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1、(10)申请公布号 CN 102899306 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102899306 A *CN102899306A* (21)申请号 201210229190.5 (22)申请日 2012.07.04 C12N 9/88(2006.01) C12P 13/00(2006.01) (71)申请人 华东师范大学 地址 200241 上海市闵行区东川路 500 号 (72)发明人 邹新琢 郑祖彪 訾艳 李忠洲 (74)专利代理机构 上海蓝迪专利事务所 31215 代理人 徐筱梅 张翔 (54) 发明名称 一种 S- 木薯羟腈裂解酶的提取方法及其在 手性合成乙酸氰醇酯。
2、中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种 S- 木薯羟腈裂解酶的提 取方法及其在手性合成乙酸氰醇酯中的应用， 其 方法是将木薯叶作为酶源， 经破碎， 加入一定浓度 盐水溶液作为粗酶的提取液， 经过滤除去滤渣后， 再加入有机溶剂析出固体， 经过滤获得S- 木薯羟 腈裂解酶 ； 进一步， 将该方法得到S- 羟腈裂解酶 作为手性催化剂， 催化醛与氢氰酸、 丙酮氰醇、 KCN 或 NaCN 等氰源的手性加成反应， 可高收率地获得 高光学纯的氰醇产物， 通过简单连续的乙酰化反 应， 生成较稳定的各种手性乙酰氰醇酯， 避免手性 氰醇的外消旋化。 本发明方法简单、 高效,可高收 率获得高光学纯度的手性氰醇。
3、及其O- 乙酸氰醇 酯， 具有较高的工业应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种 S- 木薯羟腈裂解酶的提取方法， 其特征在于该方法是 ： 将木薯叶作为酶源， 经 破碎， 加入盐水溶液作为粗酶的提取液， 经过滤除去滤渣后， 再加入有机溶剂析出固体， 经 过滤获得S- 木薯羟腈裂解酶， 并置于冰箱中贮存 ； 其中 ： 所述木薯叶为树薯或木番薯的新鲜叶子 ； 所述盐水溶液是 (NH4)2SO4、 Na2SO4、 K2S。
4、O4、NH4C 和 NaCl 中的一种盐的水溶液， 浓度为 0.020.1 mol/L ； 所述有机溶剂是甲醇、 乙醇、 异丙醇、 丙酮、 四氢呋喃和乙腈中的一种， 其用量为提取液 体积的 15 倍。 2. 一种权利要求 1 所得S- 木薯羟腈裂解酶的应用， 其特征在于所述S- 木薯羟腈裂解 酶直接作为手性催化剂， 应用于催化醛与氢氰酸、 丙酮氰醇、 KCN 或 NaCN 氰源的手性加成反 应， 高收率地获得高光学纯的氰醇产物， 通过简单连续的乙酰化反应， 生成较稳定的各种手 性乙酰氰醇酯 ； 具体反应如下 ： 作为反应物使用的醛类化合物具体指下述化合物 ： 式中 R 为 ： C3H7- ； 。
5、C2H5OCH2C(CH3)2- ； CH2CHOCH2C(CH3)2- ； CH3COOCH2C(CH3)2- ； C6H5CH2OCH2C(CH3)2- ； C6H5- ； 4-CH3O-C6H5- ； 3-CH3O-C6H5- ； 2-CH3O-C6H5- ； 4-F-C6H5- ； 4-Cl-C6H5- ； 2-Cl-C6H5- ； 4-Br-C6H5- ； 3- C6H5O-4-F-C6H5- ； 苯乙烯基 ； 2- 萘基 ； 2- 呋喃基 ； 3-呋喃基 ； 2-噻吩基 ； 3-噻吩基 ； 5-甲基-噻吩基 ； 5-氯-噻吩基 ； 5-溴-噻吩基 ； 取代基中的 1 个 ； S- 。
6、木薯氰醇裂解酶的用量为 0.12g/mmol 醛 ； 氰源使用氢氰酸或丙酮氰醇 ； 或者使用 KCN 或 NaCN 加乙酸 ； 氰源的用量为醛摩尔量的 13.0 倍 ； 若使用 KCN 或 NaCN 加乙酸， 则乙酸的用量为 KCN 或 NaCN 摩尔量的 13.0 倍 ； 本发明的第一步反应在水 - 有机溶剂两相体系中进行， 其中有机溶剂为异丙醚， 乙酸 乙酯和甲苯中的一种， 有机溶剂与醛类化合物的摩尔比为10111， 水-有机溶剂的 体积比 1 9 7 3 ； 反应的程序是 ： 加入酶、 氰源、 溶剂并搅拌均匀， 滴加醛， 反应 2472 小时 ； 将经分液后 得到的有机相滴加到盛有乙酸酐。
7、和吡啶的摩尔比为11、 其用量为醛摩尔量的12.0倍的 混合液中， 室温反应 324 小时 ； 经饱和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得相应的目 标化合物。 权 利 要 求 书 CN 102899306 A 2 1/9 页 3 一种 S- 木薯羟腈裂解酶的提取方法及其在手性合成乙酸 氰醇酯中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药和精细化工产品的制备技术领域， 具体地说是一种直接使用 有机溶剂沉淀法从木薯叶中分离提取S- 木薯羟腈裂解酶 （S-MeHNL） 的简单、 高效的方法， 并将其作为手性催化剂应用在催化醛与各种氰源的手性加成反应中， 合成得到手性氰醇及 其乙酸酯。 背景。
8、技术 0002 S- 手性氰醇及其酯是一类具有重要价值的手性源。它可以方便地转化为具有 S- 构型的- 羟基酮、- 羟基醇、- 胺基醇、 氨腈、 氮啶、 咪唑杂环等重要的合成手性药 物及中间体的重要原料。在非手性催化剂或无催化剂的条件下， 醛与 HCN 的加成一般只能 得到外消旋的氰醇产物 ； 所以， 需要使用拆分或手性催化剂才能得到S- 手性氰醇及其酯。 S- 氰醇的生物催化合成， 一般使用S- 羟氰裂解酶作为手性催化剂。而S- 羟氰裂解酶分布 不如R-羟氰裂解酶那样广泛， 目前发现它只存在于橡胶、 木薯和高粱嫩叶等少数几种植物 组织中， 并且丰度较低， 纯化难度大。其中， 木薯是一种在 1。
9、00 多个国家广泛被种植的重要 农作物。Effenberg 等 （Wajant, H.; Forster, S.; Bottinger, H.; Effenberger, F.; Pfizenmaier, K. Plant sci., 1995, 108, 1.） 发现 ： 木薯中含有的S- 木薯羟腈裂解酶 （S-MeHNL） ， 可催化醛或酮和 HCN 合成手性氰醇。Effenberg 等并通过五步法分离得到了 S- 木薯羟腈裂解酶， 分别为 ： 粗酶液的提取 ； 凝胶层析 ； 阴离子交换层析 （pH 5.8） ； 凝胶过 滤层析 ； 再次阴离子交换层析 （pH 7.5） 。 然后将获得的S。
10、-木薯羟腈裂解酶固定在硝基纤维 上作为催化剂， 催化芳醛、 脂肪醛和杂环醛与 HCN 加成合成手性氰醇， 苯甲醛的氰醇产物 ee 值较高 (90%)， 但收率只有 34% ； 其它产物的 ee 值和收率都不理想 (Scheme 1)。 0003 White 等也尝试了用三步法从木薯叶中提取了S- 木薯羟腈裂解酶 ： 即先从木薯叶 中提取了粗酶液， 再用盐析法 （50% 硫酸铵水溶液） 析出S- 木薯羟腈裂粗酶， 并透析 24 h 以 除去粗酶中含有的盐 （硫酸铵） 。在此基础上 White 等对S- 木薯羟腈裂解酶部分酶学性质 进行了研究， 但没有达到催化合成手性氰醇的要求 (White, W。
11、. L. B.; Arias-Garzon, D. I.; McMahon, J. M.; Sayre, R. T. Plant Phsiol. 1998, 116, 1219.)。 说 明 书 CN 102899306 A 3 2/9 页 4 0004 以上这些S- 木薯羟腈裂解酶提取方法存在 ： 酶的收率低、 纯度低、 酶催化反应效 果差等问题。 0005 因此， 科学家们将希望寄于基因工程的方法上。如 Effenberger 等 (Forster S., Roos J., Effenberger F., et al .Angew Chem. Int. Ed. Engl. , 1996, 。
12、35: 437.)将 S- 木薯羟氰裂解酶 （S-MeHNL） 在大肠杆菌等中成功表达， 通过基因重组的方法获得 MeHNL， 并将其作为催化剂应用到S- 氰醇的合成上， 取得了较好的效果。程树华等 ( 程树华 , 严共 鸿 , 吴襟 , 孙万儒， 生物工程学报， 2001， 17 （1） ， 78.) 也成功地将S- 木薯羟氰裂解酶克隆 于质粒 pPIC9K， 在大肠杆菌获得高效表达。重组羟腈酶的催化活性较高。 0006 虽然S- 木薯羟氰裂解酶在基因工程的研究取得了较大的进展， 但由于获得的重 组酶活性通常稳定性差， 浓度低， 到目前为止， 该技术还难以达到实际应用的阶段。 0007 如上。
13、所述, S-木薯羟氰裂解酶在木薯叶中丰度虽然低， 但由于木薯叶是一种来源 丰富的可再生资源， 价廉易得。若能研究开发出 : 一种能简易、 经济、 有效地从木薯叶中提 取具有高催化活性的S- 羟氰裂解酶的方法， 并将其作为手性催化剂直接应用于S- 氰醇及 其乙酸酯的手性加成反应， 则实际应用价值很大。 发明内容 0008 本发明的目的在于提供一种直接使用有机溶剂沉淀法从木薯叶中分离提取S- 木 薯羟腈裂解酶 （S-MeHNL） 的简单、 高效的方法， 并将其应用为手性催化剂催化醛与各种氰源 的手性加成反应， 高收率、 获得高光学纯度手性氰醇及其乙酸酯。 0009 本发明的目的是通过如图 1 所示。
14、的操作程序实现的 ： 即， 将木薯叶作为酶源， 经破碎， 加入一定浓度盐水溶液作为粗酶的提取液， 经过滤除 去滤渣后， 再加入有机溶剂析出固体， 经过滤获得S- 木薯羟腈裂解酶， 并置于冰箱中贮存。 0010 木薯 （Manihot esculenta， cassava） 又称树薯或木番薯， 是广为种植的农作物之 一。所述木薯叶指其新鲜叶子。 0011 所述的盐水溶液可以是 (NH4)2SO4， Na2SO4， K2SO4，NH4Cl 和 NaCl 等盐中的一种盐的 水溶液， 浓度为 0.020.1 mol/L。 0012 所选用的有机溶剂可以是甲醇， 乙醇， 异丙醇， 丙酮， 四氢呋喃和乙腈。
15、中的一种， 其 用量为提取液体积的 15 倍区间。 0013 上述方法获的S- 木薯羟腈裂解酶可以直接作为手性催化剂， 应用于催化醛与氢 氰酸、 丙酮氰醇、 KCN 或 NaCN 等各种氰源的手性加成反应， 可高收率地获得高光学纯的氰醇 产物， 通过简单连续的乙酰化反应， 生成较稳定的各种手性乙酰氰醇酯。该反应可连续操 作， 方法简便和高效。 0014 本发明作为反应物使用的醛类化合物具体指下述化合物 ： 说 明 书 CN 102899306 A 4 3/9 页 5 其 中 式 中 R 为 C3H7- ； C2H5OCH2C(CH3)2- ； CH2CHOCH2C(CH3)2- ； CH3CO。
16、OCH2C(CH3)2- ； C6H5CH2OCH2C(CH3)2- ； C6H5- ； 4-CH3O-C6H5- ； 3-CH3O-C6H5- ； 2-CH3O-C6H5- ； 4-F-C6H5- ； 4-Cl-C6H5- ； 2-Cl-C6H5- ； 4-Br-C6H5- ； 3- C6H5O-4-F-C6H5- ； 苯乙烯基 ； 2- 萘基 ； 2- 呋喃基 ； 3-呋喃基 ； 2-噻吩基 ； 3-噻吩基 ； 5-甲基-噻吩基 ； 5-氯-噻吩基 ； 5-溴-噻吩基 ； 取代基中的 1 个。 0015 S- 木薯氰醇裂解酶的用量为 0.1 2g/mmol 醛。 0016 在本应用中的氰源。
17、可以直接使用氢氰酸和丙酮氰醇 ； 还可以是KCN或NaCN和乙酸 的形式。氰源的用量为醛摩尔量的 1 3.0 倍， 最好是醛摩尔量的 1.5 2.0 倍。 0017 如果是 KCN 或 NaCN 和乙酸的形式， 则乙酸的用量为 KCN 或 NaCN 摩尔量的 1 3.0 倍， 最好是 1.5 2.0 倍。 0018 本发明的第一步反应在水 - 有机溶剂两相体系中进行， 其中有机溶剂为异丙醚， 乙酸乙酯和甲苯中的一种， 有机溶剂与醛类化合物的摩尔比为10111， 水-有机溶 剂的体积比 1 9 7 3。 0019 反应的一般程序是 ： 加入酶、 氰源、 溶剂并搅拌均匀， 滴加醛， 反应2472小。
18、时。 将 经分液后得到的有机相滴加到到盛有乙酸酐和吡啶的摩尔比为 1 1, 其用量为醛摩尔量 的 1 2.0 倍的混合液中， 室温反应 3 24 小时。经饱和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理 后， 获得相应的目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱 （CPcyclodextrin-b-2,3,6-M-19 ， Chrompack, 0.25 mm_25 m ） ， 色谱条件 ： 进样器 ： 260 , 检测器 ： 220。测定产物两种 光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率， 即ee值。表 1 为S- 木薯羟腈裂解酶催化 合成手性乙酸氰醇酯的代表性结果。 0020 本发明的优点是 ： 本。
19、发明以来源广泛、 价廉的可再生资源的木薯叶作为原材料， 使用简单方便的有机溶 剂沉淀法分离出了S- 木薯羟腈裂解酶， 并将其直接应用为手性催化剂催化醛与各种氰源 的手性加成反应， 高收率获得了高光学纯度的手性氰醇及其乙酸酯。 0021 和现有的方法相比较， 本发明方法简单、 高效 , 可高收率获得高光学纯度的手性 氰醇及其O- 乙酸氰醇酯， 具有较高的工业应用价值。 附图说明 图 1 为本发明操作流程图。 具体实施方式 0022 以下为本发明的一些具体实施例， 但本发明不仅仅局限于以下实施例。 0023 实施例 1 ：S- 木薯羟腈裂解酶的提取 木薯叶100 g， 分批在300 mL的 0.0。
20、4mol/L硫酸铵溶液中充分研磨， 得绿色糊状物， 置 于冰箱中静置冷却， 过滤， 得到绿色液体， 置于冰箱中冷却2小时。 冰水浴， 缓慢加入450 mL 的甲醇， 有大量的固体析出， 过滤， 并用少量甲醇洗涤， 得到土黄色固体 13 g。 0024 实施例 2 ：S- 木薯羟腈裂解酶的提取 木薯叶100 g， 分批在300 mL的 0.07mol/L硫酸钠溶液中充分研磨， 得绿色糊状物， 置 于冰箱中静置冷却， 过滤， 得到绿色液体， 置于冰箱中冷却2小时。 冰水浴， 缓慢加入600 mL 的乙醇， 有大量的固体析出， 过滤， 并用少量乙醇洗涤， 得到土黄色固体 15 g。 说 明 书 CN。
21、 102899306 A 5 4/9 页 6 0025 实施例 3 ：S- 木薯羟腈裂解酶的提取 木薯叶 100 g， 分批在 300 mL 的 0.1mol/L 硫酸钾溶液中充分研磨， 得绿色糊状物， 置 于冰箱中静置冷却， 过滤， 得到绿色液体， 置于冰箱中冷却2小时。 冰水浴， 缓慢加入300 mL 的异丙醇， 有大量的固体析出， 过滤， 并用少量异丙醇洗涤， 得到土黄色固体 10 g。 0026 实施例 4 ：S- 木薯羟腈裂解酶的提取 木薯叶100 g， 分批在300 mL的 0.02mol/L氯化钠溶液中充分研磨， 得绿色糊状物， 置 于冰箱中静置冷却， 过滤， 得到绿色液体， 置。
22、于冰箱中冷却2小时。 冰水浴， 缓慢加入450 mL 的丙酮， 有大量的固体析出， 过滤， 并用少量丙酮洗涤， 得到土黄色固体 8 g。 0027 实施例 5 ：S- 木薯羟腈裂解酶的提取 木薯叶100 g， 分批在300 mL的 0.05mol/L硫酸铵溶液中充分研磨， 得绿色糊状物， 置 于冰箱中静置冷却， 过滤， 得到绿色液体， 置于冰箱中冷却2小时。 冰水浴， 缓慢加入600 mL 的四氢呋喃， 有大量的固体析出， 过滤， 并用少量四氢呋喃洗涤， 得到土黄色固体 13 g。 0028 实施例 6 ：S- 木薯羟腈裂解酶的提取 木薯叶100 g， 分批在300 mL的 0.07mol/L。
23、氯化铵溶液中充分研磨， 得绿色糊状物， 置 于冰箱中静置冷却， 过滤， 得到绿色液体， 置于冰箱中冷却2小时。 冰水浴， 缓慢加入450 mL 的乙腈， 有大量的固体析出， 过滤， 并用少量乙腈洗涤， 得到土黄色固体 11 g。 0029 实施例 7 ： 50mL 单口瓶中加入 5 mL 水和 10 mL 乙酸乙酯， 加入实施例 1 制备的S- 木薯羟腈裂解 酶 0.5 g、 搅匀后用橡皮封口。针筒注入 HCN 6 mmol 后、 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的条 件下反应 24 小时 ； 分液后得到的有机相滴加到盛有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合 液中， 室温反应。
24、 24 小时。经饱和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算 化学收率。用手性色谱柱测定产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） ， 结果如表 1 所示。 0030 实施例 8 ： 50mL 单口瓶中加入 5 mL 水和 10 mL 异丙醚， 加入实施例 2 制备的S- 木薯羟腈裂解酶 0.5 g、 搅匀后用橡皮封口。针筒注入丙酮氰醇 4.5 mmol 后、 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴 的条件下反应 72 小时 ； 分液后得到的有机相滴加到盛有 4 mmol 乙酸酐和 4 mmol 吡啶的 混合液中， 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和。
25、水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） ， 结果如表 1 所示。 0031 实施例 9 ： 2 mL 水和 8 mL 异丙醚中， 加入实施例 3 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 1 g、 NaCN 4.5 mmol、 醋酸 5.6 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 冰水浴的条件下反应36小时 ； 分液后得到 的有机相滴加到盛有 6 mmol 乙酸酐和6 mmol吡啶的混合液中, 室温反应24小时。 经饱 和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 。
26、用手性色谱柱测定 产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0032 实施例 10 ： 5 mL 水和 5 mL 异丙醚中， 加入实施例 4 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 0.4 g、 NaCN 5 说 明 书 CN 102899306 A 6 5/9 页 7 mmol、 醋酸 10 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的条件下反应 72 小时 ； 分液后得到 的有机相滴加到盛有 4 mmol 乙酸酐和 4 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经饱 和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算。
27、化学收率。 用手性色谱柱测定 产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0033 实施例 11 ： 2 mL 水和 8 mL 异丙醚中， 加入实施例 5 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 0.5 g、 NaCN4.5mmol、 醋酸 9 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 反应 72 小时 ； 分液后得到的有机相 滴加到盛有 6 mmol 乙酸酐和6 mmol吡啶的混合液中, 室温反应24小时。 经饱和碳酸氢 钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种 光学异构体的含量并计算其对映体过量。
28、百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0034 实施例 12 ： 2 mL 水和 8 mL 甲苯中， 加入实施例 6 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 0.8 g、 NaCN 4 mmol、 醋酸 8 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 冰水浴的条件下反应48小时 ； 分液后得到的 有机相滴加到盛有 5 mmol 乙酸酐和5 mmol吡啶的混合液中, 室温反应24小时。 经饱和 碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产 物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0035 实施例 13。
29、 ： 5 mL 水和 5 mL 异丙醚中， 加入实施例 1 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 1 g、 NaCN 4 mmol、 醋酸 8 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 反应36小时 ； 分液后得到的有机相滴加到盛 有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合液中 , 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和水 洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学异 构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0036 实施例 14 ： 2 mL 水和 8 mL 异丙醚中， 加入实施例 2 制备的S- 木薯。
30、羟腈裂解酶粗酶 0.5 g、 NaCN 5 mmol、 醋酸 10 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的条件下反应 48 小时 ； 分液后得到 的有机相滴加到盛有 5 mmol 乙酸酐和5 mmol吡啶的混合液中, 室温反应24小时。 经饱 和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定 产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0037 实施例 15 ： 2 mL 水和 8 mL 甲苯中， 加入实施例 3 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 0.1 g、 NaCN 6 mmol、 醋。
31、酸 12 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的条件下反应 72 小时 ； 分液后得到 的有机相滴加到盛有 6 mmol 乙酸酐和6 mmol吡啶的混合液中, 室温反应24小时。 经饱 和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定 产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0038 实施例 16 ： 3 3 mL 水和 7 mL 异丙醚中， 加入实施例 4 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 1 g、 NaCN 6 mmol、 醋酸 12 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛。
32、， 反应 30 小时 ； 分液后得到的有机相滴加到 说 明 书 CN 102899306 A 7 6/9 页 8 盛有 6 mmol 乙酸酐和6 mmol吡啶的混合液中, 室温反应24小时。 经饱和碳酸氢钠和水 洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学异 构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0039 实施例 17 ： 2 mL 水和 8 mL 甲苯中， 加入实施例 5 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 0.4 g、 NaCN 5 mmol、 醋酸 10 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴。
33、的条件下反应 48 小时 ； 分液后得到 的有机相滴加到盛有 6 mmol 乙酸酐和6 mmol吡啶的混合液中, 室温反应24小时。 经饱 和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定 产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0040 实施例 18 ： 3 mL 水和 7 mL 乙酸乙酯中， 加入实施例 6 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 0.8 g、 NaCN 4 mmol、 醋酸 6 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 反应48小时 ； 分液后得到的有机相滴加到 盛有 5 mmol 乙。
34、酸酐和 5 mmol 吡啶的混合液中 , 室温反应 3 小时。经饱和碳酸氢钠和水 洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学异 构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0041 实施例 19 ： 5 mL 水和 5 mL 异丙醚中， 加入实施例 1 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 2 g、 NaCN 4.5 mmol、 醋酸 9 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 冰水浴的条件下反应24小时 ； 分液后得到的 有机相滴加到盛有 6 mmol 乙酸酐和6 mmol吡啶的混合液中, 室温反应24小时。 经饱。
35、和 碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产 物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0042 实施例 20 ： 3 mL 水和 7 mL 乙酸乙酯中， 加入实施例 2 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 0.9 g、 NaCN 6 mmol、 醋酸 10 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的条件下反应 48 小时 ； 分液后得 到的有机相滴加到盛有 4 mmol 乙酸酐和 4 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经 饱和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得。
36、目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测 定产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0043 实施例 21 ： 3 mL 水和 7 mL 乙酸乙酯中， 加入实施例 3 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 1 g、 NaCN 4.5 mmol、 醋酸 9 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 反应48小时 ； 分液后得到的有机相滴加 到盛有 5 mmol 乙酸酐和 5 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和 水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学 异构体的含量。
37、并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0044 实施例 22 ： 3 mL 水和 7 mL 异丙醚中， 加入实施例 4 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 2 g、 NaCN 6 mmol、 醋酸 10 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的条件下反应 24 小时 ； 分液后得到 说 明 书 CN 102899306 A 8 7/9 页 9 的有机相滴加到盛有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经饱 和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定 产物两种光学异构。
38、体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0045 实施例 23 ： 4 mL 水和 6 mL 异丙醚中， 加入实施例 5 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 1 g、 NaCN 5 mmol、 醋酸 8 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 反应36小时 ； 分液后得到的有机相滴加到盛 有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。用手性色谱柱测定产物两种光学异构 体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0046 。
39、实施例 24 ： 5 mL 水和 5 mL 异丙醚中， 加入实施例 6 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 2 g、 NaCN 4.5 mmol、 醋酸 6 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 反应24小时 ； 分液后得到的有机相滴加到盛 有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。用手性色谱柱测定产物两种光学异构 体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0047 实施例 25 ： 3 mL 水和 7 mL 乙酸乙酯中， 加入实施例 1 制备。
40、的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 1 g、 NaCN 4.5 mmol、 醋酸 6 mmol， 搅匀， 滴加3 mmol底物醛， 反应48小时 ； 分液后得到的有机相滴加 到盛有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和 水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学 异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0048 实施例 26 ： 5 mL 水和 7 mL 异丙醚中， 加入实施例 2 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 1 g、 NaCN 6 mmol、 醋酸 10。
41、 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 反应 48 小时 ； 分液后得到的有机相滴加到 盛有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和水 洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学异 构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0049 实施例 27 ： 5 mL 水和 5 mL 乙酸乙酯中， 加入实施例 3 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 0.8 g、 NaCN 6 mmol、 醋酸 10 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 反应 48。
42、 小时 ； 分液后得到的有机相滴加 到盛有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和 水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学 异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0050 实施例 28 ： 50mL 单口瓶中加入 3 mL 水和 7 mL 乙酸乙酯， 加入实施例 4 制备的S- 木薯羟腈裂解 酶 1 g、 搅匀后用橡皮封口。针筒注入丙酮氰醇 6 mmol 后、 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的 条件下反应 48 小时 ； 分液后得到的有机相滴。
43、加到盛有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混 说 明 书 CN 102899306 A 9 8/9 页 10 合液中 , 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） ， 结果如表 1 所示。 0051 实施例 29 ： 5 mL 水和 5 mL 乙酸乙酯中， 加入实施例 5 制备的S- 木薯羟腈裂解酶粗酶 1 g、 NaCN 6 mmol、 醋酸 10 mmol， 搅匀， 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的条件下反应 48 小时 ； 分液后得。
44、到 的有机相滴加到盛有 6 mmol 乙酸酐和 6 mmol 吡啶的混合液中， 室温反应 3 小时。经饱和 碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算化学收率。 用手性色谱柱测定产 物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） 。结果如表 1 所示。 0052 实施例 30 ： 50mL单口瓶中加入3 mL水和7 mL乙酸乙酯， 加入实施例6制备的S-木薯羟腈裂解酶 1 g、 搅匀后用橡皮封口。针筒注入丙酮氰醇 6 mmol 后、 滴加 3 mmol 底物醛， 冰水浴的条 件下反应 48 小时 ； 分液后得到的有机相滴加到盛有 4 mmol 乙酸酐和 4 mmol 吡啶的混合 液中， 室温反应 24 小时。经饱和碳酸氢钠和水洗、 干燥、 浓缩处理后， 获得目标化合物， 计算 化学收率。用手性色谱柱测定产物两种光学异构体的含量并计算其对映体过量百分率 （ee 值） ， 结果如表 1 所示。 0053 表 1 ：S- 木薯羟腈裂解酶催化合成手性乙酸氰醇酯的代表性结果 说 明 书 CN 102899306 A 10 9/9 页 11 说 明 书 CN 102899306 A 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102899306 A 12 。