含封入其中的活性物质的树枝状 聚合物及活性物质的释出 本发明涉及包含树枝状聚合物(dendrimer)和封入其中的活性物质的组合物，其中所述树枝状聚合物具有端基。
树枝状聚合物是三维的具有非常确定的化学结构的高支化低聚物和聚合物分子。树枝状聚合物通常包含芯，多级的分支以及端基。所述多级的分支由从树枝状聚合物的芯向外伸展的重复结构单元组成。而树枝状聚合物Nth级的端基则是Nth(最终的)级的官能基。
在分支之间有一些空洞。这些空洞的形状和尺寸取决于具体的级、化学组成及重复结构单元地结构。在制备树枝状聚合物的过程中，支化度和分支之间的空洞的形状和尺寸会受到影响。影响的方法例如是：改变重复结构单元、提高或降低支化度或向分支中引入不连续性
由EP-B-271180可以知道树枝状聚合物可作为农用、药用和其它物质的载体。这些被载的物质可以以多种方式与树枝状聚合物相联系。例如，被载的物质可以包含在树枝状聚合物的空洞中。有较多级分支的树枝状聚合物具有大量的端基，它们在空间上彼此邻近，以至于形成了分子屏障，使得受载物质从树枝状聚合物中的释放由扩散控制
本领域已知这样的组合物的缺点是树枝状聚合物的外表面不够密闭，结果受载物质释放开始的时间不能控制。本领域已知这样的轭合物的再一个缺点是受载物质未被封入树枝状聚合物中，而且可用溶剂洗涤该轭合物而将其洗出，而且实际上永远存在着受载物质从树枝状聚合物向外的扩散。这样的组合物的再一个缺点是受载物质不一定存在于树枝状聚合物的内部结构中，但可能存在于树枝状聚合物的表面。
本发明的目的是提供这样一种组合物，其中，活性物质被封闭在树枝状聚合物中，其释放的开始时间及释放的过程均可控制。
这是按照本发明实现的，其中树枝状聚合物的端基具有封端剂。
本发明组合物的优点在于未被封入树枝状聚合物中而存在于例如树枝状聚合物的表面的不需要的化合物可通过例如洗涤或透析而容易地除去。
在本发明组合物中，活性物质不是与树枝状聚合物化学结合。本发明的活性物质主要是以物理方式被封入树枝状聚合物中，这就提供了这样的好处：即活性物质和树枝状聚合物未被化学改变。在本发明组合物中，活性物质被装入并保留在树枝状大分子的内部结构中而不是在外表面上。
根据本发明，活性物质的分子可完全或部分被封入。在后一种情况下，分子的一部分被封入而另一部分从树枝状大分子向外延伸。
由NMR光谱法进行驰豫时间的测定令人惊讶地发现由封端剂组成的表面层具有固态性质。
同样令人惊讶的是，我们还发现有时活性物质通过按照本发明被封入树枝状聚合物中而被稳定化。例如，着色剂在封入树枝状聚合物中之后似乎显示出更强的耐光性。在封入树枝状聚合物中之后自由基的寿命似乎也显著增长了。
根据本发明，封端剂是这样一种化合物：它在空间上具有足够的尺寸，易于进入树枝状聚合物的端基的化学键中，而且也能从树枝状聚合物中裂解出来或是被改变而不会因此影响树枝状聚合物的化学结构(例如分子结构)和活性物质的化学结构。
封端剂可与树枝状聚合物以不同的方式，例如共价键、氢桥或离子键相连。
按照本发明的合适的封端剂是这样的化合物，它们能够从树枝状聚合物裂解或能例如通过化学反应，在中性、酸性或碱性介质中水解、氢化、及受热反应、光化学反应、在氟化物存在下的反应、逆Michael反应而改变。
按照本发明的合适的封端剂是例如支化或非支化的Michael受体、活性酯、可选的活性或非活性氨基酸、核酸、糖类、异氰酸酯、氮丙啶类、酰氯、酸酐、醛、酮、丙烯酸酯、手性环氧化物、内酯、二丙交酯(bislactide)、具有10-24个碳原子的脂肪酸和聚合物。
合适的活性酯(即含有活性羰基的酯)是还含有醚和/或硫羟基的酯。合适的聚合封端剂的实例是聚乙烯、聚丙烯、尼龙4，6和尼龙6。合适的Michael受体的实例包括异硫氰酸酯、磺酰氯、膦酰氯、聚乙二醇-4-壬基-苯基醚丙烯酸酯、聚乙二醇-苯基醚丙烯酸酯、聚乙二醇-苯基醚甲基丙烯酸酯。
根据本发明，特别有用的一类封端剂是氨基酸、例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
根据本发明的封端剂也可具有一个或多个相同或不同的保护基团。按照本发明，合适的保护基团应易于从封端剂中裂解出来。因而不会使封端剂与树枝状聚合物之间的化学键断裂，从而也就不会影响树枝状聚合物和活性物质的化学结构。
本发明的封端剂可全部或部分具有保护基团。
按照本发明的合适的保护基团参见例如T.W.Green的《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)(John Wiley&Son，纽约，1981)所述。
按照本发明的合适的保护基团例如是可水解的酯、醚、硫羟基、磺酸基、三苯甲游基、甲硅烷基、叔丁氧羰基(BOC)、氨基甲酸9-芴基甲酯(FMOC)、氨基甲酸{2，7-二叔丁基-[9-(10，10-二氧代-10，10，10，10-四氢噻吨基)]甲酯}(DBD-TMOC)、苄氧羰基(Z)、三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(TEOC)、金刚烷基氧基羰基(AdMOC)、1，1，4，4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烯(STABASE)、苯并STABASE、苄基和叔丁基。非常合适的保护基是BOC基团。
所述保护基团可通过例如化学反应、在中性、酸性或碱性介质中的水解反应、氢化、受热反应、光化学反应、在氟化物存在下的反应、逆Michael反应而被改变和/或由封端剂中裂解出来。
按照本发明，改变例如也意味着进行物理改变，例如在温度或溶剂等的影响下，树枝状聚合物的分子体积和/或构象的改变。这些物理改变的结果是封入树枝状聚合物中的全部或部分活性物质可被释放出来。
按照本发明，具有保护基团的合适的封端剂是例如甲基氧基呋喃酮、具有磺酸或BOC基团的氮丙啶类、具有大的酯基的丙烯酸酯类以及具有一个或多个BOC基团的氨基酸。非常合适的具有保护基团的封端剂是具有一个或多个BOC基团的氨基酸。
一般来讲，具体的封端剂、保护基团或具有保护基团的封端剂的选择应由本领域技术人员根据所用的树枝状聚合物的性质和级数以及欲封入的活性物质的分子大小来决定。
根据本发明，具有封端剂的树枝状聚合物的端基的数目通常因使用的树枝状聚合物的性质和级数以及封端剂的性质和尺寸而异。实际上，具有封端剂的端基的数目应使得外表面被认为基本上是封闭的，而且活性物质从树枝状聚合物向外的扩散实际上是不可能的。
大多数情况下，至少30％的树枝状聚合物的端基或官能团具有封端剂，通常至少50％，至少70％，或至少90％。
原则上，所有的树枝状聚合物均适用于本发明。适合的树枝状聚合物实例见Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29(1990)第138--175页所述。该文献特别描述了聚酰氨基胺(PAMAM)树枝状聚合物，其芯为胺或氨，而分支由例如下面重复单元组成：
在本发明的组合物中，优选的树枝状聚合物是WO-A-9314147和WO-A-9502008中所述的树枝状聚合物。例如在WO-A-9314147和WO-A-9502008中所述的聚丙胺(POPAM)树枝状聚合物具有二氨基丁烷的芯。分支例如可以由连续的重复单元-CH2-CH2-CH2-N组成。这样的树枝状聚合物的优点是：具有高度热稳定性、在许多有机溶剂中具有良好溶解度、对于水解有良好的稳定性而且含有非常易于进入的空洞和通道。在WO-A-9314147和WO-A-9502008中所述的聚丙胺树枝状聚合物的再一优点是许多级可容易地以工业规模制备。
根据本发明，也可使用这样的树枝状聚合物，其分支由含有具3-50个碳原子的一囟代烃化合物和至少一个氰化物基团的囟代氰化物单元制得，卤素和氰化物基团彼此至少被3个碳原子分开。
这样的树枝状聚合物的制备由具有至少一个作为在卤代氰化物上亲核取代的亲核反应剂的官能团的芯分子开始。所述官能团优选是一级或二级氨基。在制备这样的树枝状聚合物时，
a)几乎芯分子的每一个官能团均与卤代氰化物单元反应，
b)接着几乎每一个结合的氰化物基团都被还原成胺，
c)此后，几乎每一个胺基均与卤代氰化物单元反应。
反应步骤b)和c)交替重复直至获得所需级数的树枝状大分子。本方法可在步骤b)或步骤c)之后停止。
卤代氰化物单元优选含有1-20个氰化物基团，卤素优选是氯或溴。
按照本发明的树枝状聚合物也可以被全部或部分改性以引入不同的官能度。这可以通过例如可选地在催化剂存在下使最后一级的端基全部或部分与合适的反应剂反应来进行。这样的反应剂的实例例如见WO-A-9314147和WO-A-9502008所述。
按照本发明，合适的树枝状聚合物是具有完善的支化结构的树枝状聚合物以及在分支结构中有缺陷的树枝状聚合物，具有不完全支化度的树枝状聚合物(在此支化度应理解为分支数与最大可能分支数之比)、不对称支化的树枝状聚合物、过支化分子、高支化聚合物和高支化共聚合物和/或嵌段共聚合物以及低支化聚合物。
按照本发明的树枝状聚合物优选是对称支化的树枝状聚合物。
根据本发明通常使用级数较高的树枝状聚合物，例如不小于三级尤其是不小于四级、特别是不小于五级的树枝状聚合物。
按照本发明的非常合适的活性物质属于下面范围：药用化合物、药物、农药例如灭害剂、除草剂、杀虫剂、杀菌剂、信息素、毒素、用于个人保护用品的材料、化妆品、食品添加剂、工程塑料添加剂例如稳定剂和耐火剂和/或阻燃产品、螯合化合物、有机酸、非金属盐、自由基、皂类、信号发生剂例如荧光物质和磷荧光物质(fosfor-escent)化合物、信号吸收剂例如紫外吸收化合物、着色剂、金属、金属化合物、放射性核素、放射活性标记化合物、D-II-A化合物、缺电子化合物和非金属富电子化合物以及上述化合物的前体。
药用化合物的适合的实例是类固醇类例如维生素的前体、胆汁酸、激素、固醇类例如炔雌醇甲醚、雌二醇、雌激素、雌酮；抗生素类例如青霉素-V、氧咪苄青霉素、四环素类、神经传导剂和免疫化学制品例如单克隆和多克隆抗体如抗Ig、抗-H-植物凝血素，人IgA、IgG或IgM以及牛IgG。
农药的适当实例包括肥料例如酸式磷酸盐、硝化磷酸盐和硫酸盐。杀虫剂的合适的实例包括氯化烃类例如对二氯苯；咪唑类和天然除虫菊酯类。除草剂的合适的实例包括氨基甲酸酯类、苯酚的衍生物以及脲的衍生物。信息素的合适实例包括合成和天然信息素，例如4-甲基-3-庚酮。
食品添加剂的合适的实例包括调味剂、芳香剂和强化甜味剂例如天冬酰苯丙氨酸甲酯、糖精、双氧噁噻嗪-K、sucralose。
有机酸和非金属盐的合适实例包括具有或没有取代基的一元和多元羧酸例如饱和或不饱和脂肪酸和芳族酸及其盐。饱和脂族一元羧酸的合适的实例包括甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、己酸。取代的脂族酸的合适的实例包括乙醇酸、乳酸、丙烯酸。适宜的多元羧酸的实例包括草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、酒石酸、马来酸、富马酸及其盐。代表性的芳族酸包括苯甲酸、邻苯二甲酸、水杨酸、氨茴酸、肉桂酸。代表性有机酸也包括3，5-二硝基苯甲酸、3，5-二甲氧基苯甲酸、4-氰基苯甲酸和苯胺基萘磺酸。非金属盐的合适的实例包括苯胺基萘磺酸的铵盐。
合适的自由基或自由基前体的实例包括硫酸六甲基咪唑鎓-1-基氧基甲酯、二苯基苦基偕腙肼、BPDA-配合物(α，γ-bisdifenyleen-β-fenylallyl)、TEMPO(2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧基)、doxyl(4，4-dimethyl-3-oxazolinyloxy-(4，4-dimethyloxazolidine-N-oxyl))、proxyl、proxylcarboxylic acid及其衍生物。
信号吸收剂的适合的实例包括非线性光学化合物例如对硝基二甲基苯胺和二甲氨基硝基茋；紫外吸收化合物例如azanaphtol化合物和结晶紫；荧光化合物例如曙红B、若丹明酰胺B(rhodamide B)、荧光素及其衍生物。
皂类的合适实例包括硫酸盐皂类、磷酸皂类例如二苯基膦酸、苯基膦酸；吡啶皂类例如氯化十二烷基吡啶鎓；碱性皂类和重金属皂类例如铝、钴、钙、锌、铅皂类。
缺电子化合物的合适实例包括处于激发态的缺电子化合物及具有共轭或非共轭的吸电子基团的有机化合物，所述吸电子基团例如是羧酸基团；酰胺基团；酰亚胺基团；氰基基团例如三氰基乙烯；砜基团；醌类和氢醌类例如四氰基氢醌。
合适的金属包括元素周期表(物理化学手册，第70版1989-1990)1-14族以及镧系和锕系的金属。第1族的代表性实例是：Na、K、Rb、Cs；第2族：Mg、Ca；第6族：Cr、Mo；第8族：Fe、Ru；第9族：Co、Rh、Ir；第10族：Cu、Ag；第12族：Zn；第13族：Al；第14族：Sn、Pb。
药物或农药的前体的适宜的实例包括：苯甲酸、苯甲醛、苯酚、脂肪及杂环胺及其衍生物。
本领域技术人员可根据活性物质的分子的形状和尺寸选择树枝状聚合物的最合适的级数。对于POPAM树枝状聚合物的情况，树枝状聚合物的级数为4或更高是最为合适的。
可封入树枝状大分子中的活性物质的分子数目取决于诸多因素，例如树枝状聚合物的化学组成和结构，树枝状聚合物中空洞的形状和尺寸，树枝状聚合物的级数以及欲封入的活性物质的分子的形状和尺寸。
根据本发明，可将一种或多种活性物质的一个或多个分子封入树枝状大分子之中。活性物质可在树枝状大分子中统计分布或集中在某一特定区域。
本发明也涉及包含带有封端剂的树枝状聚合物和封入该树枝状聚合物中的活性物质的组合物的制备方法。
M.Maciejewski在J.Macromol.Sci.Chem.A17(4)第689-703(1982)中指出如果在客体分子的存在下制备树枝状聚合物，理论上可将一种或多种客体分子封入树枝状聚合物中。在某一特定级数，存在若干这样的端基，使外壳被封闭，不再允许客体分子穿透。
但该方法的缺点是客体分子被不可逆地封入树枝状聚合物中。对于需要释出的客体分子，则需要除去树枝状聚合物的一级或多级，这就造成整个树枝状聚合物结构的不完整性。
在本发明的方法中，将一定量的欲封入的活性物质加到含树枝状聚合物的反应混合物中。与此同时或在此之后加入一定量的封端剂。
该方法的优点在于可将组合物洗涤或透析而不会发生活性物质损失的情况。本发明的再一个优点是可将任何存在的不需要的物质洗涤除去而不会发生活性物质损失的情况，封端剂最好在加入活性物质后加入。
本发明也涉及活性物质控制释放的方法。
这通过按照本发明，将封端剂或部分封端剂裂解和/或改变来达到。
按照本发明，“改变封端剂”应理解为具有封端剂的树枝状聚合物中的物理相互作用，例如树枝状分支之间和/或自身的物理作用。封端剂与树枝状聚合物或封端剂自身之间的物理作用、及封端剂中物理相互作用的改变，其结果是释出被封入的活性物质。例如，将例如聚丙胺树枝状聚合物的胺基全部或部分质子化，分支之间的排斥力增加，从而将封入的活性物质部分或全部释出。该方法的优点在于带有封端剂的树枝状聚合物的结构未受损，并可再次使用。
根据本发明的一个合适的实施方案，活性物质是通过裂解保护基团而释出的。
根据本发明的又一实施方案，活性物质是通过首先裂解保护基团，然后裂解封端剂释出的。
这样的方法的优点在于可控制特定的封入的活性物质的释出。保护基团的裂解通常会造成较小分子的活性物质的释出。封端剂的裂解则一般会造成较大分子活性物质的释出。通过正确的选择，尤其是对封端剂和保护基团的大小的正确选择，可通过裂解保护基团来得到缓释应用领域所需的活性物质的缓释。
按照本发明的另一个合适的实施方案，通过改变封端剂，接着裂解保护基团和/或封端剂来释出活性物质。
按照本发明，裂解和/或改变封端剂的合适的方法例如是：化学反应、在中性、酸性或碱性介质中水解、氢化、受热反应、光化学反应、在氟化物存在下的反应、逆Michael反应。封端剂优选通过在酸性介质中的水解来除来。所述方法也适于保护基团或具有一个或多个保护基团的封端剂的裂解。
本发明将通过下列非限制性实施例进一步阐述。
NMR谱在氯仿中用Bruker AM400或Varian Gemini300光谱计进行测定。
ESR谱是通过Bruker ER 200D SRC光谱计用X射线带和标准测量池测得。用Bruker ER4111温度计测定温度。在氯仿中进行低温ESR谱的测定。
采用Perkin Elmer 1600 FT-IR光谱计测定红外光谱。
采用JASCO DIP 370偏光计测定旋光率。实施例I：3，5-二硝基苯甲酸的封入
将200mg 3，5-二硝基苯甲酸加入到35mg(4.9μmol)NH2封端的五级聚丙胺树枝状聚合物(64节(cascade)：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)和0.2ml三乙胺在10ml二氯甲烷中的混合物中。搅拌30分钟后，加入114mg(0.3mmol)N-BOC-L-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯。搅拌一夜后，将反应混合物用二氯甲烷稀释至50ml，接着用30ml水洗涤三次，并用30ml饱和碳酸钠溶液洗涤三次。在硫酸钠存在下干燥并蒸发剩余液体后，1H NMR分析表明15-25个3，5-二甲氧基苯甲酸分子被封在树枝状聚合物中。约80％的树枝状聚合物可被分离。实施例II：3，5-二甲氧基苯甲酸的封入
将200mg 3，5-二甲氧基苯甲酸加入到22mg(3.1μmol)NH2封端的五级聚丙胺树枝状聚合物(64节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)和0.2ml三乙胺在10ml二氯甲烷中的混合物中。搅拌30分钟后，加入72mg(0.19mmol)N-BOC-L-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯。搅拌一夜后，将反应混合物用二氯甲烷稀释至50ml，接着用30ml水洗涤三次，并用30ml饱和碳酸钠溶液洗涤三次。在硫酸钠存在下干燥并蒸发剩余液体后，1H NMR分析表明15-25个3，5-二甲氧基苯甲酸分子被封在树枝状聚合物中。约85％的树枝状聚合物可被分离。实施例III：Proxyl carboxylic acid(自由基)的封入和释出
将8mg proxyl carboxylic acid加入到59mg NH2封端的五级聚丙胺树枝状聚合物(64节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)和0.4ml三乙胺在10ml二氯甲烷中的混合物中。搅拌30分钟后，在室温下加入191mg(0.53mmol)N-BOC-L-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯。搅拌一夜后，将反应混合物用二氯甲烷稀释至50ml，接着用30ml水洗涤三次，并.用30ml饱和碳酸钠溶液洗涤三次。在硫酸钠存在下干燥并蒸发剩余液体后，收率约70％。ESR谱表明有少数proxyl carboxylic acid自由基被封入树枝状聚合物中。
接着将含proxyl自由基的树枝状聚合物用50ml饱和碳酸钠溶液洗涤16次。由于与该自由基相应的信号的强度在洗涤后未改变，可以推断自由基被封在树枝状聚合物中。从与游离的自由基的光谱的比较得出结论：对于每个树枝状分子约1个自由基被封入。
接着，将34mg含该自由基的树枝状聚合物溶于5ml二氯甲烷中，向其中加入1ml浓HCl。搅拌约60小时后，加入4ml水。分5批，每批用5ml二氯甲烷萃取酸水层，用硫酸钠干燥并蒸干，然后加入5ml二氯甲烷测定ESR谱。ESR表明在二氯甲烷溶液中存在proxyl自由基。
在用饱和碳酸钠溶液洗涤含自由基的二氯甲烷溶液之后，在二氯甲烷层未检测到游离的proxyl自由基。这表明碳酸钠仅萃取出了从树枝状聚合物中释出的自由基。这也表明碳酸钠不能萃取出封在树枝状聚合物中的自由基。试验IV：空白试验A：
该试验证明proxyl自由基未与树枝状聚合物化学键合。
为此目的，将10mg proxyl carboxylic acid加入到含有BOC封端的L-苯丙氨酸的0.5ml二氯甲烷和5mg NH2封端的五级聚丙胺树枝状聚合物(64节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)的溶液中。将混合物在室温下搅拌24小时，然后用二氯甲烷稀释至5ml，用10ml水洗涤三次，并用10ml饱和碳酸钠溶液洗涤4次。
将混合物用硫酸钠干燥并蒸干后，ESR证明树枝状聚合物不含proxyl自由基。这表明proxyl自由基未与氨基酸化学结合。试验V：空白试验B
将21mg proxylcarboxylic acid(proxyl自由基)(0.12mmol)加入到10mg(13μmol)NH2封端的二级聚丙胺树枝状聚合物(8节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)4：丙胺)和0.1mol三乙胺在0.25ml二氯甲烷中的混合物中。在室温下搅拌30分钟后，加入37mg(0.10mmol)N-BOC-L-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯。于室温搅拌一夜后，将反应混合物用二氯甲烷稀释至50ml，接着用30ml水洗涤三次，并用30ml饱和碳酸钠溶液洗涤三次。用硫酸钠干燥并蒸干后，收率约81％。
溶于二氯甲烷的树枝状聚合物的ESR谱表明存在微量的proxyl自由基。
用30ml饱和碳酸钠溶液洗涤五次而将自由基完全除去。
这表明proxyl自由基未与树枝状聚合物化学结合，二级聚丙胺树枝状聚合物的空洞太小，难以封入proxyl自由基。实施例VI：每个树枝状聚合物中封入几个proxyl carboxyl自由基
将58mg proxylcarboxylic acid(0.31mmol)加入到22mg(3μmol)NH2封端的五级聚丙胺树枝状聚合物(64节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)和0.1ml三乙胺在0.5ml二氯甲烷中的混合物中。搅拌30分钟后，加入95mg(0.26mmol)N-BOC-L-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯。重复实施例III的过程。
ESR表明每个树枝状聚合物分子中封入八个自由基。实施例VII：Proxyl carboxylic acid在BOC保护的亮氨酸的条件下的封入
重复实施例III所述的过程，用0.53mmol BOC保护的亮氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯代替BOC-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯。对于每个树枝状聚合物分子约1个proxylcarboxylic acid自由基被封入。实施例VIII-XI
重复实施例I所述的过程。在表1中总结了所用的量和所使用的活性物质。
表1活性物质 树枝状聚合物 氨基酸的量活 性物质 载荷
的量 的量
(mg) (mg) (mg)8. Reichardt ET*，**38 127 11 2探针9. Kosover* Z-探针 25 82 3.3 0.710.青霉素V 39 129 39 211.氧咪苄青霉素 119 391 18 0.3
(青霉素)
*用紫外光谱测定溶剂极性的探针
**2，6-二苯基-4-(2，4，6-三苯基吡啶并)苯酚盐实施例XII-LXVIII
在下列实施例中，将各种活性物质封入树枝状聚合物中，例如自由基、着色剂、部花青着色剂、荧光化合物、螯合化合物、azanaph-thol化合物(通过封入树枝状聚合物中而变为手性的)、缺电子化合物及吡啶皂类。
在表2中总结了所用的活性物质、树枝状聚合物的量、保护性氨基酸及所用的活性物质和对于每个树枝状聚合物分子被封入的活性物质的量。
使每个树枝状聚合物分子荷载至多1.2个活性物质的分子的标准方法
将Xmg活性物质加入到Ymg NH2封端的五级聚丙胺树枝状聚合物(64节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)和0.1ml三乙胺在10ml二氯甲烷中的混合物中。搅拌30分钟后，按树枝状聚合物中存在的每个NH2基团加入1当量N-BOC-L-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯，加入所述酯。将反应混合物搅拌过液。然后将反应混合物用二氯甲烷稀释至50ml，随后用30ml水洗涤三次并用30ml饱和碳酸钠溶液洗涤三次。用硫酸钠干燥并将残余液体蒸发后分离包含活性物质的树枝状聚合物。
使每个树枝状聚合物分子荷载高于1.2个分子的活性物质的标准方法：
在此情况下，分别用0.5ml三乙胺和0.5ml二氯甲烷代替0.1ml三乙胺和10ml二氯甲烷。
表2活性物质 树枝状聚合物 氨基酸的量 活性物质 载荷a 产率
的量 的量
(mg) (mg) (mg) (％)4-氰基苯甲酸 45 145 13 0.4 44
76 246 146 5 26ANS酸 58 188 9 3 60
41 133 109 20 90ANS NH4盐 53 171 10 1 63
78 252 100 10 79DPHT 65 211 10 2 49
97 308 95 20 76自由基硫酸六甲 58 188 14 4 64基咪唑鎓-1-基氧基甲酯diphenylpicrylhydrazal 48 155 21 0.2 59BDPA配合物 48 156 8 0.2 72磷酸皂类二苯基膦酸 23 74 23 0.5 57
33 107 117 1 50苯基膦酸 21 68 21 0.3 25
34 110 101 1 45吡啶皂类氯化十二烷基 51 165 110 1 82吡啶鎓
表2续着色剂结晶紫 20 64 17 1.2 75
79 225 260 8 55亮绿 32 103 14 1 65羊毛铬黑T 26 84 10 0.15 70甲基红 22 71 15 0.1 80甲基橙 30 97 10 0.1 62茜素黄 26 84 10 0.1 62孟加拉粉红 51 165 10 1 65
76 246 306 4 55部花青着色剂spironaphthalened 34 110 22 8 88cl-spironaphthalenee 36 117 29 8 90NO2-spironaphthalenef 52 168 15 4 98spiroanthrg 50 162 16 4 77cl-spiroanthrh 86 278 40 3 75缺电子化合物三氰基乙烯 49 160 50 b 68四氰基二氢醌 111 364 215 b 70类固醇炔雌醇甲醚 125 405 39 2 64表2续荧光化合物曙红B 30.5 98 23 1 97
47 151 197 2 58若丹明酰胺B 37 119 10 1 99
353 1143 800 4 79若丹明酰胺B碱 28.6 93 23 4 95荧光素 35 113 14 0.5 79
193 623 1050 4 50荧光素Na盐 33 106 50 0.5 78荧光素二乙酸盐 63 203 238 4 82二硝基荧光素 30 100 13 b 71螯合化合物试铝灵 28 91 96 2 85
69 224 43 6 65金精三羧酸 56 181 314 2 75
32 104 20 10 81azanaphthol化合物new coccin 50 162 20 0.5 89
55 178 250 2 74blue hydroxynaphthol 55 178 24 0.5 74
37 120 229 2 94结晶猩红 37 120 20 0.2 71
34 110 260 1.4 50指示剂二号橙 56 181 20 0.1 66橙G 34 110 18 0.4 88靛蓝胭脂红 46 150 23 c 67
a：以每个树枝状聚合物分子中活性物质的分子数表示
b：物质被封在树枝状聚合物中。由于紫外吸收的位移太大，无法测定载荷。
c：物质被封在树枝状聚合物中，由于原料的不溶性，无法测定载荷。
d：1，3-二氢-1，3，3-三甲基螺-{2H-吲哚-2，3′-[3H]萘并[2，1-b][1，4-噁嗪]}
e：5-氯-1，3-二氢-1，3，3，-三甲基螺-{2H-吲哚-2，3′-[3H]萘并[2，1-b][1，4-噁嗪]}
f：1′，3′-二氢-1′，3′，3′-三甲基-6螺硝基-[2H-苯并吡喃-2-2′(2H)引哚]
g：1，3-二氢-1，3，3-三甲基螺-{2H-吲哚-2，3′-3H]菲并[9，10-b][1，4-噁嗪]}
h：5-氯-1，3-二氢-1，3，3-三甲基螺-{2H-吲哚-2，3′-[3H]菲并[9，10-b][1，4-噁嗪]}ANS＝苯胺基萘磺酸DPHT＝二苯基己三烯
表2中所列出的着色剂实际上被封在树枝状聚合物中，这能从紫外光谱中得到证明。被封在树枝状聚合物中的含N着色剂的紫外光谱信号，相对于游离的着色剂的信号，显示出明显的位移。
孟加拉粉红(Bengal rose)在紫外光谱中未显示出信号且无荧光。但在将孟加拉粉红封入树枝状聚合物中之后，观察到清晰的荧光光谱。
为证明羊毛铬黑T和茜素黄实际上被封在树枝状聚合物中，进行了下列试验：
将样品烧瓶充以溶于乙腈的羊毛铬黑T，得到红棕色溶液。将第二个样品烧瓶充以乙腈和包含羊毛铬黑的树枝状聚合物的混合物。由于树枝状聚合物不溶于乙腈中，乙腈溶液仍是无色的。观察到着色剂成为玻璃表面的斑点。甚至在2小时超声处理及6周放置后溶液仍是无色的。这表明着色剂实际上被封在树枝状聚合物中，而且没有从端基具有BOC基团保护的苯丙氨酸的树枝状聚合物中释出。试验LXIX：空白试验C
通过下面试验证明活性物质未与氨基酸化学结合。
为此目的，将200mg N-BOC-L-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯、100mg茜素黄和10ml二氯甲烷的混合物在室温下搅拌4天。接着，向混合物中加入50mg胺封端的二级聚丙胺树枝状聚合物(8节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)4：丙胺)，并在室温下搅拌过夜。将混合物用二氯甲烷稀释至50ml，接着用30ml饱和碳酸钠溶液洗涤六次。在硫酸钠存下干燥并蒸发后分离树枝状聚合物。收率为63％。被封入的茜素黄的量小到可以忽略不计：每个树枝状聚合物分子0.001个分子。这表明茜素黄未与氨基酸化学结合。
随后，将该树枝状聚合物溶于二氯甲烷中，并再用30ml饱和碳酸钠溶液洗涤四次。在将溶液用硫酸钠干燥并蒸煮后，被封入的茜素黄的量为每个树枝状聚合物分子0.0001个分子。实施例LXX-LXXI：金属盐的封入
分别将50mg CuCl2和FeCl3加入到86mg NH2封端的五级聚丙胺树枝状聚合物(64节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)和0.1ml三乙胺在10ml二氯甲烷中的混合物中。搅拌30分钟后，加入310mg N-BOC-L-苯丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯。将混合物搅拌过夜，然后，将反应混合物用二氯甲烷稀释至150ml，接着用100ml饱和碳酸钠溶液洗涤六次。在硫酸钠存在下干燥并蒸发剩余液体后，分离包含活性物质的树枝状聚合物。在两种情况下，载荷均为每个树枝状聚合物分子2分子的盐。实施例LXXI和LXXIII
在38mg六级聚丙胺树枝状聚合物(128节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)124：丙胺)、100mg t-BOC-丙氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯和227mg二硝基苯甲酸存在下重复实施例I。约8分子的硝基苯甲酸被封在树枝状聚合物。约70％的树枝状聚合物的端氨基为τ-BOC-丙氨酸改性。
在134mg四级聚丙胺树枝状聚合物(32节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)28：丙胺)、490mg t-BOC-色氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯和286mg孟加拉粉红存在下重复实施例I。约2分子的孟加拉粉红被封在树枝状聚合物中。约71％的树枝状聚合物的端氨基为t-BOC-色氨酸改性。实施例LXXIV：两种不同活性物质的封入和选择性释出。
在99mg五级聚丙胺树枝状聚合物(64节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)、278mg t-BOC-缬氨酸的羟基琥珀酰亚胺酯和254mg二硝基苯甲酸(活性物质I)和236mg孟加拉粉红(活性物质II)存在下重复实施例I。分别有10个分子的二硝基苯甲酸和4个分子的孟加拉粉红被封在树枝状聚合物中。
在甲酸中回流2小时并在氯仿中透析2天后孟加拉粉红的载荷为每个树枝状聚合物分子4个分子。二硝基苯甲酸被全部从树枝状聚合物中除去。
在盐酸中回流2小时并在水中透析过夜后，孟加拉粉红的载荷是每个树枝状聚合物分子0.005分子。树枝状聚合物以第五级胺封端的树枝状聚合物的形式被回收。所有的t-BOC-缬氨酸基团均能从树枝状聚合物中除去。实施例LXXV：
在99mg五级聚丙胺树枝状聚合物(64节：1，4-二氨基丁烷[4]：(1-氮杂亚丁基)60：丙胺)、278mg t-BOC-缬氨酸的羟基琥珀酰胺酯和75mg硝基苯酚(活性物质I)和25mg甲基紫3RAX(Aldrich)(活性物质II)和如表3a所示的多种不同的封端剂存在下重复实施例I。 表3a封端剂mgpamg酯Y(％)载荷(I)载荷(II)N-FMOC-β-丁基-天冬氨酸-羟基琥珀酰亚胺酯 *512364088，2N-FMOC-O-叔丁基-L-丝氨酸-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三唑482278243，9N-FMOC-L-苯丙氨酸五氟代苯酯904475287，6N-FMOC-S-三苯甲游基-L-半胱氨酸五氟苯酯714785344，2N-FMOC-L-丙氨酸五氟苯酯492087987，8*处理后，看来50％的FMOC消失了。
活性物质I是通过首先将该轭合物与20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液一起搅拌，接着在乙醇中透析六次而被选择性释出。硝基苯酚(I)和甲基紫3RAX(II)各自的载荷示于表3b中。 表3b封端剂载荷(I)载荷(II)N-FMOC-β-叔丁基-天冬氨酸-羟基琥珀酰亚胺酯03，9N-FMOC-O-叔丁基-L-丝氨酸-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三唑03，7N-FMOC-L-苯丙氨酸五氟代苯酯O7，3N-FMOC-S-三苯甲游基-L-半胱氨酸五氟苯酯04，0N-FMOC-L-丙氨酸五氟苯酯00，05
然后，将该轭合物在6N盐酸的溶液中煮沸两小时，蒸发溶剂，并将剩余的溶液中和。然后将轭合物顺次在乙醇和水中透析。硝基苯酚(I)和甲基紫3RAX(II)的载荷分别示于表3c中。 表3c封端剂载荷(I)载荷(II)N-FMOC-β-叔丁基-天冬氨酸-羟基琥珀酰亚胺酯00，01N-FMOC-O-叔丁基-L-丝氨酸-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三唑00，02N-FMOC-L-苯丙氨酸五氟代苯酯00，02N-FMOC-S-三苯甲游基-L-半胱氨酸五氟苯酯00，01N-FMOC-L-丙氨酸五氟苯酯00，02
这些实施例表明，具有不同尺寸的活性物质可被选择性地从树枝状聚合物中释出。
在用N-FMOC-L-丙氨酸五氟苯酯作封端剂的情况下，在用哌啶处理，接着分别用二甲基甲酰胺和乙醇透析后活性物质I和II被释放出来。