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1、(10)申请公布号 CN 102911947 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102911947 A *CN102911947A* (21)申请号 201110218780.3 (22)申请日 2011.08.01 C12N 15/34(2006.01) C12N 15/866(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C07K 14/01(2006.01) (71)申请人 普莱柯生物工程股份有限公司 地址 471000 河南省洛阳市高新区凌波路 (72)发明人 张许科 孙进忠 白朝勇 (74)专利代理机构 北京华夏正合知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 。
2、11017 代理人 韩登营 (54) 发明名称 猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种利用家蚕生物反应器生产 PCV2 Cap蛋白的方法及Cap蛋白制品， 包括 ： 克隆 PCV2 Cap蛋白的编码基因序列， 至重组杆状病毒， 使用重组昆虫杆状病毒直接注射感染家蚕幼虫或 蚕蛹， 回收并分离纯化 PCV2 Cap 蛋白。本发明具 有操作简单、 周期短的特点， 避免了病毒同源重组 噬斑筛选这一难以操作并成功率低的步骤， 极大 地缩短了实验周期 ； 操作简单， 成本低， 后提取方 法简单， 适合工业化的生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书。
3、 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1.一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤 ： (1).克隆猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码基因序列， 转入转移载体， 获得包含猪圆环病 毒 2 型 Cap 蛋白编码基因的重组转移载体 ； (2). 将上述重组转移载体转化入含有病毒穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中， 获得含 有猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组穿梭载体， 再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中， 获得重组杆。
4、状病毒 ； (3). 重组昆虫杆状病毒注射感染家蚕幼虫或蚕蛹 ； (4). 回收获重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴 ； (5). 分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤(1)中猪圆环病毒2型Cap蛋 白的编码序列包含序列表中的 SEQ ID NO1。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤(2)中所述的猪圆环病毒2型 Cap 蛋白编码的基因的表达受多角体启动子的控制。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述的昆虫杆状病毒包括昆虫 核型多角体病毒。 5. 根据权利要求 1 所。
5、述的方法， 其特征在于， 步骤 (2) 中所述的昆虫细胞包括 Sf9 细 胞。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中所述的 家蚕品种包括 Dazao、 Luobendihong、 Baohuang、 Hungary、 Qiansanmian、 Datuanyuan、 Ankang、 Lan 5、 Ri110、 Dongfei、 Su16、 Su14、 YingHXZ、 Haoyue。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中所述的重组猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白序列包含序列表中的 SEQ ID NO2。 8. 根据权利要求 1 所。
6、述的方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中所述的重组猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白为如下三种多肽的任意一种 ： 1) 含有序列表中的 SEQ ID NO2 序列的多肽 ； 2) 与 1) 所述多肽至少 80同源的多肽 ； 3)1) 和 2) 所述多肽的免疫原性部分。 9. 根据权利要求 1 8 任意一项的方法生产的重组猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102911947 A 2 1/5 页 3 猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白及其制备方法， 特别是指一种使用基因 工程手段在家蚕中生产制。
7、备的猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白及其方法， 属于基因工程领域。 背景技术 0002 猪圆环病毒 (Porcine circovirus， PCV) 属圆环病毒属， 是一种二十面对称、 共 价闭合、 环状、 单股 DNA 病毒。根据 PCV 的致病性、 抗原性及核苷酸序列的不同， 可将 PCV 分为猪圆环病毒 1 型 (PCV1) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2)。其中， PCV1 对猪无致病性， PCV2 对临床危害很大， 它可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征 (Postweaning multisystemic wastingsyndrome， PMWS)、 猪皮炎肾病综合征 (PDNS。
8、)、 猪呼吸道疾病综合征及先天性震颤等 多种疾病的爆发， 给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。研究发现， PCV2 含有 11 个开放 阅读框 (Open reading frame， ORF)， ORF1 和 ORF2 为最主要的两个阅读框。现已证实 ORF2 为编码病毒的主要结构蛋白和衣壳蛋白 (Cap)， Cap 蛋白上存在抗原表达位点， 具有免疫原 性， 是 PCV2 特异性血清学检测方法和亚单位疫苗、 核酸疫苗的基础。 0003 普莱柯生物工程股份有限公司的发明 CN 101920012 A 公开了一种家蚕生物反应 器生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法， 以家蚕核型多角体病毒。
9、 (BmNPV) 为载体， 通过转移 载体中的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因同源 重组的方式将猪圆环病毒2型Cap蛋白基因整合至家蚕核型多角体启动子下进行目的蛋白 表达， 可以获得 PCV2 Cap 蛋白的大规模表达， 制备成含有重组猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的 亚单位疫苗。但该方法需要通过使用 BmNPV 与 AcNPV 共转染并通过噬斑筛选的方法， 获得 含 PCV2 Cap 蛋白的重组家蚕核型多角体病毒， 而 BmNPV 与 AcNPV 同源重组的几率低， 噬斑 筛选存在工作量大、 成功率低的缺点 ； 此外， 噬斑筛选需要培养家蚕细胞。
10、， 需要含胎牛血清 (FBS) 的 TC-100 培养基， 且培养周期较长 ( 一般为 7-8 天 )。因此， 该噬斑筛选方法存在工 作量大、 试验成本高、 试验周期长的缺点。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明的主要目的在于提一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法， 包括以下步骤 ： 0005 (1).克隆猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码基因序列， 转入转移载体， 获得包含猪圆 环病毒 2 型 Cap 蛋白编码基因的重组转移载体 ； 0006 (2). 将上述重组转移载体转化入含有病毒穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中， 获 得含有猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白编码。
11、基因的重组穿梭载体， 再将该穿梭载体转染入昆虫细 胞中， 获得重组杆状病毒 ； 0007 (3). 重组昆虫杆状病毒注射感染家蚕幼虫或蚕蛹 ； 0008 (4). 回收获重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴 ； 0009 (5). 分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白。 说 明 书 CN 102911947 A 3 2/5 页 4 0010 优选地， 本发明的生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法中步骤 (1) 中猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的编码序列包含序列表中的 SEQ ID NO1。 0011 优选地， 本发明的生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法中步骤 。
12、(2) 中所述的猪圆 环病毒 2 型 Cap 蛋白编码的基因的表达受多角体启动子的控制。 0012 优选地， 本发明的生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法中步骤 (2) 中所述的昆虫 杆状病毒包括昆虫核型多角体病毒。 0013 优选地， 本发明的生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法中步骤 (2) 中所述的昆虫 细胞包括 Sf9 细胞。 0014 优选地， 本发明的生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法中步骤 0015 (3) 中所述的家蚕品种包括欧洲种 ： Luobendihong、 Baohuang、 Hungary ； 中国种 ： Dazao、 Qiansanmian、 D。
13、atuanyuan、 Ankang、 Lan 5 ； 日本种 ： Ri110、 Dongfei、 Su16、 Su14、 YingHXZ、 Haoyue 等。 0016 优选地， 本发明的生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法中， 步骤 (3) 中所述的重组 猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白序列包含序列表中的 SEQ ID NO2。 0017 优选地， 本发明的生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白的方法中， 步骤 (3) 中所述的重组 猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白为如下三种多肽的任意一种 ： 0018 1) 含有序列表中的 SEQ ID NO2 序列的多肽 ； 0019 2) 与 1)。
14、 所述多肽至少 80同源的多肽 ； 0020 3)1) 和 2) 所述多肽的免疫原性部分。 0021 本发明的另一目的在于提供上述方法生产的重组猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白。 0022 技术效果 0023 从本发明后续实施例中可以看出， 本发明至少有以下优点 ： 0024 1、 操作简单、 周期短。含 PCV2 Cap 蛋白的重组家蚕核型多角体病毒， 传统的方法 需要通过二种病毒 (BmNPV 与 AcNPV) 共转染并通过噬斑筛选的方法选择重组病毒， 操作周 期长， 一个噬斑筛选周期为 10 天左右， 顺利的情况下也要经过几轮噬斑筛选才能得到重组 病毒， 同时要求实验操作人员具有熟练的噬。
15、斑筛选技术。而本发明避免了病毒同源重组噬 斑筛选这一难以操作并成功率低的步骤， 极大地缩短了实验周期。 0025 2、 利用家蚕幼虫和蚕蛹大规模进行 Cap 蛋白的分泌表达， 成本低。重组病毒通过 饲喂桑叶或注射的方式感染特定品种家蚕幼虫或蚕蛹， 经一定时间饲养后取血淋巴， 每条 家蚕或蚕蛹平均可获得血淋巴 500l 左右。该过程仅需对感染家蚕进行常规饲养， 不需 其他消耗， 因此成本十分低廉 ； 每条家蚕最后所取得的血淋巴量十分可观， 若经后期纯化后 制苗， 每条家蚕的血淋巴可制疫苗 10 头份 ； 感染病毒的血淋巴先后经高速离心和超速离心 后， 即可获得纯化后的PCV2 Cap蛋白， 整个。
16、纯化过程没有化学物质等的参与， 而仅仅依靠物 理方法， 不存在污染变性的可能， 且操作简单， 成本低 ； 若工业化生产成熟后， 每头份疫苗成 本可控制在 1 元以内， 而现存疫苗每头份市场价格均在 12 元左右， 进口疫苗价格均在 35 元 左右。 0026 3、 由于家蚕可采用饲料饲养， 因此受季节影响不大。且大规模饲养家蚕可采用饲 喂桑叶等方式， 家蚕感染率可达到99.8以上。 整个家蚕饲养及感染周期为1个月左右， 后 期纯化也仅需几天即可。使用该方法进行 PCV2 Cap 蛋白的表达， 只需进行 1-2 个周期的常 说 明 书 CN 102911947 A 4 3/5 页 5 规昆虫细胞。
17、培养， 时间 1 周左右。在获得一定量的病毒量后， 进行下一步家蚕幼虫或蚕蛹的 感染。整个实验过程不存在难度， 且在常规实验室即可进行。 0027 因此， 本发明可以利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 (AcNPV) 直接感染家蚕幼虫和 蚕蛹， 进行 PCV2 Cap 目的蛋白表达， 可以大规模的生产 PCV2 Cap 蛋白。 附图说明 0028 图 1 为 PCV2 ORF2 基因扩增图 ； 0029 图 2 为 PCV2 Cap 蛋白 SDS-PAGE 电泳图 ； 0030 图 3 为 PCV2 Cap 蛋白 Western blot 图。 具体实施方式 0031 本发明实施例中昆虫细胞使用了 。
18、Sf9 细胞 (Spodoptera frugiperda( 草地夜蛾 ) 卵巢细胞 )， 购自 Invitrogen 公司。其他类型的昆虫细胞， 如家蚕胚胎细胞， 家蚕卵巢细胞 (BmN) 等， 只要可以感染本发明的转染病毒， 即可使用本发明之方法生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白。 0032 本发明实施例中使用的家蚕品种为大造 (Dazao)， 其他的与之相一致的家蚕品种， 如所述的家蚕品种包括欧洲种 ： Luobendihong、 Baohuang、 Hungary ； 中国种 ： Qiansanmian、 Datuanyuan、 Ankang、 Lan5 ； 日本种 ： Ri110、。
19、 Dongfei、 Su16、 Su14、 YingHXZ、 Haoyue 等， 也可 使用本发明之方法生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白。 0033 本发明的猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白， 可以使用本领域常用的药用载体如 ISA206 佐 剂等， 或本领域其他类型的水性佐剂或油性佐剂， 及本领域常用的其他乳化方法， 制备猪圆 环病毒 2 型 Cap 蛋白亚单位疫苗。 0034 本发明的猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白， 可以使用本领域公知的方法制备试剂盒或直 接作为检测试剂用于检测猪圆环病毒 2 型的感染。 0035 本实施例中构建的重组苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 (AcNPV)， 带有。
20、完整的 PCV2 Cap 蛋白基因， 位于家蚕核型多角体基因启动子控制下， 多角体基因被 PCV2 Cap 蛋白基因 取代， 具有极晚期表达和表达量高的优点。在家蚕幼虫和蚕蛹中， 表达产物经 SDS-PAGE 和 Western blot 鉴定， 结果表明构建的重组家蚕核型多角体病毒能够高效表达 PCV2 Cap 蛋 白， 大小约为 28kDa。 0036 本实施例中构建的重组苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒， 使用的是 Bac-to-Bac 杆状 病毒表达系统 (Bac-to-Bac Baculovirus Expression System， Invitrogen)， 任何其他类 型的表达系统及转。
21、移载体、 表达载体， 只要可以实现将 Cap 蛋白基因克隆至重组病毒， 并能 够感染家蚕及蚕蛹并表达Cap蛋白， 都可以使用本发明相同的方法生产猪圆环病毒2型Cap 蛋白。 0037 本实施例中采用大肠杆菌DH10Bac(购于Invitrogen)进行转化， 任何一种含有穿 梭质粒的大肠杆菌， 都可以使用本发明相同的方法生产猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白。 0038 本发明实施例中重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白为序列SEQ ID NO2的多肽 ； 使用本 发明之方法还可生产如下重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白 ： 与所述选自序列SEQ ID NO2的多 肽至少80同源的多肽及上述多肽的免疫原性部分， 。
22、如截短型的Cap蛋白(即， 虽然氨基酸 说 明 书 CN 102911947 A 5 4/5 页 6 序列被去除部分， 依然保持免疫性的Cap蛋白)。 制备上述多肽的实施例方法与过程与本发 明实施例相同， 下面不再累述。 0039 为使本发明更加容易理解， 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围， 下列实施例中未提及的具体实验 方法， 应按照常规实验方法进行。 0040 1、 克隆猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因， 转入 pFastBacI 转移载体， 获得包含猪圆环病 毒 2 型 ORF2 基因的重组转移载体 ： 0041 提。
23、取 PCV2-SH 株 ( 保藏号为 CGMCC No.2389)DNA 作为扩增 Cap 蛋白基因的模板， 贮存于 -20备用 ； 根据 GenBank 的 PCV2 全基因序列， 设计引物， 分别在上下游引物 5 端 加上 BamHI 和 XholI 酶切位点。 0042 上游引物 ： 5-CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3 ； 0043 下游引物 ： 5-CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCT-3 ； 0044 利用设计的引物扩增 PCV2 ORF2 基因片段， 琼脂糖电泳回收并鉴定 PCV2 ORF2 基 因条带。如图 1 为 PCR 电泳图。
24、， 其中 1 为目的条带， M 为 DNA Marker2000。 0045 对回收的条带进行 BamHI 和 XholI 双酶切鉴定回收， 同时将 pBacPAK8 质粒 ( 购 自 Clontech 公司 ) 用 BamHI 和 XholI 同样进行双酶切并鉴定回收。对回收的目的片段和 pBacPAK8质粒进行T4连接酶连接， 转化至DH5a大肠杆菌中， 筛选阳性克隆， 提取质粒， 并将 阳性质粒命名为pBacPAK8-ORF2。 用PCR扩增并测序， 测序结果与GenBank登记的猪圆环病 毒 2 型 ORF2 基因一致。因此， 由测序结果可知， 含有 PCV2 Cap 蛋白基因重组转移。
25、载体中含 有 ORF2 基因序列。 0046 2、 将含有 PCV2 Cap 蛋白基因重组转移载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受 态细胞中， 获得包含 PCV2 ORF2 基因的穿梭载体， 再将其穿梭载体转染入昆虫细胞中， 获得 重组杆状病毒 vBac-ORF2 ： 0047 将 pBacPAK8-ORF2 转化含有病毒穿梭质粒 Bacmid 的大肠杆菌 DH10Bac( 购自 Invitrogen 公司 )， 获得重组质粒 Bacmid-ORF2 ； PCR 筛选， 提取阳性质粒， 制备阳性重组质 粒 Bacmid-ORF2 DNA。采用 Cellfectin Reagent 转染 Sf9。
26、 细胞 ( 购自 Invitrogen 公司 )， 待细胞出现病变后， 进行重组病毒噬斑纯化和病毒扩增， 然后通过使用引物M13F和M13R进 行 PCR 验证目的重组 ORF2 基因。纯化获得重组杆状病毒， 命名为 vBac-ORF2。扩增重组杆 状病毒 vBac-ORF2 作为种毒， 通过噬斑法进行效价测定后于 4保存。 0048 3、 重组杆状病毒 vBac-ORF2 感染家蚕幼虫， 产生 PCV2 Cap 蛋白 ； 0049 重组杆状病毒 vBac-ORF2 以 1.0105pfu( 噬斑形成单位 )/ 头的感染剂量， 用微 量注射器于家蚕幼虫腹部环节处射入蚕血淋巴腔中。分别于感染后 。
27、72h、 84h、 96h、 108h、 120h、 132h、 144h 和 156h 后， 收获感染重组杆状病毒的幼虫， 利用组织捣碎机进行蚕体破 碎， 10000rpm 离心， 回收上清， 及蚕血淋巴液。然后加入 100 倍体积的 PBS(pH7.4， 0.01M)， 利用超滤浓缩机进行超滤出去杂蛋白， 利用 SDS-PAGE 电泳与 Western blot 进行 PCV2 Cap 蛋白的鉴定。 0050 鉴定结果见图 2、 3， 由图可知， SDS-PAGE 电泳与 Western blot 中均有明显的 Cap 蛋白条带， 说明 PCV2 Cap 在家蚕体内进行了表达。 0051 。
28、图 2 为 SDS-PAGE 电泳图， 其中 1 为 PCV2 Cap 蛋白诱导前样品 ； 2 为 PCV2 Cap 蛋 说 明 书 CN 102911947 A 6 5/5 页 7 白诱导后样品 ； M 为蛋白 Marker ； 图 3 为 Western blot 鉴定图， 其中 1 为 PCV2 Cap 蛋白诱 导后样品 ； 2 为 PCV2 Cap 蛋白诱导前样品 ； M 为双色预染蛋白 Marker。 0052 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102911947 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102911947 A 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 102911947 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102911947 A 10 。