《一株海洋真菌分枝孢子菌属真菌球孢枝孢及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株海洋真菌分枝孢子菌属真菌球孢枝孢及其应用.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102911877 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102911877 A *CN102911877A* (21)申请号 201210308285.6 (22)申请日 2012.08.27 CCTCC No ： M 2012290 2012.07.18 C12N 1/14(2006.01) C12P 1/02(2006.01) A61K 36/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18 号 (72)发明人 王。
2、鸿 谢燕瑾 叶建军 潘超 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 冷红梅 (54) 发明名称 一株海洋真菌分枝孢子菌属真菌球孢枝孢及 其应用 (57) 摘要 本 发 明 提 供 了 一 株 具 有 抗 肿 瘤 活 性 的 海洋真菌分枝孢子菌属真菌球孢枝孢 （Cladosporium sphaerospermum） MNP100102A 及 其应用。 该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮编 430072， 保藏编 号 ： CCTCC No ： M 2012290， 保藏日期 ： 2012 年 7 月 18 日。本发。
3、明的有益效果主要体现在 ：（1） 本发 明菌株营养要求简单、 容易培养 ；（2） 该菌株的代 谢产物具有抗肿瘤活性 ；（3） 该菌株的次级代谢 产物的抗肿瘤活性高， 其培养所得的发酵液总浸 膏对肝癌细胞 （HepG2） 有一定的抗肿瘤活性， 对 其总浸膏进行过 HP-20 大孔树脂柱处理， 收集得 到的小极性部位对HepG2和PC12细胞的抑制活性 在浓度200g/ml时抑制率可达95%以上， 具有很 强的抗肿瘤活性。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。
4、要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/1 页 2 1.一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮编 430072， 保藏 编号 ： CCTCC No ： M 2012290， 保藏日期 ： 2012 年 7 月 18 日。 2. 如权利要求 1 所述的球孢枝孢菌 100102A 在制备抗肿瘤药物中的应用。 3. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于所述抗肿瘤药物为治疗肝癌或神经癌的药 物。 4. 如权利要求 2 或 。
5、3 所述的应用， 其特征在于所述球孢枝孢菌 100102A 提取物在制备 抗肿瘤药物中的应用。 5. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于所述提取物为正丁醇提取物， 由如下方法获 得 ： 球孢枝孢菌 100102A 接种至液体发酵培养基， 于 2535、 150250r/min 振荡条件下培 养 1430 天， 得到发酵液， 发酵液经细胞破碎， 离心取滤液用正丁醇萃取， 萃取液浓缩得浸 膏， 浸膏以乙醇 ： 水体积比为 2 ： 810 ： 0 为流动相， 进行 HP-20 大孔树脂层析过柱， 梯度洗 脱， 收集乙醇体积浓度 80% 以上的洗脱液， 旋蒸浓缩挥干， 即得所述正丁醇提取物 ； 。
6、所述液 体培养基组成为 ： 葡萄糖 820 g/L， 蛋白胨 1.53 g/L， 酵母膏 0.82g/L， 溶剂为水 ： 人工 海水体积比 1 ： 14 的混合液， pH 78。 权 利 要 求 书 CN 102911877 A 2 1/5 页 3 一株海洋真菌分枝孢子菌属真菌球孢枝孢及其应用 （一） 技术领域 0001 本发明涉及一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌分枝孢子菌属真菌球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 及其应用。 （二） 背景技术 0002 癌症一直都是人类难以攻克的一个难题， 寻找生理活性强的物质成为人类攻克疾 病的主要工作之一。海。
7、洋微生物代谢产物研究是近年来国际上新兴的研究课题。 0003 由于对陆生动植物的药源发现越来越稀少， 海洋已成为人类开垦新药的处女地。 海洋约占地球总面积 71%， 蕴藏着极其丰富的生物资源， 是有机物质的最大生产者。在各种 天然生物活性分子的来源中， 海洋微生物是最有潜能的。 不像陆生植物， 海洋微生物能够产 生卤代次生代谢产物。自 1928 年青霉素的首次发现使之在细菌感染的治疗中有一很大突 破， 真菌便成为治疗疾病的药物的重要来源之一。随之在 1971 年分离得到的环孢霉素推动 了其在免疫药理学方面的进一步发展。海洋真菌的代谢产物不仅对于药物的开发必不可 少， 同时它在植物保护方面也非常。
8、重要， 使海洋真菌的研究前景更加广泛。 目前研究较多的 抗肿瘤、 抑制乙酰胆碱酯酶、 抗细菌和抗氧化等海洋真菌次级代谢产物已成为具有生物医 学意义的天然化合物丰富来源， 均具有广阔的药用前景。故从海洋真菌的次级代谢产物中 发现高活性的物质对于发现先导化合物非常的重要， 对疾病的攻克也具有着重要的意义。 （三） 发明内容 0004 本发明目的是一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌分枝孢子菌属真菌球孢枝孢 菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A， 及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 0005 本发明采用的技术方案是 ： 0006 一 株 具 有 抗 肿 瘤 活 性 的 。
9、海 洋 真 菌 球 孢 枝 孢 菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮编 430072， 保藏编号 ： CCTCC No ： M 2012290， 保藏日期 ： 2012 年 7 月 18 日。 0007 所述球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 的菌落特征如下 ： 涂布或划线接种于平板培养基上生长迅速， 28培养 48 h 后长出圆形、 墨绿色、 直径约 0.30.5 cm 的菌落 ； 该菌株菌体生长特征如下 ： 在液体培养基中。
10、， 28培养 48 h 后呈颗粒 状贴壁生长 ； 该菌株生理生化特性如下 ： 革兰氏染色阳性。 0008 本发明所述球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 由浙江省东海 海域采集的海水中分离和筛选得到的菌株。 0009 菌株的筛选纯化方法为 ： 将采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上， 28培养至菌落数量不再增加， 挑取单菌落至斜面培养基上。 28培养2d， 以菌株形态特征 区别进行挑选， 即得该菌株， 并对该菌株进行菌种鉴定。 0010 所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同， 组成为 ： 土豆 150350g/L， 葡萄 糖 1030。
11、g/L， 琼脂 1535g/L， 溶剂为水， pH7.28.0。本发明经筛选获得的球孢枝孢菌 说 明 书 CN 102911877 A 3 2/5 页 4 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A， 涂布或划线接种在平板培养基上生长迅速， 28培养 48 h 后长 出圆形、 墨绿色、 直径约 0.10.3 cm 的菌落。 0011 将所述的球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 的 16sRNA 部分核 苷酸序列与美国国立生物信息中心 （National Center for Biotechnology Info。
12、rmation USA， NCBI）的基因库中的微生物 16sRNA 序列比对， 将其命名球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A。该菌株的 16s rRNA 的部分核苷酸序列如下 ： 0012 TCCGTAGGGGTAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTTGACCCCGGCCCTCGGGCCGGGATGTTCACAAC CCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTCCGGGCGGGGGCCCCGGGTGGACATTTCAAACTCT TGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAATTTAAT。
13、TAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCG ATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT GCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCGAC GCGGTCCGCCGCGCGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTTCGTCCCCTCAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGG TGCCGCGGGAGGCCACGCC。
14、GTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT TAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA 0013 本发明还涉及所述的菌球孢枝孢菌 100102A 在制备抗肿瘤药物中的应用。 0014 所述抗肿瘤药物为治疗肝癌或神经癌的药物。 0015 具体的， 所述应用为所述球孢枝孢菌 100102A 提取物在制备抗肿瘤 药物中的应 用。 0016 优选的， 所述提取物为正丁醇提取物， 由如下方法获得 ： 球孢枝孢菌 100102A （CCTCC No ： M 2012290） 接种至液体发酵培养基， 于 2535、 150250。
15、r/min 振荡条件下培 养 1430 天， 得到发酵液， 发酵液经细胞破碎， 离心取滤液用正丁醇萃取， 萃取液浓缩得浸 膏， 浸膏以乙醇 ： 水体积比为 2 ： 810 ： 0 为流动相， 进行 HP-20 大孔树脂层析过柱， 梯度洗 脱， 收集乙醇体积浓度 80% 以上的洗脱液， 旋蒸浓缩挥干， 即得所述正丁醇提取物 ； 所述液 体培养基组成为 ： 葡萄糖 820 g/L， 蛋白胨 1.53 g/L， 酵母膏 0.82g/L， 溶剂为水 ： 人工 海水体积比 1 ： 14 的混合液， pH 78。 0017 所述人工海水每 100 ml 组成为 ： NaCl 2.448 g， Na2SO4。
16、 0.3917 g， KCl 0.0664 g， KBr 0.0096 g， SrCl2 0.0024 g， MgCl 6H2O 0.4981 g， CaCl2 H2O 0.1102 g， NaHCO3 0.0192 g， H3BO3 0.0026 g， NaF 0.0004 g， 蒸馏水 100 ml。 0018 所述菌株在培养前， 通常需要先经斜面培养活化， 然后经种子培养、 获得种子菌株 再接入液体发酵培养基进行产酶培养。 0019 所述的斜面培养基组成为 ： 土豆 150350g/L， 葡萄糖 1030g/L， 琼脂 1535g/L， 溶 剂为水， pH7.28.0。 0020 所述的。
17、平面种子培养基组成为 ： 葡萄糖 815g/L， 蛋白胨 1.54g/L， 酵母膏 0.51.5g/L， 琼脂 1520g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1 ： 14 的混合液， pH7.28.0。 0021 所述的液体发酵培养基组成为 ： 葡萄糖 815g/L， 蛋白胨 1.53g/L， 酵母膏 0.82g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1 ： 14 的混合液， pH78.0。 0022 具体的， 所述提取物可由如下方法获得 ： 0023 （1）将海洋真菌球孢枝孢菌 CCTCC No ： M 2012290 菌株接种于斜面培养基， 于 2535培养 2448 h， 得到活化后的菌。
18、种 ； 所述的斜面培养基组成为 ： 土豆 150350g/L， 葡 说 明 书 CN 102911877 A 4 3/5 页 5 萄糖 1030g/L， 琼脂 1535g/L， 溶剂为水， PH7.28.0 ； 0024 （2） 将步骤 （1） 活化培养后海洋真菌孢枝孢菌 CCTCC No ： M 2012290 菌体接种至 液体种子培养基中， 于 2535条件下培养 1648h， 得到种子菌 ； 所述液体种子培养基组成 为 ： 葡萄糖815 g/L， 蛋白胨 1.54 g/L， 酵母膏 0.51.5 g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1 ： 14 的混合液， pH7.28.0 ； 00。
19、25 （3） 将步骤 （2） 种子菌株以 1%10% 的体积比的接种量， 移种到液体发酵培养基中， 于2535、 150250 r/min振荡条件下培养1430天， 得到发酵液 ； 所述液体发酵培养基组 成为 ： 葡萄糖 820 g/L， 蛋白胨 1.53 g/L， 酵母膏 0.82g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1 ： 14 的混合液， pH 78 ； 0026 （4） 将步骤 （3） 的发酵液于 4条件下细胞破碎、 离心或者过滤， 分离除去菌体， 取 滤液用正丁醇萃取后收集上层萃取液， 浓缩挥干制得的油状提取物总浸膏 ； 0027 （5） 将步骤 （4） 的油状提取物总浸膏进行 H。
20、P-20 大孔树脂柱处理， 以乙醇 ： 水体积 比为 2 ： 810 ： 0 为流动相， 梯度洗脱， 收集乙醇体积浓度 80% 以上的洗脱液， 旋蒸浓缩挥干， 即得所述正丁醇提取物。 0028 本发明的有益效果主要体现在 ：（1）本发明的海洋真菌菌株球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 营养要求简单、 容易培 养 ；（2） 该菌株的代谢产 物具有抗肿瘤活性 ；（3） 该菌株的次级代谢产物的抗肿瘤活性高， 其培养所得的发酵液总 浸膏对肝癌细胞 （HepG2） 有一定的抗肿瘤活性。 对其总浸膏进行过HP-20大孔树脂柱处理， 收集得到的小极性部位对。
21、 HepG2 和 PC12 细胞的抑制活性在浓度 200g/ml 时抑制率可达 95% 以上， 具有很强的抗肿瘤活性。 （四） 附图说明 0029 图 1 为平板培养基上球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 的菌 落形态 ； 0030 图 2 为光学显微镜下球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 的菌 体形态。 （五） 具体实施方式 0031 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0032 实施例 1 ： 菌株的筛选、 纯化及鉴定 0033 （1） 将自。
22、东海海域采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上， 28培养 至菌落数量不再增加， 挑取单菌落至斜面培养基上。 28培养2d， 以菌株形态特征区别进行 挑选， 即得该菌株。 所述土豆平板培养基按如下组成配制 ： 土豆200g， 葡萄糖20g， 琼脂20g， 蒸馏水 1000ml ； 0034 （2） 对筛选获得的菌株 100102A 进行 16sRNA 的 PCR 产物核苷酸序列比对， 将其命 名为球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A， 提交中国典型培养物保藏中 心， 保藏号 ： CCTCC No ： M 2012290， 保藏日期 201。
23、2 年 7 月 18 日。 0035 实施例 2 ： 菌株的活化及大规模培养 说 明 书 CN 102911877 A 5 4/5 页 6 0036 (1) 将实施例 1 中筛选获得的菌株接种于斜面培养基， 于 28培养 2448h， 得到 活化后的菌株， 所述斜面培养基按如下组成配制 ： 土豆 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 20g， 蒸馏水 1000ml。 0037 (2) 将步骤 （1）活化培养后的菌株接种至液体种子培养基中， 于 28、 150250 r/min 振荡条件下培养 2448h， 得到种子液， 所液体种子培养基按如下组成配制 ： 葡萄糖 10g， 蛋白胨 2g， 酵母膏。
24、 1g， 蒸馏水 400ml， 人工海水 600ml， pH7.5。 0038 (3) 将步骤 （2） 种子液以 8% 的体积比的接种量， 移种到大规模液体发酵培养基中， 于 28、 150250 r/min 振荡条件下培养 21d， 得到发酵液。所述液体发酵培养基按如下组 成配制 ： 葡萄糖 10g， 蛋白胨 2g， 酵母膏 1g， 蒸馏水 400ml， 人工海水 600ml， pH7.5。 0039 实施例 3 ： 海洋真菌球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 在抗肿 瘤活性中的应用 0040 (1) 将实施例 2 中培养所得的发酵液先于超。
25、声波细胞破碎仪中进行菌体破碎 20min， 然后于 4条件下离心 （9000r/min， 15min） （或者过滤也可） ， 除去菌体， 用等体积正 丁醇进行萃取， 对萃取相进行旋蒸， 所得浸膏即为该菌株的次级代谢产物总浸膏。 0041 (2) 将实施例 2 所得的发酵液总浸膏进行粗略的分离， 取 10g 总浸膏进行上柱 （柱 高 170cm， 直径 1cm， 填料 HP-20 大孔吸附树脂） ， 用乙醇 : 水体积比为 2 8， 4 6， 6 4， 8 2， 10 0 的洗脱剂分别进行冲洗， 每个梯度冲洗 500ml， 对冲洗所得液体进行旋蒸处 理， 最 终得 5 个部位， 分别标为 A、 。
26、B、 C、 D、 E。 0042 (3) 将步骤 （1） 所得的发酵液总浸膏以及步骤 （2） 所得的 5 个部位 A、 B、 C、 D、 E 进行抗肿瘤活性测定。具体步骤如下 ： 选取两株肿瘤细胞， 分别为肾上腺嗜铬细胞瘤 （PC12 细胞） 和肝癌细胞 （HepG2 细胞） ， 取对数期的细胞株制成细胞悬液， 接种于 96 孔板中， 培养 48h， 待测样品 （总浸膏、 5 个部位 A、 B、 C、 D、 E） 加入 0.1%DMSO10L 溶解后， 用无血清的 1640 细胞培养基稀释， 加 100L 至试验组中， 使得最终发酵液总浸膏的浓度分别为 50g/ml、 100g/ml、 200。
27、g/ml、 400g/ml、 800g/ml， 5 个部位 A、 B、 C、 D、 E 的浓度均为 200g/ ml， 阴性对照组加等量不含样品的无血清培养基， 空白对照组则为无细胞和样品的无血清 培养基， 依托泊苷 （VP-16）作为阳性对照品， 每个浓度设 5 个复孔， 肿瘤细胞在 CO2 培养 箱 （37） 培养 48h， 每孔加入 5mg/ml 的 MTT20L， 继续培养 4h 后， 小心移去上清， 每孔加 DMSO150L， 振荡 10min， 用酶标仪充分振荡使得 MTT 紫色产物完全溶解， 测 490nm 的 A 值， 根据公式 ： 抑制率 =（A 阴性对照组 -A 空白对照组。
28、） -（A 样品组 -A 空白对照组） /（A 阴性 对照组 -A 空白对照组） 即可求得抑制率。 0043 (4) 根据步骤 （1） -（3） 所得的数据见表 13。 0044 表 1 ： 菌株发酵液浸膏对 HepG2 细胞的抑制作用 0045 药物浓度 （g/ml）抑制率 （%） 5036.30 10036.78 20037.01 40045.94 80051.20 0046 表 2 ： 菌株发酵液浸膏对 PC12 细胞的抑制作用 0047 说 明 书 CN 102911877 A 6 5/5 页 7 药物浓度 （g/ml）抑制率 （%） 503.85 10013.03 20011.94 。
29、40017.28 80022.38 0048 表 3 ： 5 个极性部位对 HepG2 细胞的抑制作用 0049 样品 浓度 （g/ml）抑制率 （%） A2005.91 B2008.50 C20020.95 D20097.69 E20099.49 0050 表 4 ： 5 个极性部位对 PC12 细胞的抑制作用 0051 样品 浓度 （g/ml）抑制率 （%） A2004.54 B2007.10 C20023.01 D20095.78 E20096.07 0052 由表中数据可得 ： 海洋真菌球孢枝孢菌 （Cladosporium sphaerospermum） 100102A 的次级代谢产物的抗肿瘤活性高， 其培养所得的发酵液总浸膏对肝癌细胞 （HepG2） 有一定 的抗肿瘤活性。 对其总浸膏进行过HP-20大孔树脂柱处理， 收集得到的小极性部位对HepG2 和 PC12 细胞的抑制活性在浓度 200g/ml 时抑制率可达 95% 以上， 具有很强的抗肿瘤活 性。 说 明 书 CN 102911877 A 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 102911877 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102911877 A 9 。