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1、(10)申请公布号 CN 102908617 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102908617 A *CN102908617A* (21)申请号 201110223200.X (22)申请日 2011.08.04 A61K 39/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 广州格拉姆生物科技有限公司 地址 510000 广东省广州市萝岗区科学城科 汇发展中心 ( 自编 A-5 栋 602 房 ) (72)发明人 李帅伟 庞程 (54) 发明名称 一种猪繁殖与呼。
2、吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫苗及制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫苗及制备方法， 猪繁殖与呼 吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫苗是一种基 因重组融合多肽， 该多肽含有 PRRSV 的 M 蛋白和 CD40L的主要氨基酸序列 ； 用基因重组技术将M基 因与免疫共刺激分子CD40配体(CD40L)连接成重 组融合蛋白， 并将融合基因克隆到原核表达载体 pET-30a(+) 中， IPTG 诱导并表达重组融合蛋白， 通过包涵体纯化重组蛋白。 本发明的有益效果为 ： 重组融合蛋白可用于 PRRSV 感染的预防及治疗。
3、。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 1/1 页 2 1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗， 是一种基因重组融合多肽， 其特征在于 ： 该多肽含有 PRRSV 的 M 蛋白和 CD40L 的主要氨基酸序列， 所述 M 蛋白氨基酸序 列如附图 1 所示， 所述 CD40L 的主要氨基酸序列如附图 3 所示。 2. 权利要求 1 所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫苗的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤。
4、 ： 1) 采用基因重组技术将 PRRSV 的 M 基因与 CD40L 的 cDNA 基因连接形成融合基因 ； 2)将融合基因克隆到原核表达载体pET30a的克隆位点上， 通过IPTG诱导表达， 液相色 谱纯化重组融合蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102908617 A 2 1/6 页 3 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫苗及 制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物医药基因重组领域， 具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋 白与 CD40L 融合疫苗及制备方法。 背景技术 0002 M 蛋白是 PRRSV 结构蛋白中最保守的蛋白， 它有一个短肽段 (18。
5、aa) 暴露于病毒粒 子表面， 可能与病毒的聚集和结合有关。M 蛋白聚集于粗面型内质网上， 并与 GP5 形成异源 二聚体， 在病毒对肺泡巨噬细胞附着和病毒侵染过程中起重要作用。M 蛋白具有很强的免 疫原性， 感染后10d即可激发产生可检测的抗体应答， 表达的重组M蛋白可以作为血清学试 验的靶抗原和亚单位疫苗， M 蛋自在细胞免疫中起重要作用。CD40L 具有刺激 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞增殖， 诱导 B 淋巴细胞分化。此外， 它还作用于抗原呈递细胞 (APC)， 促进 CD28、 B7-1 和 B7-2 等免疫共刺激分子的表达， 提高 APC 的抗原递呈能力， 增强免疫应答反应。 发明内。
6、容 0003 本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制 备方法， 用于 PRRSV 感染的预防及治疗。 0004 本发明的目的是通过以下技术方案来实现 ： 0005 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫苗， 是一种基因重组融合多 肽， 该多肽含有 PRRSV 的 M 蛋白和 CD40L 的主要氨基酸序列。 0006 上述猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫苗的制备方法， 包括以下步 骤 ： 0007 1)采用基因重组技术将PRRSV的M基因与CD40L的cDNA基因连接形成融合基因 ； 0008 2)将融合基因克隆到原核。
7、表达载体pET30a的克隆位点上， 通过IPTG诱导表达， 液 相色谱纯化重组融合蛋白。 0009 本发明的有益效果为 ： 用重组融合蛋白的混合弗氏免疫佐剂皮下接种猪， 检测特 异性 IgG 抗体和中和抗体滴度， 验证重组融合蛋白的体液免疫水平 ； 细胞免疫是抗细胞内 感染免疫的主要形式， 此重组 PRRSV 疫苗通过将 M 蛋白与 CD40L 的融合， 能刺激机体产生抗 PRRSV 的细胞免疫 ； 免疫后进行攻毒实验， 结果证实可以有效地抑制 PRRSV 感染， 降低受感 染的猪的死亡率 ； 此外， 该融合蛋白抗原特异性高， 不会引起非特异性免疫反应， 可作为预 防和治疗性疫苗在临床的应用。。
8、 附图说明 0010 图 1 为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫 苗的 M 蛋白质氨基酸序列 ； 0011 图 2 为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫 说 明 书 CN 102908617 A 3 2/6 页 4 苗的 M 基因核苷酸序列 ； 0012 图 3 为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫 苗的 CD40L 蛋白质氨基酸序列 ； 0013 图 4 为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫 苗的 CD40L 基因核苷酸序列。
9、 ； 0014 图 5 为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫 苗的 M-CD40L 融合蛋白质氨基酸序列 ； 0015 图 6 为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫 苗的 M-CD40L 融合基因核苷酸序列。 具体实施方式 0016 本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒 M 蛋白与 CD40L 融合疫苗， 是 一种基因重组融合多肽， 该多肽含有 PRRSV 的 M 蛋白和 CD40L 的主要氨基酸序列， 所述 M 蛋 白氨基酸序列如附图 1 所示， 所述 CD40L 的主要氨基酸序列如附图 3 所示 ；。
10、 M 基因核苷酸序 列如附图 2 所示， CD40L 基因核苷酸序列如附图 4 所示， M-CD40L 融合蛋白氨基酸序列如附 图 5 所示， M-CD40L 融合基因核苷酸序列如附图 6 所示。 0017 实施例 1M 基因克隆到原核表达载体 pET30a 0018 1、 设计 M 基因引物 0019 参考 PRRSV 的 M 基因序列 (GenBank 号 ： DQ379480) 设计扩增 PRRSV 病毒的 M 基因 引物如下， 引入酶切位点为 EcoR I 和 Xho I( 用斜体表示 ) ： 0020 M-F-E ： GC ATGGGGTCGTCCTTAGATGA， 0021 M-R。
11、-X ： GC TTATTTGGCATATTTGACAAG。 0022 2、 提取 PRRS 病毒 RNA 0023 Marc-145 细胞感染 PRRSV 毒株为 VR2332， 48 小时后 (48hpi)， 根据 invitrogen 公 司的 RNA 提取试剂盒， 从感染病毒的 Marc-145 细胞中提取总 RNA。 0024 3、 PRRSV 的 M 基因的反转录及 PCR 0025 根据 invitrogen 公司的 RT-PCR 试剂盒进行反转录， 获得 M-mRNA 的 cDNA。然后根 据上述引物为 PCR 扩增 M 基因。 0026 PCR 反应条件如下 ： 94 4 分。
12、钟 ； 94 30 秒， 55 30 秒， 72 45 秒 ； 共 30 循环 ； 72 10 分钟。结果得 PCR 产物约为 525bp 的目的片段。 0027 4、 阳性重组质粒 pET30a-M 的获取 0028 1琼脂糖凝胶电泳后， 回收目的条带， 按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收 PCR 产物及载体 pET30a 质粒 ： 0029 PCR 产物 (M 基因 ) 或 pET30a 质粒 30L EcoR I 1L Xho I 1L 10H buffer 4L H2O 4 0030 37酶切反应 2 小时后， 电泳回收目的条带， 按下列体系连接载体与 PCR 片段 ： 说。
13、 明 书 CN 102908617 A 4 3/6 页 5 0031 PCR 产物 (M 基因 ) 7L pET30a 质粒 1L T4 ligase 1L 10T4buffer 1L 0032 16反应 5 小时后， 转化感受态大肠杆菌 DH5， 挑取阳性单克隆进行基因测序， 将测序表明含有 M 基因的载体命名为 pET30a-M。 0033 实施例 2CD40L 基因克隆到原核表达载体 pET30a 0034 1、 设计 CD40L 基因引物 0035 参考猪 CD40L 基因序列 (GenBank 号 ： AB040443) 设计扩增 CD40L 基因引物如下， 引入酶切位点为 EcoR。
14、 I 和 Xho I( 用斜体表示 ) ： 0036 CD40L-F-E ： GC ATGATCGAAACGTACAGC ； 0037 CD40L-R-X ： GC TCAGAGTTTGAGGAGGCC。 0038 2、 提取 CD40L 总 RNA 0039 根据invitrogen公司的RNA提取试剂盒， 从猪肾细胞系PK15细胞中提取总RNA。 0040 3、 CD40L 基因的反转录及 PCR 0041 根据 invitrogen 公司的 RT-PCR 试剂盒进行反转录， 获得 M-mRNA 的 cDNA。然后根 据上述引物为 PCR 扩增 CD40L 基因。 0042 PCR 反应条。
15、件如下 ： 94 4 分钟 ； 94 45 秒， 55 45 秒， 72 60 秒 ； 共 30 循环 ； 72 10 分钟。结果得 PCR 产物约为 786bp 的目的片段。 0043 4、 阳性重组质粒 pET30a-CD40L 的获取 0044 1琼脂糖凝胶电泳后， 回收目的条带， 按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收 PCR 产物及载体 pET30a 质粒 ： 0045 PCR 产物 (CD40L 基因 ) 或 pET30a 质粒 30L EcoR I 1L XhoI 1L 10H buffer 4L H2O 4 0046 37酶切反应 2 小时后， 电泳回收目的条带， 按下。
16、列体系连接载体与 PCR 片段 ： 0047 PCR 产物 (CD40L 基因 ) 7L pET30a 质粒 1L T4 ligase 1L 10T4buffer 1L 0048 16反应 5 小时后， 转化感受态大肠杆菌 DH5， 挑取阳性单克隆进行基因测序， 将测序表明含有 M 基因的载体命名为 pET30a-CD40L。 0049 实施例 3M-CD40L 融合基因克隆到原核表达载体 pET30a 0050 1、 引物设计 0051 通过设计 Linker 序列 (5 段重复序列 GGGGS) 将 M 和 CD40L 基因连接起来， 设计如 下引物 ： 0052 M-F-E ： GCGA。
17、ATTCATGGGGTCGTCCTTAGATGA ； 说 明 书 CN 102908617 A 5 4/6 页 6 0053 M-R-GGGGS ： 0054 GGACCCGCCTCCACCGGACCCGCCTCCACCGGACCCGCCTCCACCTTTGGCATATTTG ； 0055 GGGGS-CD40L-F ： 0056 GGTGGAGGCGGGTCCGGTGGAGGCGGGTCCGGTGGAGGCGGGTCCATCGAAACGTACAG ； 0057 CD40L-R-X ： GCCTCGAGTCAGAGTTTGAGGAGGCC。 0058 2、 PCR 扩增融合基因 M-CD40L。
18、 0059 以 M 和 CD40L 的 PCR 产物为模板， 通过上述 4 条引物扩增得到融合基因 M-CD40L， PCR 反应条件如下 ： 94 4 分钟 ； 94 45 秒， 55 45 秒， 72 90 秒 ； 共 30 循环 ； 72 10 分 钟。结果得 PCR 产物约为 1350bp 的融合基因 M-CD40L 目的片段。 0060 3、 阳性重组质粒 pET30a-M-CD40L 的获取 0061 1琼脂糖凝胶电泳后， 回收目的条带， 按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收 PCR 产物及载体 pET30a 质粒 ： 0062 M-CD40L 基因或 pET30a 质粒。
19、 30L EcoR I 1L Xho I 1L 10H buffer 4L H2O 4 0063 37酶切反应 2 小时后， 电泳回收目的条带， 按下列体系连接载体与 PCR 片段 ： 0064 M-CD40L 基因 7L pET30a 质粒 1L T4 ligase 1L 10T4buffer 1L 0065 16反应 5 小时后， 转化感受态大肠杆菌 DH5， 挑取阳性单克隆进行基因测序， 将测序表明含有 M 基因的载体命名为 pET30a-M-CD40L。 0066 实施例 4 蛋白 (M、 CD40L、 M-CD40L) 的诱导表达及纯化 0067 将 pET30a-M， pET30a。
20、-CD40L 及 pET30a-M-CD40L 阳性重组质粒转化表达菌株 - 大 肠杆菌 BL21(DE3)， 获得的含有 pET30a-M， pET30a-CD40L 及 pET30a-M-CD40L 的阳性克隆命 名为 BL21-pET30a-M， BL21-pET30a-CD40L 及 BL21-pET30a-M-CD40L。 0068 扩增培养工程菌 BL21-pET30a-M、 BL21-pET30a-CD40L 及 BL21-pET30a-M-CD40L， 37 ， 200 转 / 分 ( 旋 转 半 径 为 13mm) 振 摇 培 养 菌 液 OD600 至 1.0， 在 16 。
21、下 加 入 IPTG(0.25mM) 诱导 10 14 小时。培养结束后， 进行如下处理 ： 10000g、 离心 10 分钟收集 菌体经 PBS 重悬， 超声破菌， 进行 SDS-PAGE 电泳检测， 检测结果显示， 分别在 26、 33、 55kDa 左右处出现一条蛋白条带， 与 M、 CD40L 和 M-CD40L 蛋白大小相符， 表明重组 M、 CD40L 和 M-CD40L 蛋白在大肠杆菌中正确表达。 0069 另将沉淀进行一系列纯化后， SDS-PAGE 电泳检测， 检测结果如图 3 所示， 条带单 一， 表明获得纯度极高的重组M、 CD40L和M-CD40L蛋白， 可以进行下一步。
22、的动物免疫试验。 0070 实施例 5 动物实验免疫猪及攻毒 0071 选取 50 头 4 周龄 PRRSV 病毒阴性和抗体阴性小猪作为实验动物， 随机均分为如下 5 组 ： 说 明 书 CN 102908617 A 6 5/6 页 7 0072 0073 将各组蛋白与弗氏佐剂 ( 第一次为弗氏完全佐剂， 第二、 三次为弗氏不完全佐剂 ) 混合乳化后， 按上面的方法免疫小猪。1 4 组在免疫了 3 次后的第 14 天采集全血 15ml， 同时攻毒 VR2332-PRRSV， 剂量为 106TCID50/ 头， 采集攻毒后第 0、 3、 7、 11、 14、 21 天猪血， 分 离血清， 并记录。
23、猪死亡情况。 0074 实施例 6 体液免疫水平检测实验IgG 抗体和中和抗体检测 0075 采集 3 免后第 14 天的猪血， 分离血清， 用 ELISA 检测 M- 特异性抗体和用血清 - 病 毒中和实验检测 PRRSV- 中和抗体滴度， 确定该疫苗的体液免疫水平。 0076 结果显示， M 蛋白能激发猪产生特异性抗体和 PRRSV- 中和抗体， 并且 CD40L 能显 著提高抗体滴度 3 4 倍， 说明该疫苗 M-CD40L 能显著诱发机体的体液免疫。 0077 实施例 7 细胞免疫水平检测实验外周血单核淋巴细胞 (PBMC) 增殖实验 0078 采集 3 免后第 14 天的猪血， 分离。
24、外周血单核淋巴细胞 (PBMC)， 做淋巴细胞增殖实 验， 检测该疫苗的细胞免疫水平。 0079 结果显示， 单独的 M 蛋白免疫能够产生特异性细胞免疫， M-CD40L 融合蛋白免疫所 产生特异性细胞免疫效应更强， 说明该疫苗 M-CD40L 能显著诱发机体的细胞免疫。 0080 实施例 8 攻毒后， 猪体内病毒滴度检测 0081 采集攻毒后第 0、 3、 7、 11、 14、 21 天猪血， 分离血清， 提取 RNA， 用 Real-timeRT-PCR 定量检测病毒的 N 基因的 RNA 水平， 用以代表猪体内的病毒含量 ： 0082 引物 -5 ： AAT AACAACGGCAAGCA。
25、GCAG ； 0083 引物 -3 ： CCT CTGGACTGGTTTTGTTGG。 0084 结果显示， 免疫了疫苗M-CD40L的猪体内病毒含量明显低于疫苗M组， 而这两组猪 体内病毒含量明显低于 PBS 和 CD40L 组， 说明该疫苗 M-CD40L 能保护小猪免受病毒攻击。 0085 实施例 9 攻毒后， 猪死亡率 / 存活率检测 0086 攻毒后记录猪死亡情况， 结果如表 1， 免疫了疫苗 M-CD40L 组的死亡率仅为 10， PBS 和 CD40L 组为 90， M 组为 50， 说明基于蛋白 M 的疫苗能显著降低死亡率， 提高小猪 存活率。 0087 表 1， 攻毒后检测猪死亡率及存活率 0088 说 明 书 CN 102908617 A 7 6/6 页 8 说 明 书 CN 102908617 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102908617 A 9 2/3 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102908617 A 10 3/3 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 102908617 A 11 。