用于检测酶活性的一种新的二肽衍生物及盐.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102911253 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102911253 A *CN102911253A* (21)申请号 201210498654.2 (22)申请日 2012.11.30 C07K 5/062(2006.01) C07K 5/065(2006.01) C07K 5/078(2006.01) C07K 5/072(2006.01) C07K 5/068(2006.01) C12Q 1/37(2006.01) (71)申请人 北京华宇亿康生物工程技术有限公 司 地址 102200 北京市昌平区科技园区超前路 13 号 2 号楼三层 (。

2、72)发明人 孟琛 (54) 发明名称 用于检测酶活性的一种新的二肽衍生物及盐 (57) 摘要 合成以X-L-脯氨酸-Y化学结构的底物， 用于 测定 X- 脯氨酰 - 二肽酰基 - 氨基肽酶活性。其中 X 代表氨基酸残基， Y 代表对硝基苯胺， 对苯基偶 氮胺或 4- 苯偶氮 -1- 萘胺。这种复合物， 满足底 物要求的各种条件， 例如 ： 易测定 （通过酶水解底 物） 、 稳定、 底物量和酶含量及底物水解量和孵育 时间成线性关系。用这种新的二肽衍生物及盐作 为底物， 检测 X- 脯氨酰 - 二肽酰基 - 氨基肽酶活 性可以作为一种非常有效的疾病辅助诊断方法， 尤其对于一些恶性肿瘤的诊断。 (。

3、51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 1/1 页 2 1. 二肽衍生物为如下结构 ： X-L- 脯氨酸 -Y， 其中 X 可从以下氨基酸的残基中选取 ： 甘氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 苯基丙氨酸、 、 酪氨酸、 色氨酸、 谷氨酸、 天 冬氨酸、 赖氨酸、 精氨酸 ； Y 可以从以下化合物中选取 ： 对硝基苯胺、 对苯基偶氮胺、 4- 苯偶 氮 -1- 萘胺和二肽衍生物的酸性盐类。 2. 根据权利要求 1 所述， 其特征在于， X 为甘氨酸、 丙氨酸、。

4、 缬氨酸、 亮氨酸、 丝氨酸、 苏 氨酸、 苯基丙氨酸、 、 酪氨酸、 色氨酸、 谷氨酸、 天冬氨酸、 赖氨酸、 精氨酸的氨基酸残基， 酸盐 为以下几种 ： 对甲苯磺酸盐、 盐酸盐、 氢溴酸盐。 3. 根据权利要求 1 所述， 其中 Y 为对硝基苯胺残基， 而 X 除了甘氨酸残基外， 对于其它 氨基酸残基 X 则为 L 型氨基酸残基。 4. 根据权利要求 1 所述， 其特征在于， X 为甘氨酸残基时， X 可以为甘氨酰 -L- 脯氨酸 对 - 硝基苯胺酰胺。 5. 根据权利要求 1 所述， 其特征在于， X 为甘氨酸残基时， X 可以为甘氨酰 -L- 脯氨酸 对 - 硝基苯胺酰胺甲苯磺酸盐。 。

5、6. 根据权利要求 1 所述， 当 X 为 L 型氨基酸残基时， X-L- 脯氨酸 -Y 可以为， L- 赖氨酰 L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺。 7. 根据权利要求 1 所述， 当 X 为 L 型氨基酸残基， X-L- 脯氨酸 -Y 可以为， L- 精氨酰 L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺。 8. 根据权利要求 1 所述当 X 为 L 型氨基酸残基， X-L- 脯氨酸 -Y， 可以为， L- 丙氨酰 L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺。 9. 根据权利要求 1 所述， 当 X 为 L 型氨基酸残基， X-L- 脯氨酸 -Y， 可以为， L- 谷氨酰 L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺。 10.。

6、 根据权利要求 1 所述， 当 X 为 L 型氨基酸残基， X-L- 脯氨酸 -Y， 可以为， L- 天门冬 氨酰 L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺。 权 利 要 求 书 CN 102911253 A 2 1/8 页 3 用于检测酶活性的一种新的二肽衍生物及盐 技术领域 0001 本发明涉及生物化学技术领域， 具体涉及一种新的二肽衍生物及盐， 以这种二肽 衍生物及盐作为底物， 可用于酶活性检测。 背景技术 0002 为了阐明动物体内酶活性与疾病的关系， 国内外做了大量的相关研究。有研究报 道， 酶活性与疾病存在显著相关性， 因此酶活性检测可作为一种疾病监测的辅助手段。例 如， 检测亮氨酸氨基肽。

7、酶活性用于区分梗阻性黄疸和肝细胞性黄疸， 谷草转氨酶和乳酸脱 氢酶活性检测被广泛应用于肝病的诊断。相对于健康人群来说， 许多疾病病的样本都可导 致这些酶活性偏高。 因此， 对于特定病的检测， 酶活性检测， 不具有很高的可信度， 需结合其 他临床检测数据， 作出判断。常规酶活性检测方法中存在的底物稳定性不好、 重复性差、 不 易测定等缺点， 本发明提供了一种新的二肽衍生物及盐， 可用于酶活性检测， 为疾病的辅助 诊断提供了一种更可信、 更安全、 更简单的诊断方法。 发明内容 0003 本发明涉及到一种新的二肽衍生物及盐， 以这种二肽衍生物作为底物， 用于检测 酶活性， 更可信、 更稳定、 更简单。

8、。 0004 本发明的技术方案如下 ： 首先合成了含有 X-L- 脯氨酸 -Y(X ： 氨基酸残基。Y ： 对硝基苯胺， 对苯基偶氮胺或 4- 苯偶氮 -1- 萘胺结构的二肽衍生物及其盐， 检测动物体内是否存在一些酶能够水解这 些复合物。最后， 我们找到一种单纯酶名为 ： X- 脯氨酰 - 二肽酰基 - 氨基肽酶。这种酶可 以把 X-L- 脯氨酸 -Y 水解为 X-L- 脯氨酸和 Y-H( 即 ： 对硝基苯胺， 对苯基偶氮胺或 4- 苯偶 氮-1-萘胺。 )。 各种动物 （包括人） 体内都有这种酶， 人血清中、 唾液中以及唾液腺以及不同 的结缔组织， 例如 ： 牛或人牙髓、 牙毛囊、 齿龈以及。

9、大鼠肉芽肿瘤中都含有这种酶。 我们用这 些二肽衍生物及盐做底物， 检测了正常人血清中 X- 脯氨酰 - 二肽酰基 - 氨基肽酶的活性， 发现这种酶在正常人群中酶活性水平几乎相同， 但是在青年男性和青年女性中检测结果存 在显著差异， 在中老年女性与年轻女性中也存在显著差异。同时有肝胆疾病 （比如 ： 急性或 慢性肝炎， 肝硬化） 的病人血清中该酶活性水平显著升高， 而有原发性高血压以及恶性肿 瘤， 比如 ： 实体肿瘤 （例如 ： 胃癌、 胰腺癌、 肺癌） 以及白血病及恶性毒瘤患者该酶活性显著降 低。因此， 我们证实， 用这种新的二肽衍生物及盐作为底物， 检测 X- 脯氨酰 - 二肽酰基 - 氨 。

10、基肽酶活性可以作为一种非常有效的疾病辅助诊断方法， 尤其对于一些恶性肿瘤的诊断。 0005 此外， 我们证实目前这种新的二肽衍生物及盐是安全的复合物， 无致癌性， 同时这 种复合物， 满足底物要求的各种条件， 例如 ： 易测定 （通过酶水解底物） 、 稳定、 底物量和酶含 量及底物水解量和孵育时间成线性关系。 0006 二肽衍生物 （X-L- 脯氨酸 -Y） N- 端的氨基酸残基 （X） ， 包括 ： 任意的氨基酸残基， 因为该酶主要作用于第二个氨基酸残基 （L- 脯氨酸） ， 而不是针对于 N- 端的氨基酸残基 说 明 书 CN 102911253 A 3 2/8 页 4 （X） 。N- 端。

11、的氨基酸残基常从含有 15 个以上碳原子的氨基酸选取。例如， 中性氨基酸， 如 ： 甘氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 苯基丙氨酸、 酪氨酸、 色氨酸。碱性氨基 酸， 如 ： 赖氨酸、 精氨酸。如果这些氨基酸含有不对称 C 原子， 将会出现不同的立体化学结 构， 有 L 型， D 型， DL 型空间构象， 通常情况下为 L 型氨基酸。此外， 这些二肽衍生物作为底 物， 不但可以以游离形式存在， 而且可以酸盐形式存在， 而这种形式不会抑制酶活性。 例如 ： 对甲苯磺酸、 盐酸、 氢溴酸。因为盐的稳定性更好， 用盐做底物是更好的选择。 0007 在 X-L- 脯氨酸 -Y 。

12、中， Y 部分， 应从含有 ： 对硝基苯胺， 对苯基偶氮胺或 4- 苯偶 氮 -1- 萘胺的氨基酸残基中选择。在这几种氨基酸残基中， 含对硝基苯胺的残基是更好的 选择， 因为这种残基与二肽在水中具有相同的溶解度， 更稳定， 更易合成。 0008 针对 X-L- 脯氨酸 -Y 的酶活性取决于 N- 端氨基酸残基 （X） 差异。X 为中性或碱 性氨基酸残基时， 二肽衍生物最容易被酶水解， 相比来说酸性氨基酸不易水解。因此， 二肽 衍生物 X 部分为中性或碱性氨基酸残基或酸盐比如 ： 对甲苯磺酸盐， 更适合作为底物， 而碱 性氨基酸易潮解。另一方面， 二肽衍生物 X 为甘氨酸残基， 在 pH8.7 。

13、的环境下， 具有最高的 水解率。X-L- 脯氨酸 -Y 衍生物， 在避光条件下较稳定， 且水溶性较好。此外， 甘氨酸及其 酸盐比如 ： 盐酸、 对甲苯磺酸， 相比一些碱性氨基酸来说， 不易潮解， 更易于实验操作。综上 所述， X-L- 脯氨酸 -Y 中， X 为甘氨酸或其盐， 特别是对甲苯磺酸盐时， 是最佳的底物组合选 择。 0009 新型二肽都有 X-L- 脯氨酸 -Y 这样的结构， 可很容易地采用肽化学中熟知的方法 进行合成。获得这些二肽， 既可以采用如下方法， 将 L- 脯氨酸 -Y、 对应于 N 端掩蔽 -X 部分 的N端掩蔽-X氨基酸， 用类似碳二酰亚胺衍生物的缩合剂耦合为N端掩蔽-。

14、X-L-脯氨酸-Y， 再脱除掩蔽基团， 也可以采用活性酯或者类似的方法。适于 N- 端氨基酸的掩蔽基团可从熟 知的的基团如苄氧酰基、 叔 - 丁氧酰基和叔 - 戊氧酰基中选用。如果使用的氨基酸具有功 能侧基， 在对功能侧基进行掩蔽后， 这类氨基酸也可获得应用。比如， 在将侧链羧基转换为 酯基 ( 如苄酯 ) 后， 酸性氨基酸即可使用。胍基用一般的掩蔽基团如甲磺酰基、 对硝基苄 基酰基和 2-( 异丙氧基酰基 )-3,4,5,6- 四氯苯甲酰基 ( 尤其前两种 ) 进行掩蔽后， 可以使 用， 而赖氨酸的 N 端 - 氨基通常用熟知的掩蔽氨基的基团进行掩蔽， 更常用的是与选用于 N 端 - 氨基掩。

15、蔽相同的掩蔽基团。 0010 依据 N 端掩蔽基团采用熟知的方法消除所获得的 N 端掩蔽 -X-L- 脯氨酸 -Y 的掩 蔽基团， 以及可能存在的功能侧基的掩蔽基团。非常重要的是， 在消除反应中， 仅仅消除掩 蔽基团而不对其它部分有影响。 0011 也可以通过 N 端掩蔽 -X-L- 脯氨酸与 Y-H 首先耦合来合成目标二肽的衍生物 N 端 掩蔽 -X-L- 脯氨酸 -Y， 再消除掩蔽基团。 0012 如果希望获得二肽衍生物与酸形成的盐， 则可以通过在类似水、 醇等介质中将自 由的碱与酸相接触来制备。如果掩蔽基团是类似叔 - 丁氧酰基这样可以被酸消除的掩蔽基 团， 将 N 端掩蔽的衍生物与相同。

16、的酸接触， 则可以直接获得期望的盐。 0013 X-L-脯氨酸-Y和盐， 可通过化学合成方法， 很易合成。 在各种酸盐中， 甲苯磺酸盐 是最佳选择， 这是由于苯磺酸盐可形成含少量杂质稳定的晶体， 介于此， 可通过简单的重结 晶的方法， 得到较高纯度的苯磺酸盐。 0014 用这种二肽衍生物或盐作为底物检测酶活性是非常容易的。X-L- 脯氨酸 -Y 的水 说 明 书 CN 102911253 A 4 3/8 页 5 溶液或盐溶液首先应有一个合适的浓度。因为需要相对较长的时间溶解底物， 因此需要加 入一些其它合适的物质助溶， 例如 ： 非离子去污剂、 酸、 醇， 或者通过把底物冻干的等方法， 让底物。

17、形成多孔结构， 以增加其溶解性。冻干粉更方便日常使用。根据采用的底物种类， 底物溶液最佳 pH 的选择也不同， 但一般根据实验具体要求决定。最佳的 pH 一般选在 6-9 之间， 建议取在 pH 7.5-8.9 之间。pH 大于 9.5， 底物自发水解， 但是底物溶液， 特别是甘氨 酰 -L- 脯氨酸对硝基苯胺溶液在大于上述提到的最佳 pH 区间内仍较稳定。4可保存一周 以上， 不降解。 0015 Y-H 的量很容易通过检测特定波长， 酶促反应的吸光度来计算。Y-H， 即 ： 对硝基苯 胺 385nm 处检测， 对苯基偶氮胺 493nm 检测， 4- 苯偶氮 -1- 萘胺 532nm 检测。这。

18、种吸光度测 定方法非常简单、 方便、 准确， 适合于常规酶活性检测。 0016 如果 Y-H 为对硝基苯胺， 酶活性也可通过在酸性条件下对硝基苯胺与过量亚硝酸 钠反应形成重氮盐来检测。发生重氮化的对硝基苯胺的量， 可通过直接检测未反应的亚硝 酸钠的量来计算， 但是一般通过所谓的重氮偶合法来检测。通过氨基磺酸、 氨基磺酸铵、 尿 素或类似物分解亚硝酸钠， 与对硝基苯重氮盐反应形成一个耦合物， 然后通过检测这种含 氮复合物的合适吸光度值， 来检测酶活性。这种间接检测方法， 比直接测定吸光度值法， 要 复杂。但是灵敏度要高很多， 特别是对一些酶含量很少的样本， 是一种很有效的检测方法。 具体实施方式。

19、 0017 实施例 1 ： N- 苄氧酰基 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺的制备 三氯氧磷 （50.6g， 0.33mol） ， -10条件下， 缓慢搅拌加入到含 N- 苄氧酰基 -L- 脯 氨酸 （74.8g， 0.3mol） 、 对硝基苯胺 （41.4g， 0.3mol）的四氢呋喃 （400ml）溶液中。三乙胺 （92.4mol， 0.66ml） 逐滴加入到以上混合液中， 内部温度控制在 -15。用三乙胺调整 pH 到 7.0 后， 反应混合液温度可以允许达到室温， 然后搅拌 3 小时。 0018 溶剂用乙酸乙酯 （1.2L） 交换。乙酸乙酯依次用水 (400ml)、 1mol 盐酸 。

20、（300mlx5） ， 水 （400ml） ,5% 碳酸氢钠 （300mlx3） 和饱和盐溶液 （300ml） 洗涤， 然后硫酸镁干燥。干燥液 是通过低压浓缩而成， 残余部分通过加入乙醚而结晶， 然后产物在乙酸乙酯 （300ml） 和甲醇 混合液中重结晶。 0019 产量 ： 56g 熔点 ： 159-161。 0020 比旋光度 ： -107.60（C=1, 甲醇） 元素分析CHN% 计算值 （C19H19O5N3）61.77 5.19 11.38 实验值62.07 5.20 11.62 实施例 2 ： L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺氢溴酸盐的制备 N-苄氧酰基-L-脯氨酸对-硝基苯胺酰胺。

21、(55.4g， 0.15mol)用26%无水溴化氢溶液溶 解， 0加入到 200ml 醋酸溶液中 , 室温搅拌两小时。混合液， 在干乙基醚 （2L） 中搅拌 , 至 结晶析出。通过澄清、 乙醚洗涤、 干燥得到产物。 0021 产物量 47g。 0022 粗制品用于以下范例中， 没有经过纯化。分析样品通过在甲醇中重结晶得到。 0023 熔点 ： 225-226。 说 明 书 CN 102911253 A 5 4/8 页 6 0024 比旋光度 ： -35.60（C=1.0 ， 甲醇） 元素分析CHN% 计算值 （C11H14O3N3Br）41.79 4.46 13.29 实验值41.75 4.3。

22、4 13.30 实施例 3 ： N- 苄氧酰基 - 甘氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺的制备 N-苄氧酰基-甘氨酸酯(48g,0.16mol)加入到含L-脯氨酸对-硝基苯胺酰胺氢溴酸盐 (47g， 0.15mol) 的三乙胺溶液 （22ml） 和含 N- 羟基苯并三唑 (1g) 的二甲基甲酰胺 （100ml） 混合液中。整个混合液 0搅拌混匀一小时， 在这期间混匀过程中用三乙胺调 pH， 控制 pH 在 8.0, 随后室温继续搅拌混匀 19 小时。 0025 溶液经低压蒸发， 除去溶剂， 剩余物加入 350ml 水， 经乙酸乙酯 （500ml， 200ml） 分 别萃取两次得产物。 两。

23、次提取物混合后， 依次用水 （200ml） 、 1N盐酸 （200mlx2） ， 水 （200ml） 、 5% 碳酸氢钠溶液 （200mlx4） 及水 （200ml） 洗涤， 最后经硫酸镁干燥。 0026 产量 ： 67g 实施例 4 ： 甘氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺甲苯磺酸盐的制备 甘氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺 (584mg) 被对甲苯磺酸单水合物的乙醇溶液中和 （380mg， 10ml） 。溶液置于冰箱， 结晶， 得粗制品。粗制品通过甲醇乙基醚重结晶。 0027 产量 ： 312mg 熔点 ： 223-225 比旋光度 ： -81.00，（C=1.0， 甲醇） 。

24、实施例 5 ： 叔 - 丁氧酰基 -L- 丙氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺的制备 叔 - 丁氧酰基 -L- 丙氨酸 (5.7g， 0.03mol) 和 L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺氢溴酸盐 (9.5g， 0.03mol) 用氯仿 （40ml） 溶解， 0条件下， 加入三乙胺 （4.2ml， 0.03mol） 及 N,N- 二 环己基碳二酰亚胺的氯仿溶液 （5ml） 。混合液， 室温搅拌 44 小时。加入数滴乙酸后， 再延长 搅拌 2 小时。通过过滤的方法， 去除沉淀物， 滤液经低压浓缩。剩余物用水重悬， 产物经乙 酸乙酯萃取获得。提取物用 1N 盐酸， 水， 5% 碳酸氢钠溶液，。

25、 水， 饱和氯化钠溶液， 依次洗涤， 然后用硫酸镁干燥。干燥液经浓缩， 用乙醚溶解。一些不溶性产物经过滤除去。滤液经浓 缩， 再经正己烷研磨固化， 得产物。 0028 产量 ： 12.9g 实施例 6 ： L- 丙氨酰 -L 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺盐酸盐 叔 - 丁氧酰基 -L- 丙氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺 (12.9g) 的二氧己烷溶液 （20ml） 用 6N 无水氯化氢二氧己烷溶液 （45ml） 室温处理 55min。反应混合液经低压浓缩， 从乙醇结晶物， 再经乙醚研磨固化， 得产物。 0029 产量 ： 6.4g 熔点 ： 130-140 比旋光度 ： -103.40。

26、（C=1， 甲醇） 元素分析CHN% 计算值 （C14H19O4N4Cl）46.03 5.93 15.34 实验值46.12 6.09 15.50 实施例 7 ： L- 天门冬氨酰 L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺 叔 - 丁氧酰基 - 苄基 -L- 天门冬氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺 (10.3g) 溶于 苯甲醚 （8ml） 溶液中， 充分混匀， 溶液用无水氟化氢 （50ml） ， 0处理 1 小时。通过蒸馏的方 说 明 书 CN 102911253 A 6 5/8 页 7 法， 去除氟化氢， 然后加入乙醚， 使产物沉淀。沉淀物用乙醚洗涤两次， 通过倾析法分离， 然 后干燥。 0。

27、030 粗制品溶于 0.1M 的醋酸中， 溶液用乙醚充分洗涤， 然后过柱 （强碱阴离子交换树 脂） 。收集洗涤物， 低压浓缩， 产物在水中结晶。 0031 产量 ： 5.2g 熔点 ： 144-145 比旋光度 ： -100.30（C=1， 1N-HCL） 元素分析CHN% 计算值 （C15H18O6N4.3/2H2O）47.74 5.61 14.85 实验值48.03 5.63 14.16 实施例 8 ： 关于底物水解量和孵育时间的的实验。 0032 分别用甘氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺作为底物， 人血清作为酶原。 0033 底物水解量， 通过以下直接光度法测定。 0034 甘氨。

28、酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺甲苯磺酸盐溶于 2% 的非离子洗涤剂水溶液 中， 底物浓度为 3mM。需准备以下 4 个反应管 ： 1） 试验管 ： 含 0.5ml， 0.15M 的 pH8.7 的甘氨 酸 - 氢氧化钠缓冲液， 0.5ml 底物溶液， 0.05ml 人血清。 0035 2） 空白管 ： 含 0.5ml， 0.15M 的 pH8.7 的甘氨酸 - 氢氧化钠缓冲液 , 0.5ml 底物溶 液， 0.05ml 水。 0036 3） 标准管 ： 0.5ml 缓冲液， 0.5ml 底物溶液， 和 0.05ml 3mM 对硝基苯胺水溶液。 0037 4） 对照管 ： 0.5ml 缓。

29、冲液， 0.5ml 底物。 0038 4 个管， 按表 1 所列孵育时间， 经 37孵育。通过加入 3ml， 1M 双乙酸钠 （pH4.2） 终 止反应。对照管， 在终止反应后， 加入 0.05ml 的人血清。通过调整使空白管吸光度为 0， 读 取试验管 (E)、 对照管 (C)、 标准管 (S)， 385nm 的吸光度 （1cm 光径） 。通过酶作用， 释放对 硝基苯胺， 通过以下公式计算对硝基苯胺的量。 0039 E-C/S x 150(nmol) 试验结果如下 ： 表 1 孵育时间 （分）生成的对硝基苯胺量 （nmol） 1518.11 3035.43 6071.65 90100.79 。

30、120135.43 根据以上试验数据证实， 酶促反应与孵育时间长成线性关系。 0040 用从人颌下腺提取纯化的酶代替人血清， 按以上实验步骤做重复试验。结果也证 实酶促反应与孵育时间长成线性关系。 0041 实施例 9 ： 酶的量和底物水解量的关系。 0042 用甘氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺甲苯磺酸盐做底物， 人血清作为酶原。底 物水解量， 通过以下重氮偶合法检测。 0043 需准备以下反应管 ： 1） 试验管含 1.0ml 0.15M 的甘氨酸 - 氢氧化钠缓冲液 （pH8.7） ,1ml 底物溶液 （按 说 明 书 CN 102911253 A 7 6/8 页 8 实施例 8。

31、 的方法处理。 ） ， 0.01ml 血清。 0044 2） 对照管含 1.0ml 的甘氨酸 - 氢氧化钠缓冲液 （pH8.7） ， 1ml 底物溶液 （按实施 例 8 的方法处理。 ） 3） 试验管和对照管均 37孵育 30 分钟后， 对照管加入 0.1ml 血清。通过加入 0.4ml30% 的高氯酸水溶液终止反应。3000rpm 离心 10 分钟。每管取上清 0.5ml 转移到另 一管。此外， 标准管内加入 ： 0.1ml 的 0.5M 的对硝基苯胺和 2.4ml 的 30% 的高氯酸。空白 管加入 2.5ml 的高氯酸溶液。 0045 4条件下， 4 管中分别加入 0.5ml 0.2% 。

32、的亚硝酸钠溶液， 4维持 10 分钟。随 后， 加入 0.5% 的氨基磺酸铵水溶液 0.5ml。2 分钟后， 加入 1ml 的 0.05% N-(1- 萘基 ) 乙二 胺溶液， 混合液 37， 避光， 温浴 30 分钟。 0046 空白管吸光度值调整为 0， 读取试验管 （E） , 对照管 （C） , 和标准管 （S） 548nm 的吸 光度值。 0047 对硝基苯胺生成量， 通过以下公式计算 ： (E-C)x500A/S x0.5 其中， A ： 标准管中 0.5mM 对硝基苯胺溶液的用量 （ml） 。 0048 表 2 血清量 （ml）对硝基苯胺生成量 （nmol） 0.0114.24 0。

33、.0232.91 0.0345.89 0.0462.50 0.0582.44 0.10155.06 根据上述数据证实， 酶促反应与酶量呈线性关系。 0049 实施例 10 ： 甘氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺溶于 2% 的非离子洗涤剂水溶液中， 制备 3mM 的底 物溶液。 不同的衍生物或盐可作为底物， 测定了不同底物的相对酶活性， 以及酶对底物的水 解率及最佳反应 pH。表 3 为试验结果。 说 明 书 CN 102911253 A 8 7/8 页 9 0050 注释 ： a. 酶活性测定缓冲液为 pH 5.6-8.8 的， 0.5M Tris-maleate 缓冲液和 pH 8.。

34、2-9.4 的 0.15M 的甘氨酸 - 氢氧化钠缓冲液。对于底物 L- 丙氨酰 L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺， 用的 缓冲液为 amidiol 缓冲液， 而不是甘氨酸缓冲液， 因为甘氨酸缓冲液在 pH 9-10 之间对吸 光度有干扰。 0051 b. 纯化的人颌下腺酶， 在 pH7.0 ， Tris-maleate 缓冲液条件下测定。结果取两次 重复测定的平均值。 0052 c.酶活性在pH 8.7的0.15M的Tris或0.15M 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液测定。 结 果取两次重复测定的平均值。 0053 实施例 11 ： 用实施例 8 的方法检测了 X- 脯氨酰 - 二肽酰基 - 氨基肽。

35、酶的酶活性， 用甘氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺做底物， 88 例正常人血清样本作为酶原。检测结果 如表 4。 0054 表 4 样本组样本数年龄酶活性 （umol/min/1sermS.E） 总样本8815-8154.881.50 男性5315-8156.301.90 女性3520-7652.492.47 青年4215-4054.762.07 男性2415-4060.102.84a 女性1820-4047.592.07 中老年4641-8155.042.23 男性2941-8153.182.43 女性1748-7658.164.37b 注释 ： a 青年男性的检测值 （小于 40 。

36、岁） 显著高于青年女性， 显著性检验 P 0.001 b 中老年男性检测值显著高于年轻女性， 显著性检验 P 0.05 实施例 12 ： 用实施例 8 的方法检测了 X- 脯氨酰 - 二肽酰基 - 氨基肽酶的酶活性， 用甘 氨酰 -L- 脯氨酸对 - 硝基苯胺酰胺做底物， 88 例病理血清样本作为酶原。检测结果如表 5。 0055 表 5 样本组样本数 酶活性 （umol/min/1sermS.E）与对照样本比较的显著性检验 正常 （对照） 样本8854.91.5P 0.01P 0.01 乙肝样本2375.828.5P 0.001 早期原发高血压样本2080.943,87P 0.001 原发高。

37、血压样本1789.293.69P 0.001 胃癌样本3738.42.3P 0.001 肺癌样本1739.82.6P 0.001 急性淋巴细胞白血病样本2238.811,9P 0.01 淋巴肉瘤样本1136.35.6P 0.01 霍奇金病样本1531.09.5P 0.01 实施例 13 ： 用实施例 8 的方法检测了 X- 脯氨酰 - 二肽酰基 - 氨基肽酶的酶活性， 不同的氨基酸残 基用作底物， 病人血清样本作为酶来源。检测结果如表 6。 0056 说 明 书 CN 102911253 A 9 8/8 页 10 注释 ： Gly、 L-Ala、 L-Asp、 L-Glu、 L-Arg 代表 X- 脯氨酸对硝基苯胺中的氨基酸残基 X。 说 明 书 CN 102911253 A 10 。