑8‑Gla的比例；
降低样品中#1‑7‑Gla的比例；
降低样品中#1‑6‑Gla的比例；
降低样品中#1‑5‑Gla的比例；
降低样品中#1‑4‑Gla的比例；
降低样品中#1‑3‑Gla的比例；
降低样品中#1‑2‑Gla的比例；和
降低样品中#1‑1‑Gla的比例；
当依照本发明纯化因子IX样品时可选择这些改变中的任一种或多种。
优选因子IX样品仅包含#1‑11‑Gla和#1‑12‑Gla，且没有或基本上没有比这些γ羧化程度低的种类，例如#1‑10‑、#1‑9‑和#1‑8‑Gla种类。
该方法可适用于现有的hFIX组合物。可以看出本文描述的方法可用于增加该组合物中#1‑11‑Gla和/或#1‑12‑Gla的比例。本文描述的方法可用于降低该配方中较少被γ羧化的种类例如#1‑10‑Gla、#1‑9‑Gla和#1‑8‑Gla的比例。预期这将提高该配方中hFIX的比活。
可关于其它包含Gla的多肽来使用类似方法。例如，因子VII和因子X可包含多达11个Gla残基。
因此本发明提供允许从其它种类的因子IX中纯化某一种因子IX的方法，其中各种类γ羧化的程度不同或其氨基酸序列中Gla残基的数目不同。
本发明的方法基于免疫亲和色谱。本发明尤其涉及以下方法：其中因子IX与包含与珠偶联的GLA‑定向抗体的免疫亲和材料结合，并用缓冲液从免疫亲和材料中洗脱因子IX。
免疫亲和材料意指与色谱树脂偶联的GLA‑定向抗体。因此所述免疫亲和材料具有用于γ‑羧化残基的抗体或抗体来源的结合基序。所述抗体可与固相连接。所述固相可为，例如，纯化柱，颗粒或珠，膜或滤器。可如本文所描述来使用的市售偶联材料包括，例如CNBr Sepharose™ Fast Flow、NHS Sepharose™ Fast Flow、Epoxy Sepharose™ 6B、Thiol Sepharose™ Fast Flow、EAH Sepharose™ Fast Flow、Epoxy Poros® EP、Aldehyde Poros® AL、Epoxy Poros® EP和Hydroxylated Poros® OH。
例如，本发明因子IX的纯化通常包含与针对Gla的结合部分(即FIX抗体3F14A3B6)偶联的Sepharose FF亲和材料(即CNBr Sepharose 4 FF)。
将理解的是，本发明基于亲和色谱方法，其主要指利用配体相互作用来纯化靶蛋白。因此，术语亲和指但不限于配体和靶蛋白间的特异性分子相互作用。所述相互作用可依赖该蛋白或配体的特定折叠状态。可按如上所述将配体固定于树脂。使用的树脂包含固定于合适的色谱珠的针对Gla的结合部分。在一个实施方案中，针对Gla的结合部分包含Gla定向抗体。在该实施方案中，抗体识别的表位为折叠的Gla结构域，意想不到地表明其只存在于具有#1‑8‑Gla或更高的FIX种类中。将理解的是，通过确定所述样品中因子IX的总浓度超过免疫亲和色谱材料的结合能力来确定免疫亲和柱超载。例如，超载概念指加入柱中的FIX量高于目的柱的FIX容量。
在一个实施方案中，超过所述免疫亲和色谱材料结合能力的大于100、105、110、115、120、125、130、140、150、200、250、500、750或1000 %中的任一个，特别为大于120%(即122%)或大于150%(即170%)或大于250%(即334%)。在又一实施方案中，超过所述免疫亲和色谱材料结合能力的大于100%但小于500%，即小于450、400、350、300、250、200或150% (或其中间的任何范围，例如100‑400%、100‑200%或100‑150%)中的任一个。根据本发明的备选方面，提供从包含所述多肽种类(其具有不同γ‑羧基谷氨酸含量)的混合物的样品中纯化具有所需γ‑羧基谷氨酸含量的多肽的方法。所述方法包括以下步骤：
(a) 将所述多肽样品加入与针对γ‑羧基谷氨酸的结合部分偶联的免疫亲和色谱材料；
(b) 洗脱所述多肽；和
(c) 选择获自所述洗脱的级分，其中该级分中的多肽具有所需的γ‑羧基谷氨酸含量；其特征在于，所述样品中多肽的总浓度超过免疫亲和色谱材料结合能力的100‑400%。在本发明备选方面的一个实施方案中，所述多肽为因子IX、VII或X，例如因子IX。在本发明备选方面的一个实施方案中，免疫亲和色谱材料的结合能力低于350、300、250、200或150% (或其间的任何范围，例如100‑200%或100‑150%)中的任一个。
本发明的免疫亲和色谱方面的另外优势为很纯的FIX与非常低量的活化FIX(FIXa)的一致递送。
本发明中可使用的Gla‑定向抗体的实例包括Liebman HA (1993) Eur. J. Biochem. 212: 339‑345，Liebman HA等(1987) J. Biol. Chem. 262: 7605‑7612和Gillis S等(1997) Protein Sci. 6:185‑96中所描述的那些。在一个实施方案中，Gla定向抗体为3F14A3B6。名称3F14A3B6是指产生单克隆抗体的杂交瘤克隆。产生FIX Gla‑定向单克隆抗体的3F14A3B6杂交瘤克隆通过筛查杂交瘤库来鉴定，所述杂交瘤库从获自FIX免疫小鼠并与永生化小鼠骨髓瘤细胞系融合的脾细胞而建立。收集杂交瘤细胞并使用市售RNA和cDNA制备试剂盒分离总RNA并将其用于制备cDNA。因此获得了克隆3F14A3B6‑LC和3F14A3B6‑HC的cDNA序列。由测序数据确定抗‑FIX抗体为鼠IgG1抗体。SEQ ID NOS: 1和2分别显示了对应于3F14A3B6‑HC和3F14A3B6‑LC的cDNA序列的氨基酸序列。基于该序列，进行标准瞬时和稳定重组的表达。使用常规基于蛋白‑A的亲和色谱纯化抗体，并通过在适当缓冲液中例如0.1 M Na2CO3、0.5 M NaCl，pH 8.3中进行配制来制备抗体用于树脂偶联。
超载原则(principal)的有效性将依赖于本发明使用的抗体或抗体衍生物，例如Fab或scFv片段识别的Gla结构域中的特异性表位。优选用于本发明的抗体为在钙、镁或其它二价阳离子存在时对Gla结构域的折叠敏感的抗体，和/或识别包含特异性Gla残基的表位的抗体。实例可为FIX，其中抗体的表位识别Gla#1、Gla#2、Gla#3、Gla#4、Gla#5、Gla#6、Gla#7、Gla#8、Gla#9、Gla#10、Gla#11或Gla#12，或具有任何所提及Gla残基的和/或其它邻近(nabouring)非‑Gla残基的重叠。特别地对于凝血因子，定向于Gla结构域的钙‑依赖性抗体通常可分为两类：(I)对钙绝对需求的抗体，和(II)可用镁或其它二价阳离子取代钙且不损害其结合的抗体(Liebman, H.A.等(1987) JBC 262: 7605‑7612)。结构研究显示I类抗体结合到Gla‑结构域的N‑末端部分，而II类结合到C‑末端部分。NMR波谱学证明钙能够诱导整个Gla结构域的折叠，而镁只支持EGF1结构域附近远端部分的折叠并使N‑末端ω‑环未结构化(unstructured)，由此合理解释了表位定位到Gla结构域的不同区域(Freedman, S.J等(1996) JBC 271: 16227‑16236; Freedman, S.J等(1995) JBC 270: 7980‑7987; Huang, M等(2004) JBC 279: 14338‑14346)。
当超载原则用于抗体3F14A3B6时，FIX Gla种类#1‑8 ‑ #1‑10可被FIX Gla种类#1‑11 ‑ #1‑12取代。当在适当的洗涤步骤后最终洗脱柱时，与未超过柱容量时的程序相比，低FIX Gla种类#1‑8 ‑ #1‑10的总量显著减少。在一个实施方案中，将Gla‑定向抗体(即3F14A3B6)固定在琼脂糖珠上，例如预‑活化的琼脂糖珠，特别是CNBr‑Sepharose 4 FF。
常规的免疫亲和色谱纯化方法通常由选自以下的一个或几个步骤组成：免疫亲和材料的平衡；上样或加样；一个或多个洗涤步骤；洗脱和免疫亲和材料的再生。亲和色谱的标准方法可参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences。
优选在加入因子IX样品之前平衡免疫亲和树脂。该平衡步骤的目的是调整免疫亲和材料的条件使其更近似于所述方法后续步骤中所使用的条件。为避免色谱期间流动相组成的变化，应将免疫亲和材料平衡至起始缓冲液的pH和离子组成(例如电导率、缓冲液组成)。例如，可选择平衡缓冲液的离子强度(例如电导率、pH)，以与所述方法后续步骤中使用的缓冲液(例如用于加入多肽的缓冲液和/或洗涤缓冲液)的离子强度尽可能地相似。
因此可用这样的缓冲液来平衡免疫亲和材料，其严密基于后续步骤中使用的缓冲液或配方。例如，可使用相同的缓冲液来平衡免疫亲和材料和加样。可使用相同的缓冲液来平衡免疫亲和材料和加样后洗涤免疫亲和材料。平衡缓冲液可具有与加样配方(loading formulation)和/或洗涤缓冲液相同的pH。平衡缓冲液可具有与加样配方和/或洗涤缓冲液相同的电导率。平衡缓冲液可使用与加样配方和/或洗涤缓冲液相同的缓冲物质。平衡缓冲液可具有与加样配方和/或洗涤缓冲液相同的缓冲物质浓度。平衡缓冲液可包含亦存在于加样配方和/或洗涤缓冲液中的附加组分，例如去污剂。
可根据待纯化的特定多肽确定平衡缓冲液的pH。例如，对于若干多肽例如因子IX，9.0或更高的pH不是最佳的，因为在这些pH值时可观察到该多肽的自体活化和/或降解。
本发明使用的平衡缓冲液可配制为，例如pH约5.0‑约8.5，例如pH 5.0‑pH 8.5。平衡缓冲液的pH可大于约5.0、大于约5.5、大于约6.0、大于约6.5、大于约7.0、大于约7.5或大于约8.0。平衡缓冲液的pH可小于约8.5、小于约8.0、小于约7.5、小于约7.0、小于约6.5、小于约6.0或小于约5.5。可组合这些终点的任何组合。例如平衡缓冲液的pH可大于约7.0且小于约8.5。pH可为，例如，约pH 7.0、7.5、8.0或8.5，例如约7.5。
这些pH值可适合于用于纯化本文所描述多肽(例如因子IX、因子VII或因子X)的免疫亲和材料的平衡。
用于平衡缓冲液合适的组分可包括缓冲物质，例如Tris、磷酸盐、MES、Hepes或碳酸盐。可使用这样的缓冲物质将平衡缓冲液维持在如上所定义的pH。在一个实施方案中，免疫亲和色谱程序自始至终使用相同的缓冲物质和缓冲物质浓度。例如，平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液均可包含相同缓冲物质浓度下的相同缓冲物质。免疫亲和程序期间缓冲物质浓度应足以维持缓冲能力和恒定的pH。例如，可选择缓冲物质和缓冲物质浓度以维持上样期间和洗脱期间稳定的pH和缓冲能力。合适的缓冲物质浓度可为，例如，5 mM至50 mM之间，例如10 mM至40 mM之间。合适的缓冲物质浓度可为，例如，5 mM、10 mM、15 mM、20 mM或25 mM，例如20 mM。
平衡缓冲液可包含一种或多种附加组分。平衡缓冲液可包含添加剂，例如乙二醇、乙醇、尿素或用以增加蛋白溶解度的去污剂。可使用浓度为例如，小于1%、小于0.5%、小于0.1%或小于0.01%的非‑离子型去污剂例如吐温80、吐温20或Triton X100。可使用非‑缓冲盐，例如NaCl调整缓冲液的离子强度。
在一个实施方案中平衡缓冲液额外地包含钙离子，例如氯化钙。在一个实施方案中，钙离子以大于0.5 mM(例如大于0.5、1.0、1.5或2.0 mM的氯化钙，例如3.0、5.0、8.0或10.0 mM氯化钙，特别为2或5 mM氯化钙)的浓度存在。在其它实施方案中，钙离子以0.5‑10 mM、1‑8 mM、1‑5和2‑5 mM的范围存在。如本文实施例2中呈现的数据所证明的，这些数据表明与种类#1‑11 ‑ #1‑12相比，种类#1‑8 ‑ #1‑9显示高度降低的协同性和增加的钙依赖性。这些数据可以以使超载产生甚至更好的Gla概况(profile)的方式与超载原则组合。
将包含因子IX的样品加入免疫亲和材料。这通过以下实现：在适当的条件下(例如存在钙、电导率和/或pH)将样品暴露于免疫亲和材料，使得因子IX固定在免疫亲和材料中或免疫亲和材料上。该固定化或结合通过因子IX的GLA结构域的钙特异性折叠和GLA‑特异性抗体3F14A3B6实现。该结合只在GLA结构域充分折叠时发生。
本发明方法中待纯化样品可为包含如上所描述的因子IX的任何样品。优选样品包含相同多肽的一个以上的不同种类，其中种类间γ羧化的程度和/或位置不同。
如上文提到的，可使用任何常规程序获得因子IX。例如，因子IX可获自体内来源，例如来自动物，或可体外产生，例如在组织或细胞中产生。因子IX可重组产生，例如通过诱导细胞中因子IX的表达。例如，可在用编码且能够表达因子IX的多核苷酸转化或转染的宿主细胞中产生因子IX。这样的宿主细胞可在允许因子IX表达的条件下培养。随后可从培养基或宿主细胞自身中回收因子IX。
因子IX可在上样到免疫亲和树脂前纯化。例如，因子IX可经受一个或多个纯化步骤例如沉淀、免疫沉淀、等电聚焦、过滤、离心或色谱例如阴离子或阳离子色谱。
例如，所描述的使用基于免疫亲和的超载方法纯化包含Gla结构域的蛋白质/多肽的发明可与第二步骤组合，在第二步骤中使用基于阴离子色谱的方法进一步分离/纯化Gla种类。一种这样的方法可例如为利用乙酸铵进一步分离蛋白质/多肽Gla种类的方法，所述蛋白质/多肽Gla种类例如为用基于免疫亲和超载方法未完全分离的。具体实例可为首先用基于免疫亲和的超载方法，然后使用与包含例如乙酸铵、氯化铵、乙酸钠或氯化钠的洗脱液组合的阴离子色谱方法纯化的FIX Gla种类，与每个方法单独所获得的Gla概况相比，其中低Gla种类，例如Gla#1‑12、Gla#2‑12、Gla#3‑12、Gla#4‑12、Gla#5‑12、Gla#6‑12、Gla#7‑12、Gla#8‑12和Gla#9‑12的含量与高Gla种类，例如Gla#10‑12、Gla#11‑12或Gla#12‑12甚至进一步分离。
可使用这种纯化从样品中部分或全部地去除一种或多种污染物，从而增加因子IX的纯度。污染物可为非因子FIX的任何分子。例如，污染物可为不同的多肽、核酸或内毒素。污染物可为因子IX的变体，例如截短的或延长的多肽、因子IX的脱酰胺化形式、错误折叠的多肽或具有不希望的糖基化的多肽形式。污染物可为可能干扰免疫亲和色谱的分子。
优选因子IX为至少75%纯，更优选至少80%、至少90%或更多。最优选因子IX为至少90%纯，例如至少95%、至少97%或至少99%纯。
纯度意欲指因子IX构成的总干重的比例。样品可包含少于25%重量的如上所述的污染物，例如少于25%重量的非因子IX的蛋白，更优选少于20%、少于10%。少于5%、少于3%或少于1%。样品可为纯的或基本上纯的因子IX样品。样品可为分离的或基本上分离的因子IX样品。
这样的因子IX样品可以以直接自因子IX合成获得的形式上样到免疫亲和材料，所述形式例如为来自重组产生因子FIX的细胞培养基的样品或表达因子IX的裂解细胞样品。因子IX样品可以以如本文所描述的纯化或部分纯化的形式上样到免疫亲和材料。可进一步配制本文所描述的样品，然后上样到免疫亲和材料。例如，当以固体形式提供因子IX(或纯化的因子IX)时，其可配制为液体组合物以上样到免疫亲和材料。例如，其可在水、缓冲液或另外的溶剂中配制。优选地，液体组合物为含水的。当以液体或含水形式提供因子IX或纯化的因子IX时，或当固体因子IX样品被配制为如上所述的液体形式时，可在将其上样到免疫亲和材料前调整样品的配方。
例如，可使用常规方法调整样品或经配制样品(例如具有添加的钙)的电导率和/或pH。可调整样品的pH至与用于免疫亲和材料平衡和/或免疫亲和材料洗涤的缓冲液相同或基本上相同。可调整样品的电导率至与用于免疫亲和材料平衡和/或免疫亲和材料洗涤的缓冲液相同或基本上相同。可用缓冲物质，例如上文所论述的与平衡缓冲液的组成相关的缓冲物质中的任一种来配制样品。样品可用与用于免疫亲和材料平衡和/或免疫亲和材料洗涤相同的缓冲液配制。样品可用与用于免疫亲和材料平衡和/或免疫亲和材料洗涤的缓冲液相同的缓冲物质和/或相同的缓冲物质浓度和/或相同的pH和/或相同的电导率来配制。在一个实施方案中，通过将因子IX加入到与使用的平衡缓冲液相同的含钙缓冲液中配制因子IX，以上样到免疫亲和材料。
随后通过在允许免疫亲和材料超载因子IX的情况下使因子IX相关配方通过免疫亲和材料之上或穿过免疫亲和材料，将因子IX加入免疫亲和材料中。此方法在本领域中为常规的。例如，基于活化因子IX测量柱容量并赋予用g/L表示的给定值。随后按上文所定义加入值超过容量(g/L)100%以上的样品。
一旦因子IX加入到免疫亲和柱中，柱可经受一次或多次洗涤。洗涤通过使适当的溶液穿过免疫亲和材料或通过免疫亲和材料之上来实现。所述洗涤的目的可包括去除不与免疫亲和材料结合的任何因子IX或其它组分；去除仅与免疫亲和材料弱结合的任何因子IX或其它组分；去除结合免疫亲和材料但亲和力比因子IX低的杂质。
在一个实施方案中，将因子IX加入免疫亲和材料后，用缓冲液洗涤免疫亲和材料以去除任何未结合的因子IX、污染物或杂质。例如，洗涤缓冲液可与配制因子IX以加入到免疫亲和材料的缓冲液相同或基本相同。洗涤缓冲液可与平衡缓冲液相同或基本上相同。例如，可使用与平衡缓冲液相同的缓冲液或与配制因子IX使用的缓冲液相同的缓冲液实施洗涤。可使用这样的缓冲液实施洗涤，其具有与平衡缓冲液或配制因子IX使用的缓冲液相同或基本上相同的pH和/或相同或基本上相同的电导率。可使用这样的缓冲液实施洗涤，其包含与平衡缓冲液中或配制因子IX中所使用的相同或基本上相同浓度下的相同缓冲物质。
其它洗涤可使用与平衡缓冲液不同的缓冲液替代地或额外地实施。例如，从免疫亲和材料去除与免疫亲和材料的结合不如因子IX牢固的污染物是可能的。所述污染物将比因子IX更容易从免疫亲和材料释放。例如，免疫亲和材料可用电导率或离子强度比平衡缓冲液和/或其中加入因子IX的配方大的缓冲液来洗涤。通过增加缓冲液的离子强度可实现组分从免疫亲和材料的洗脱。优选以足够少的量选择或使用洗涤缓冲液，使得基本上无因子IX从免疫亲和材料洗脱。
洗涤缓冲液可由技术人员根据特定样品或目的多肽的性质选择。例如，可选择具有特定pH或电导率的缓冲液以允许去除与树脂的结合弱于目的多肽的特定多肽或杂质。可选择这样的缓冲液并通过简单的常规实验优化其使用，例如通过监测从柱中去除的溶液的组成。
可根据待纯化的特定多肽确定洗涤缓冲液的pH。例如，对于若干多肽，例如因子IX，9.0或更高的pH不是最佳的，因为在这些pH值时可观察到多肽的自体活化和/或降解。适用于本发明的洗涤缓冲液可配制为，例如，pH约5.0‑约8.5，例如pH 5.0‑pH 8.5。洗涤缓冲液的pH可大于约5.0、大于约5.5、大于约6.0、大于约6.5、大于约7.0、大于约7.5或大于约8.0。洗涤缓冲液的pH可小于约8.5、小于约8.0、小于约7.5、小于约7.0、小于约6.5、小于约6.0或小于约5.5。可组合这些终点的任何组合。例如洗涤缓冲液的pH可大于约7.0且小于约8.5。pH可为，例如，约pH 7.0、7.5、8.0或8.5，例如7.5。
这些pH值可适合于洗涤用于纯化本文所描述多肽(例如因子IX、因子VII或因子X)的免疫亲和材料。
用于洗涤缓冲液合适的组分可包括缓冲物质，例如Tris、磷酸盐、MES、Hepes或碳酸盐。可使用这样的缓冲物质将洗涤缓冲液维持在如上所定义的pH。合适的缓冲物质浓度可为，例如，5 mM至50 mM之间，例如10mM至40 mM之间。合适的缓冲物质浓度可为，例如，5 mM、10 mM、15 mM、20 mM或25 mM，例如20 mM。
洗涤缓冲液可包含一种或多种附加组分。洗涤缓冲液可包含添加剂，例如乙二醇、乙醇、尿素或用以增加蛋白溶解度的去污剂。可使用浓度为例如，小于1%、小于0.5%、小于0.1%或小于0.01%的非‑离子型去污剂例如吐温80、吐温20或Triton X100。可使用非‑缓冲盐，例如NaCl调整缓冲液的离子强度。
在一个实施方案中洗涤缓冲液额外地包含钙离子，例如氯化钙，或相似的二价离子，例如镁离子、锶离子、铍离子、锌离子、镍离子和铜离子。在一个实施方案中，钙离子以大于1 mM(即大于1 mM的氯化钙，例如2 mM氯化钙，特别为1.5 mM氯化钙)的浓度存在。如本文实施例2中呈现的数据所证明的，这些数据表明与种类#1‑11 ‑ #1‑12相比，种类#1‑8 ‑ #1‑9显示高度降低的协同性和增加的钙依赖性。这些数据这些数据可以以使超载产生甚至更好的Gla概况的方式与超载原则组合。
从免疫亲和材料上洗脱分子意指从免疫亲和材料中除去该分子。其通常通过以下实现：通过添加和/或去除缓冲液添加剂、改变电导率、pH和/或温度来干扰亲和材料配体与结合靶标分子的相互作用。所述分子对于亲和材料的结合强度从而降低并脱离。从免疫亲和材料的洗脱在一些情况下也可通过以下实现：使用改变靶蛋白，例如因子IX的构象的分子，因此降低结合强度并导致靶分子从免疫亲和材料释放。该添加剂可为螯合剂，例如EDTA、EGTA或柠檬酸盐，其牢固地结合钙离子导致钙离子与因子IX解离。因此，因子IX的GLA结构域将展开，导致对于因子IX的配体结合受阻，特别是当结合需要折叠的GLA结构域，例如抗体配体3F14A3B6时。
洗脱缓冲液的pH可根据待纯化的特定多肽确定。例如，对于若干多肽，例如因子IX，9.0或更高的pH不是最佳的，因为在这些pH值时可观察到多肽的自体活化和/或降解。
适用于本发明的洗脱缓冲液可配制为，例如，pH约5.0‑约8.5，例如pH 5.0‑pH 8.5。洗脱缓冲液的pH可大于约5.0、大于约5.5、大于约6.0、大于约6.5、大于约7.0、大于约7.5或大于约8.0。洗脱缓冲液的pH可小于约8.5、小于约8.0、小于约7.5、小于约7.0、小于约6.5、小于约6.0或小于约5.5。可组合这些终点的任何组合。例如洗脱缓冲液的pH可大于约7.0且小于约8.5。pH可为，例如，约pH 7.0、7.5、8.0或8.5，例如7.5。
这些pH值可适合于洗脱用于纯化本文所描述多肽(例如因子IX、因子VII或因子X)的免疫亲和材料。
用于洗脱缓冲液合适的组分可包括缓冲物质，例如Tris、磷酸盐、MES、Hepes或碳酸盐。对于免疫亲和色谱方法，优选阳性的缓冲离子例如Tris。可使用这样的缓冲物质将洗脱缓冲液维持在如上所定义的pH。合适的缓冲物质浓度可为，例如，5 mM至50 mM之间，例如10 mM至40 mM之间。合适的缓冲物质浓度可为，例如，5 mM、10 mM、15 mM、20 mM或25 mM，例如20 mM。
洗脱缓冲液可包含一种或多种附加组分。洗脱缓冲液可包含添加剂，例如乙二醇、乙醇、尿素或用以增加蛋白溶解度的去污剂。可使用浓度为例如，小于1%、小于0.5%、小于0.1%或小于0.01%的非‑离子型去污剂例如吐温80、吐温20或Triton X100。可使用非‑缓冲盐，例如NaCl调整缓冲液的离子强度。如上文所描述的，添加剂也可为螯合剂，例如EDTA、EGTA或柠檬酸盐，其结合钙并使其从因子IX释放，因此导致因子IX的GLA结构域展开。优选地，螯合剂的浓度应与洗脱前免疫亲和材料中或免疫亲和材料上存在的水溶液，例如平衡缓冲液、洗涤缓冲液或细胞上清液中的钙浓度相等或更高。如果螯合剂具有一个以上钙结合位点，该螯合剂的浓度应反映化学计量(stochiometric)浓度而不是绝对浓度。
对于依照本发明的使用，洗脱缓冲液将优选包含一种或多种附加的盐，例如EDTA、EGTA或柠檬酸盐。在一个实施方案中，洗脱缓冲液中可存在一种或多种盐，其浓度在10 mM至100 mM之间，例如至少10 mM、至少20 mM、至少25 mM、至少30mM、至少40mM或至少50mM。
在一个实施方案中洗脱缓冲液具有与洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液相同的组成，不同之处在于洗脱缓冲液额外地包含一种或多种盐且不含钙或其它二价离子。优选的盐为EDTA。因此，洗脱缓冲液可具有本文所描述的洗涤缓冲液或平衡缓冲液的任何组分，但可额外地包含EDTA且不含钙或其它二价离子。
在一个实施方案中，平衡缓冲液和洗涤缓冲液相同，洗脱缓冲液与其的不同之处仅在于洗脱缓冲液还包含EDTA且不含钙或其它二价离子。
洗脱可使用等度或线性梯度的螯合剂，例如等度或线性梯度的EDTA实施。优选地，使用等度梯度的EDTA实施洗脱。洗脱可使用缓冲液中EDTA浓度的分步改变实施。洗脱可通过这些洗脱方法的任何组合实现。例如，给定浓度的EDTA等度洗脱后可跟随EDTA浓度以梯度或一步或多步形式的增加。
在任何所述洗脱方法中，不同组分将在不同时间从免疫亲和材料释放，这依其结合强度而定。结合不太牢固的组分将倾向于较早或较低EDTA浓度时释放。结合较牢固的组分将倾向于在免疫亲和材料上保留更久或较高EDTA的浓度。可监测经过或穿过免疫亲和材料的洗出液以确定特定组分何时被洗脱。可合并不同时间点的洗出液，并分析各集合体(pool)以确定哪种组分存在于哪个集合体中。随后可选择具有所需配方(例如特定因子IX种类的浓度增加或其它因子IX种类的浓度降低)的特定集合体。
本文所描述的等度洗脱使用固定的或稳定的螯合剂浓度。使用的洗脱缓冲液包含所述浓度的螯合剂，例如上文所论述浓度的任一种。洗脱缓冲液经过或通过免疫亲和材料并监测洗出液以确定洗脱何时发生。使用等度洗脱，在使用较少量的洗脱缓冲液时，对于免疫亲和材料的结合亲和力较低的组分将比结合亲和力较高的组分更早释放，结合亲和力较高的组分可需要较大量的经过或穿过免疫亲和材料的洗脱缓冲液。通过选择不同时间段获得的洗出液的特定集合体或批次，可获得具有不同因子IX种类组成的样品。
梯度洗脱可通过增加缓冲液中螯合剂，例如EDTA的浓度至最大终浓度，例如如上文论述的浓度来实现。例如线性梯度可使用螯合剂，例如EDTA终浓度的0%至100%。该梯度可在一段时间内施用至免疫亲和材料，例如超过10、20、30、40、50、70、100、150或更大柱体积。使用所述梯度洗脱，在较低浓度的螯合剂例如EDTA下，对于免疫亲和材料的结合亲和力较低的组分将比结合亲和力较高的组分更早释放，结合亲和力较高的组分的洗脱发生需要较高浓度的螯合剂。通过选择不同时间段获得的洗出液的特定集合体或批次，可获得具有不同因子IX种类组成的样品。
可使用分步增加而不是使用渐变梯度增加盐浓度。即，EDTA的浓度可通过一个或多个不连续步骤增加至最大终浓度。这可用于反映梯度洗脱的效果，其中不同组分在不同浓度并因此在不同步骤中释放。或者分步洗脱可与等度洗脱组合。例如，盐浓度的分步增加可维持若干柱体积的洗脱缓冲液，使得在该浓度发生等度洗脱，且随着使用的缓冲液体积的增加，不同的组分被洗脱。也可使用随后的关于盐浓度的另外步骤。
实施例
实施例1：FIX的不同γ‑羧化种类与Gla定向抗体3F14A3B6的钙依赖性研究
已论述FIX Gla种类#1‑8 ‑ #1‑12中的每一种与抗体3F14A3B6的钙依赖性，其结果见图2和下表：
 Gla#1‑8Gla#1‑9Gla#1‑10Gla#1‑11Gla#1‑12K0.5* (µM)2891 ± 1311724 ± 12981 ± 29805 ± 5653 ± 40h**1.50 ± 0.002.15 ± 0.023.26 ± 0.093.23 ± 0.013.2 ± 0.2
* K0.5为导致与3F14A3B6的半最大结合的钙浓度。
** h为希尔系数，其阐述钙的结合是否为协同性的。h > 1说明存在协同结合，而h=1说明不存在协同性。
这些数据表明与种类种类#1‑11 ‑ #1‑12相比，#1‑8 ‑ #1‑9 显示高度降低的协同性和增加的钙依赖性。FIX Gla种类#1‑10显示中等的钙依赖性。这些数据可以以使超载产生甚至更好的Gla概况的方式与超载原则组合。
实施例2：当经受用Gla‑定向抗体3F14A3B6的免疫色谱且柱超载时FIX的不同γ‑羧化种类的纯化和分析
上样
向培养基上清液中加入350 mM NaCl和1.5 mM CaCl2，NaCl在CaCl2前加入以避免形成不溶性磷酸钙。若收集物已解冻，则上样前将上样样品在0.45 µm过滤。
凝胶
偶联2.5 mg 3F14A3B6/ml树脂的CNBr Sepharose 4 FF (GE Healthcare)。
柱处理
柱被装在适当的水性溶剂例如平衡缓冲液中。贮存后，实施洗涤2，然后进行平衡。
参数
床高：≥ 5 cm
温度：2‑10 ℃
流速：15 (12‑18 CV/h)
最大压强：≤0,1 MPa (≤1巴)
容量：测量为活化FIX，0.3 g/L 
负载：测量为活化FIX，0.36 (容量的120 %) g/L 
缓冲液
A1：20 mM Tris，1.5 mM CaCl2，pH 7.5
A2：20 mM Tris，1.5 mM CaCl2，0.5 % triton x‑100，pH 7.5
A3：20 mM Tris，2 M NaCl, 1.5 mM CaCl2，pH 7.5
A4：20 mM Tris，20 mM EDTA，50 mM NaCl，pH 7.5
A5：20 mM Tris，pH 9.0，4.0 M NaCl，0.01 % (v/v) Triton‑X 100
A6：20 mM柠檬酸钠，pH 5.5，4.0 M NaCl，0.01 % (v/v) Triton‑X 100
包含Tris的溶剂用4 M HCl调整pH。
柱操作
平衡：5 CV 82.5 % A1 + 17.5 % A3 (c.t. 20 mM Tris，350 mM NaCl，1.5 mM CaCl2，pH 7.5)
上样：如所规定的，按照规定容量的120%。
洗涤1：3 CV 82.5 % A1 + 17.5 % A3 (c.t. 20 mM Tris，350 mM NaCl，1.5 mM CaCl2，pH 7.5)
洗涤2：3 CV A3
洗涤3：2 CV A2 (流速2 CV/ h – 接触时间1 h)
洗涤4：2 CV 97.5 % A1 + 2.5 % A3 (c.t. 20 mM Tris，50 mM NaCl，1.5 mM CaCl2，pH 7.5)
洗脱：10 CV A4 (等度)
再生1：5 CV A5
再生2：5 CV A6
贮存：A7 (当贮存小于24 h时可使用A1。平衡前用A3洗去A7)
产物收集
起始收集：A280≥0.05
终止收集：A280≥0.25或2 CV后。
实施例
下文显示了柱超载的一些实例。本节中描述的最佳模式程序自始至终使用，除了上样时加入2 mM CaCl2 而不是1.5 mM之外。
在Agilent HPLC系统中实施IEX‑HPLC方法分析Gla含量(该方法在下文简单显示)。基于HPLC方法的Gla含量分析与基于N‑末端测序和碱水解分析的Gla含量测定相关。
使用MiniQ PC3.2/3柱(GE Healthcare目录号17‑0686‑01)，流速为0.18 ml/min。
该系统中使用的缓冲液为：
A‑缓冲液：20 mM Tris，pH 9.0
B‑缓冲液：20 mM Tris，pH 9.0，1.5 M乙酸铵
测量以下信号：
UV280 
荧光信号，例如，激发：280nm /发射：340nm
以下为HPLC程序：
0 ‑ 5 min.           0 ‑ 30 % B
5 ‑ 55 min.          30 ‑ 55 % B
55 ‑ 65 min.       55 ‑ 100 % B
当柱超载122%时获得的Gla概况(IEX‑HPLC分析)和与负载低于容量时获得的Gla概况(IEX‑HPLC分析)的比较分别可见于图3A和3B。超载和低于负载容量时的Gla分布的比较可见下表： 
#Gla柱超载122%时获得的%面积负载低于容量时获得的%面积#1‑80.01.8#1‑9~1.04.0#1‑108.515.1#1‑1126.524.3#1‑1264.154.8
因此，使用如上所描述的柱超载122%纯化导致所有可检测的#1‑8‑Gla从原始FIX样品中去除。#1‑9‑和#1‑10‑Gla的存在也减少，并因此引起#1‑11‑和#1‑12‑Gla比例的增加(即与低于柱负载时的79.1%相比，柱超载时获得90.6%的活化形式#1‑11和#1‑12)。
柱超载170%时获得的Gla概况(IEX‑HPLC分析)和负载低于容量时获得的Gla概况(IEX‑HPLC分析)的比较分别可见于图3C和3D。超载和低于负载容量时的Gla分布的比较可见下表：
#Gla柱超载170%时获得的%面积负载低于容量时获得的%面积#1‑80.03.2#1‑91.08.7#1‑107.819.3#1‑1128.622.7#1‑1262.646.1
因此，使用如上所描述的柱超载170%纯化导致所有可检测的#1‑8‑Gla从原始FIX样品中去除。#1‑9‑和#1‑10‑Gla的存在也减少，并因此引起#1‑11‑和#1‑12‑Gla比例的增加(即与低于柱负载时的68.8%相比，柱超载时获得91.2%的活化形式#1‑11和#1‑12)。
柱超载334%时获得的Gla概况(IEX‑HPLC分析)和负载低于容量时获得的Gla概况(IEX‑HPLC分析)的比较分别可见于图3E和3F。超载和低于负载容量时的Gla分布的比较可见下表：
#Gla柱超载334%时获得的%面积负载低于容量时获得的%面积#1‑80.01.6#1‑91.16.1#1‑109.018.6#1‑1129.225.1#1‑1260.848.6
因此，使用如上所描述的柱超载334%纯化导致所有可检测的#1‑8‑Gla从原始FIX样品中去除。#1‑9‑和#1‑10‑Gla的存在也减少，并因此引起#1‑11‑和#1‑12‑Gla比例的增加(即与低于柱负载时的73.7%相比，柱超载时获得90.0%的活化形式#1‑11和#1‑12)。
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