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1、(10)申请公布号 CN 102925450 A (43)申请公布日 2013.02.13 CN 102925450 A *CN102925450A* (21)申请号 201210468540.3 (22)申请日 2012.11.19 C12N 15/12(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 南京师范大学 地址 210046 江苏省南京市亚东新城区文苑 路 1 号 (72)发明人 许晓风 王薇 薛文达 章熙霞 金邦荃 马飞 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 山猪 。
2、CAST 基因特异分子标记及应用 (57) 摘要 本发明属于动物基因工程技术领域， 具体涉 及一种作为猪分子标记辅助选择应用的分子标记 的制备及应用。本发明制备的分子标记从山猪 CAST 基因中克隆得到， 所述的分子标记的核苷酸 序列SEQ ID No.2所示， 该分子标记是山猪的特异 变异点。本发明还公开了扩增该分子标记所用的 引物以及用于山猪 CAST 基因特异分子标记检测 的方法， 为山猪分标记辅助选择提供了一个新的 分子标记。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书。
3、 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 山猪 CAST 基因， 其特征在于， 它的序列如 SEQ ID No.1 所示。 2. 山猪 CAST 基因分子标记， 其特征在于， 它的序列如 SEQ ID No.2 所示。 3.一对用于检测权利要求2所述山猪CAST基因分子标记的特异性引物， 其特征在于该 引物对的序列如 SEQ ID No.5 和 SEQ ID No.6 所示。 4. 权利要求 2 所述山猪 CAST 基因分子标记在育种目标选择中的应用。 5. 一种山猪 CAST 基因特异分子标记检测方法， 包括以下步骤 ： 是采用如 SEQ ID No.5 。
4、和 SEQ ID No.6 所示特异引物对 DNA 样本进行 PCR 扩增， 获得 435bp 的特异扩增条带的样 本为目标样本。 权 利 要 求 书 CN 102925450 A 2 1/3 页 3 山猪 CAST 基因特异分子标记及应用 技术领域 0001 本发明属于动物基因工程技术领域。 技术背景 0002 山猪 （Shanzhu） 是江苏省的特色地方猪品种， 具有肉质优良、 瘦肉率高、 强健好养、 产仔数多、 抗病抗逆性强等优良特性。 随着引进猪种的冲击和大面积推广， 山猪面临着优良 基因流失和优良性状逐年退化的威胁。目前采用传统育种方法来保护该地方良种猪， 并使 之选育提高。 000。
5、3 传统育种方法大多利用杂种优势对山猪进行选育， 但是受环境条件的干涉与影响 大， 以表型为基础的选择复杂， 育种周期长， 耗时耗力。利用 DNA 分子标记技术可以对山猪 种质资源中重要经济性状基因进行分子作图与标记， 准确地对育种目标进行选择， 大大缩 短育种周期， 提高育种效率。但目前研究的 DNA 分子标记均不是山猪的特异变异点， 限制了 分子标记辅助选择技术在山猪育种研究中的应用。在山猪肉质相关基因的研究中， 我们发 现山猪的 CAST 基因与几乎所有国内外猪品种的 CAST 基因存在显著差异， 即在山猪的 CAST 基因中存在一个特有的小片段插入， 其他猪品种 CAST 基因中均未发。
6、现该小片段插入。 发明内容 0004 本发明成功利用山猪 CAST 基因中特有的小片段插入， 建立一种特异性检测山猪 CAST 基因的分子标记辅助选择的方法， 为山猪种质资源利用和分子标记辅助育种服务。 0005 本发明所述的山猪 CAST 基因， 它的序列如 SEQ ID No.1 所示。与几乎所有国内外 猪品种的 CAST 基因相比， 山猪 CAST 基因存在一个特有的小片段插入， 即 SEQ ID No.1 中的 第 1032 1035 的 4 个碱基 CTTT。 0006 本发明所述的山猪CAST基因特异分子标记， 长度为435bp,其序列如SEQ ID No.2 所示 ； 其特异性引。
7、物为 ： 0007 F:5 -GTACTTTCTTTGAATTACAG-3 （SEQ ID No.5） 0008 R:5 -GCAGATACACCCGTAACTG-3 （SEQ ID No.6） 。 0009 本发明山猪是在江苏省南京市畜牧家禽科学研究所山猪扩繁基地采集。 该猪种具 有以下特点 ： 0010 a. 形态特征 ： 山猪体型稍小， 被毛全黑， 脸面呈狮子头型、 马头型或鲫鱼头型， 皮 肤较粗无皱褶， 四肢有力， 身体粗短。 0011 b.肉质特征 ： 山猪经产母猪产仔数12-14头。 生长速度为100kg体重日龄150-160 天， 日增重 800-850g。瘦肉率 60% 以上，。
8、 100kg 体重的活体背膘厚 22-25mm， 肌内脂肪 3.0-3.3%， 无 PSE 肉、 DFD 肉， 系水力 （滴水损失 %） 3， 大理石纹评分 3.0-3.5， 肉色评分 3.0-4.0， 拿破率 76%， PH45 6.2-6.6， PH24 5.5-5.8， 嫩度 3.8kg。 0012 本发明采用特异引物从山猪猪耳样本中扩增出山猪CAST基因第8外显子片段， 再 采用特异设计的引物 （序列如 SEQ ID No.5 和 SEQ ID No.6） 从第 8 外显子片段中扩增出山 说 明 书 CN 102925450 A 3 2/3 页 4 猪 CAST 基因的特有片段。 00。
9、13 以 GenBank 中登录号为 AY594692 的序列为参照， 山猪 CAST 基因的核苷酸序列特 征是 ： 山猪 CAST 基因在 AY594692 序列的 1031 和 1032 之间存在特有的小片段 CTTT 插入， 其他猪品种均未发现该小片段插入。 0014 一对用于检测权利要求2所述山猪CAST基因分子标记的特异性引物， 该引物对的 序列如 SEQ ID No.5 和 SEQ ID No.6 所示。 0015 本发明还公开了所述山猪 CAST 基因分子标记在育种目标选择中的应用。 0016 用 CAST 基因进行山猪分子标记辅助选择的检测方法， 是采用如 SEQ ID No.。
10、5 和 SEQ ID No.6所示特异引物对DNA样本进行PCR扩增， 获得435bp的特异扩增条带的样本为 目标样本。 0017 通过上述方法制备的 CAST 基因分子标记， 可有效检测山猪 CAST 基因在山猪与其 他猪品种进行杂交所产生的各种杂交后代中的表现， 使其对山猪分子标记辅助选择具有 广泛的应用价值。如运用该检测技术对不同猪品种的 CAST 基因分子标记进行检测， 结果 显示， 在 90 头山猪中， 检测到 89 头山猪的 CAST 基因具有该特异的分子标记， 检出率达到 98.89% ； 在 50 头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交 F1 代群体中， 检测到 49 头猪 的。
11、 CAST 基因具有该特异的分子标记， 检出率达到 98% ； 在 40 头山猪与其他猪品种进行杂交 所产生的杂交 F2 代群体中， 检测到 28 头猪的 CAST 基因具有该特异的分子标记， 检出率达 到 70% ； 在杜洛克猪、 巴克夏猪等猪品种中未检测出该特异的分子标记。本发明制备的山猪 CAST 基因特异分子标记可以准确地对育种目标进行选择。 0018 本发明是基于动物基因工程技术的作为山猪分子标记辅助选择应用的 CAST 基因 特异分子标记的制备及应用， 具有对育种目标选择周期短， 操作简单， 受环境因素影响小， 选择具有很高的准确度等一系列优点， 并且制备的 CAST 基因分子标记。
12、是山猪的特异变异 点， 可以为山猪分子标记辅助选择育种提供可靠的平台。 附图说明 0019 图 1 对不同猪品种的 CAST 基因分子标记检测部分图谱。1 ： 杜洛克猪 ； 2 ： 巴克夏 猪 ； 3、 4 ： 山猪 ； 5、 6 ： 杂交 F1 代 ； 7,8 ： 杂交 F2 代。 0020 图 2 对不同猪品种的 CAST 基因分子标记检测部分图谱。1、 2 ： 杂交 F1 代 ； 3、 4 ： 杂 交 F2 代 ； 5、 6 ： 山猪 ； 7 ： 杜洛克猪。 具体实施方式 0021 实施例 1 山猪 CAST 基因的分子标记的建立 0022 （1） 提取山猪基因组 DNA ： 采集山猪猪。
13、耳样本， 置于含有 0.5mL 75% 乙醇的 1.5mL 离心管中， 4或 -20保存， 采用酚氯仿方法提取基因组 DNA ； 0023 （2）制备 CAST 基因部分片段 ： 采用引物序列 F:5 -TGCGCTGAGCCACAAAGAGA-3 （SEQ IDNo.3） 和 R:5 -TGCAGGGCTGGTCACATCAG-3 （SEQ ID No.4） 对步骤 （1） 中获得的山 猪基因组DNA进行CAST基因的PCR扩增， 获得一条约1440bp的扩增条带， 其序列如SEQ ID No.1 ； PCR反应体系是20L ： 10缓冲液2L， 1.5mmol/L MgCl21.2L， 1。
14、0mmol/L dNTP混 合物 0.4L， 10mol/L 引物各 0.3L， 100ng/L 模板 DNA 1.2L， 5U/L Taq DNA 聚合 说 明 书 CN 102925450 A 4 3/3 页 5 酶 0.2L ； PCR 循环参数是 ： 94预热 3min， 然后以 94变性 30s， 61退火 30s， 72延伸 45s， 进行 30-35 个循环， 最后于 72延伸 7min。 0024 （3）制备山猪 CAST 基因的分子标记 ： 以步骤 （2）得到的 PCR 产物为模板， 以 F:5 -GTACTTTCTTTGAATTACAG-3 （SEQ ID No.5） 和 。
15、R:5 -GCAGATACACCCGTAACTG-3 （SEQID No.6） 为引物对进行 PCR 扩增， 获得 435bp 的特异扩增条带。PCR 反应体系是 20L ： 10 缓冲液 2L， 1.5mmol/L MgCl21.2L， 10mmol/L dNTP 混合物 0.4L， 10mol/L 引物各 0.3L， 100ng/L模板DNA 1.2L， 5U/L Taq DNA聚合酶0.2L ； PCR循环参数是 ： 94 预热 3min， 然后以 94变性 30s， 61退火 30s， 72延伸 45s， 进行 30 个循环， 最后于 72 延伸 7min。PCR 产物可直接测序 （上。
16、海生工生物工程股份有限公司提供测序服务） 后即得山 猪 CAST 基因特异分子标记， 其序列如 SEQ ID No.2 所示。 0025 实施例 2 ： 0026 采集山猪、 杜洛克猪、 巴克夏猪等猪品种猪耳样本， 置于含有 0.5mL 75% 乙 醇的 1.5mL 离心管中， -20保存， 采用酚氯仿方法提取基因组 DNA。采用引物序列 F:5 -GTACTTTCTTTGAATTACAG-3 （SEQ ID No.5） 和 R:5 -GCAGATACACCCGTAACTG-3 （SEQID No.6） 对分别上述获得的基因组 DNA 进行 PCR 扩增， PCR 反应体系如实施例 1 步骤 。
17、（3） 。结 果如图1、 图2， 在90头山猪中， 检测到89头山猪的CAST基因具有该特异的分子标记 （435bp 的扩增条带） ； 检出率达到 98.89%。而杜洛克猪、 巴克夏猪等猪品种中未检测出该特异的分 子标记。 0027 实施例 3 0028 提取50头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交F1代的基因组DNA， 采用引物 序列 F:5 -GTACTTTCTTTGAATTACAG-3 （SEQ ID No.5） 和 R:5 -GCAGATACACCCGTAACTG-3 （SEQID No.6） 对杂交 F1 代的基因组 DNA 进行 PCR 扩增， 获得 435bp 的扩增条带 （图。
18、 1、 图 2） 。PCR 反应体系如实施例 1 步骤 （3） 。结果在 50 头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的 杂交 F1 代群体中， 检测到 49 头猪的 CAST 基因具有该特异的分子标记， 检出率达到 98%。 0029 实施例 4 0030 提取40头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交F2代的基因组DNA， 采用引物 序列 F:5 -GTACTTTCTTTGAATTACAG-3 （SEQ ID No.5） 和 R:5 -GCAGATACACCCGTAACTG-3 （SEQID No.6） 对杂交 F2 代的基因组 DNA 进行 PCR 扩增， 获得 435bp 的扩增条带 （图 1、 图 2） 。PCR 反应体系如实施例 1 步骤 （3） 。结果在 40 头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的 杂交 F2 代群体中， 检测到 28 头猪的 CAST 基因具有该特异的分子标记， 检出率达到 70%。 说 明 书 CN 102925450 A 5 1/2 页 6 序列表 序 列 表 CN 102925450 A 6 2/2 页 7 序 列 表 CN 102925450 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102925450 A 8 。