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1、(10)申请公布号 CN 102888455 A (43)申请公布日 2013.01.23 CN 102888455 A *CN102888455A* (21)申请号 201210339621.3 (22)申请日 2012.09.14 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (71)申请人 珠海市银科医学工程有限公司 地址 519090 广东省珠海市金湾区红旗工业 园虹晖二路 (72)发明人 孙宜峰 龚惠勇 曾冰冰 (74)专利代理机构 广州市红荔专利代理有限公 司 44214 代理人 王贤义 (54) 发明名称 环介。
2、导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试 剂盒及其引物 (57) 摘要 本发明公开了一种检测成本低、 使用方便、 检 测快速高效、 灵敏度高的基于环介导等温扩增技 术的结核分枝杆菌的检测试剂盒， 以及在该试剂 盒上应用到的引物。所述引物的序列如序列编号 SEQ ID NO.14所示 ； 本发明所述试剂盒除了包 括上述引物外， 还包括 12.5l 的扩增体系预混 合物、 1l 5 15pmol/l 的引物 F3、 1l 5 15pmol/l 的 引 物 B3、 1l 20 40pmol/l 的引物 FIP、 1l 20 40pmol/l 的引物 BIP、 2.5l 的无菌双蒸水 ； 利用所述试剂盒进行。
3、环介 导等温扩增检测结核分枝杆菌， 能使检测成本大 大降低， 且检测快速高效， 灵敏度高。本发明可应 用于结核分枝杆菌检测领域。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的引物， 其特征在于， 包括外引物 F3、 外引 物 B3、 内引物 FIP 及内引物 BIP， 其序列分别如下 ： 外引物 F3 ： 5 -ACCGAGGTCAAATCGTTTGT-3 ； 外引物。
4、 B3 ： 5 -ATCCGTGGAACGGCAATC-3 ； 内引物 FIP ： 5 -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3 ； 内引物 BIP ： 5 -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3 。 2. 一种包括如权利要求 1 所述的环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的引物的检测试 剂盒， 其特征在于， 该试剂盒包括如下成分 ： 3. 根据权利要求 2 所述的环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试剂盒， 其特征 在于 ： 所述扩增体系预混合物中含有 2.5ul 10 倍浓缩的 Bst DNA 聚合酶反应缓。
5、冲液、 4ul 10mmol/L dNTP、 1ul 100mmol/L 硫酸镁、 5ul 5mol/L 甜菜碱。 权 利 要 求 书 CN 102888455 A 2 1/5 页 3 环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试剂盒及其引物 技术领域 0001 本发明涉及结核分枝杆菌的检测技术， 尤其涉及一种环介导等温扩增检测结核分 枝杆菌的检测试剂盒及其引物。 背景技术 0002 结核分枝杆菌 （Mycobacterium Tuberculosis， TB）简称为结核杆菌 （tubercle bacilli） 。早在 1882 年， 德国细菌学家郭霍 （Robert Koch， 1843-191。
6、0） 就已证明结核分枝 杆菌是结核病的病原菌。 结核分枝杆菌可侵犯全身各组织器官， 但以肺部感染最多见。 随着 抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善， 结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。 20 世纪 80 年代后， 由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、 免疫抑制剂的应用、 吸毒、 贫困及人口流动等因素， 全球范围内结核病的疫情骤然恶化。 如今， 结核病仍然是影响人类 健康流行性最广、 病死率最高的感染性疾病之一。 寻求快速、 准确的诊断方法一直是结核病 学首要研究的领域。 0003 目前， 肺结核的诊断方法主要包括 ：（1） 痰涂片检查。一般初次就诊要查三个痰标 本， 即夜间痰、 清。
7、晨痰和即时痰。痰涂片检查的阳性率受标本质量、 处理方法、 观察视野数、 镜检者的技术水平和经验等因素的影响。痰涂片镜检法操作简便、 出结果快、 费用低廉， 但 只以抗酸性特征为依据， 故不能作为结核杆菌种特异性鉴定的依据。 （2） 痰结核菌培养， 结 果可信度高， 并能做结核菌药敏试验， 但需时 6-8 周， 应用受到限制。该法至少需要 103 104细菌 / ml 才能检出阳性结果。特别是微量菌、 细胞壁缺陷菌和化疗后细菌受到损伤培 养难以生长， 就更突出了培养的局限性。 同时由于肺结核属于呼吸道传播的烈性传染病， 对 实验室安全要求较高， 不利于结核杆菌的普遍筛查。 （3） 免疫法。此检测。
8、技术快速简便、 成 本低廉， 但要求高质量高稳定性的单克隆抗体， 否则因准确性不够， 目前只能是辅助检测手 段。 （4） 聚合酶链式反应 （PCR） 。聚合酶链式反应法技术因其灵敏、 特异、 快速， 对于难以培 养、 生长缓慢的结核分枝杆菌检测有着独特意义， 已成功用于临床标本结核分枝杆菌的检 测， 近年来， 该技术在结核分枝杆菌检测中的应用研究取得很大进展， 特别是通过与 DNA 指 纹技术、 DNA 探针技术结合， 进一步提高了检测的灵敏度和准确性， 不但能定性， 而且能定量 检测出结核分枝杆菌 DNA 的含量， 该成果将对临床具有极大的意义。由于目前基因检测技 术的复杂性和结核分枝杆菌的。
9、高传染性， 要进行结核分枝杆菌的基因检测， 不仅需要昂贵 的仪器设备， 而且对实验室条件也有很高的要求， 这给结核病的快速诊断造成许多困难， 不 利于基层医疗防疫机构及现场快速测定。 0004 环介导等温扩增 （loop-mediated isothermal amplification， LAMP） 是一种新型 核酸扩增技术， 最初由日本科学家 Notomi， T 等设计用来检测病原微生物， 具有简单、 快速、 特异性强的特点。其基本原理是采用 4 条引物来识别基因上的 6 个特异区域， 同时利用一 种具有链置换特性的 DNA 聚合酶， 在恒温条件下进行扩增反应。将样品、 引物、 具有链置换。
10、 特性的 DNA 聚合酶及反应液混合， 置于 60 65的恒温条件下反应， 基因的扩增和检测即 可一步完成。该扩增法扩增效率高， 15 60 分钟内 DNA 扩增可达 109 1010倍。鉴于其高 说 明 书 CN 102888455 A 3 2/5 页 4 特异性， 可通过扩增产物是否生成来判断目的基因是否存在。 该方法不需要模板的热变性、 长时间温度循环、 繁琐的电泳、 紫外观察等过程， LAMP 法具有高特异性、 高效性、 快速、 廉价 （不需要特定的贵重检测设备， 只需要简单结构的恒温箱） 、 易检测 （直接进行目测判断） 等特 点。LAMP 具有简单、 快速、 特异性强的特点， 能代。
11、替 PCR 方法的最新技术。现已被广泛用于 微生物检测及胚胎性别鉴定等领域， 如何运用环介导等温扩增技术检测结核分枝杆菌在临 床诊断技术发展中具有重大意义， 因此开发一种简单快速、 检测效率高的运用环介导等温 扩增技术来检测结核分枝杆菌的方法迫在眉睫。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一种检测成本低、 使用 方便、 检测快速高效、 灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌的检测试剂盒， 以及在该试剂盒上应用到的引物。 该试剂盒是基于环介导等温扩增技术来检测结核分枝杆 菌的。 0006 本发明环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的引物所采用的技术方案是 ：。
12、 本发明所 述引物包括外引物 F3、 外引物 B3、 内引物 FIP 及内引物 BIP， 其序列分别如下 ： 外引物 F3 ： 5 -ACCGAGGTCAAATCGTTTGT-3 ； 外引物 B3 ： 5 -ATCCGTGGAACGGCAATC-3 ； 内引物 FIP ： 5 -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3 ； 内引物 BIP ： 5 -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3 。 0007 本发明环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试剂盒所采用的技术方案是 ： 本 发明所述试剂盒包括以下成分 ： 。
13、说 明 书 CN 102888455 A 4 3/5 页 5 所述扩增体系预混合物中含有 2.5ul 10 倍浓缩的 Bst DNA 聚合酶反应缓冲液、 4ul 10mmol/L dNTP、 1ul 100mmol/L 硫酸镁、 5ul 5mol/L 甜菜碱。 0008 本发明的有益效果是 ： 本发明试剂盒是根据结核分枝杆菌的特异基因序列为结核 分枝杆菌各不同菌株型所共有而设计， 以保证从种的水平上检测不同来源的结核分枝杆菌 的可靠性， 利用本发明试剂盒基于环介导等温扩增的鉴定方法更适用于直接从患者带菌痰 液等临床标本中扩增靶基因， 只需要一次环介导等温扩增反应就能够检测结核分枝杆菌是 否存在。
14、， 大大提高了检测效率， 相比较其它 PCR 方法， 利用本发明的试剂盒进行检测的方法 仅需要简单的设备恒温水浴箱、 离心机或普通电泳设备 （电泳仪） 即可， 大大提高了性 价比节约了成本 ； 利用本发明的试剂盒进行环介导等温扩增具有检测准确、 特异性强、 灵敏 度高、 简便、 快速的特点， 可以快速、 准确的鉴定目标菌， 且不受培养条件和细菌生理状态的 影响， 较生理生化鉴定方法准确。 附图说明 0009 图 1 是环介导等温扩增产物离心后检测样品目测沉淀结果 ： 试管底部可见明显白 色沉淀， 阴性对照没有沉淀， 其中 1 ： 阳性结果， 2 ： 阴性对照 （左边为 1 ： 阳性结果， 可见。
15、白色 沉淀 ； 右边为 2 ： 阴性对照） ； 图 2 是环介导等温扩增产物加入 SYBR Green 后染色结果 ： 待测样品溶液呈现绿色， 阴 性对照为橙色， 其中 1 ： 阴性对照， 2 ： 阳性结果 （左边为 1 ： 阴性对照， 橙色 ； 右边为 2 ： 阳性结 果， 绿色） ； 图3是环介导等温扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后检测结果 ： 待测样品出现阶梯状 条带， 阴性对照没有条带， 其中 1 ： 阴性对照 ； 2 ： 阳性结果 （左边为 1 ： 阴性对照， 无条带 ； 右 边为 2 ： 阳性结果， 可见阶梯状条带） 。 具体实施方式 0010 下面就具体实施例对本发明做进一步阐。
16、述 ： 从美国 NCBI 的基因数据库 (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/) 下载并得到结核分 枝杆菌的特异基因序列， 如以下编号为 SEQ ID NO.5 的序列所示。然后通过专业软件 PrimerExplorer (http:/primerexplorer.jp/e/) 设计用于环介导等温扩增技术检测的 特异性寡核苷酸引物， 以引物组扩增待测样品模板， 进行目的基因片段的特异性扩增， 其扩 增步骤包括 ： （1） 基因提取步骤， 从待检样品中提取模板 DNA ； 具体如下 ： 取痰样12ml， 加入等体积4%NaOH溶液漩涡震荡混匀， 使两者充分接触， 静置30分钟 。
17、至充分液化无痰丝 ； 吸取0.5ml液化后的样品至离心管中， 10000转/分钟离心5分钟， 弃上清液， 沉淀中加 入生理盐水 1ml。震荡洗涤沉淀后 10000 转 / 分钟离心 5 分钟， 弃上清液， 收集沉淀 ； 重复 一次加生理盐水洗涤步骤 ； 沉淀中加入裂解液 （20mM Tris HClpH8.0,2mM EDTA,1.2% Triton X-100,0.3% Tween-20） 100ul， 于沸水浴中煮沸 20 分钟， 后于冰上迅速冷却 ； 放入离心机 10000 转 / 分钟离心 5 10 分钟， 取上清到无菌离心管中， 即为待检模板 说 明 书 CN 102888455 A。
18、 5 4/5 页 6 DNA。 0011 5 -ACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAACGAACAGCTGACCCACTGGTTTGAAGCCAAC CCCACCGACGCGAAAGTCGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGCGCAAGCCCGTATCGCGGCACGTAAGGCACGAGA GTTGGTGCGGCGTAAGAGCGCCACCGACATCGGTGGATTGCCCGGCAAGCTGGCCGATTGCCGTTCCACGGAT-3 ， SEQ ID NO.5。 0012 （2） 环介导等温扩增反应步骤， 将上述模板 DNA 加入反应体系中进。
19、行扩增反应， 其 中所使用的引物序列如下 ： 外引物 F3 ： 5 -ACCGAGGTCAAATCGTTTGT-3 ， 序列编号为 SEQ ID NO.1 ； 外引物 B3 ： 5 -ATCCGTGGAACGGCAATC-3 ， 序列编号为 SEQ ID NO.2 ； 内引物FIP ： 5 -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3 ， 序列编号为SEQ ID NO.3 ； 内引物 BIP ： 5 -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3 ， 序列编号为 SEQ ID NO.4。 0013 所使用的反应体系除。
20、了包括上述引物外还包括扩增体系预混合物、 Bst DNA 聚合 酶以及双蒸水， 其成分和加样量如下表所示 ： 上述的扩增体系预混合物中含有 2.5ul 10 倍浓缩的 Bst DNA 聚合酶反应缓冲液、 4ul 10mmol/L dNTP、 1ul 100 mmol/L 硫酸镁、 5ul 5mol/L 甜菜碱 ； 10 倍浓缩的 Bst DNA 聚合酶 反应缓冲液含有 200mM pH8.8 的三羟基甲基氨基甲烷 - 盐酸、 100mM 的氯化钾、 100mM 的硫 酸铵、 20mM 的硫酸镁和 1% 的曲拉通 X-100 ； 其中所述 dNTP 中含有的 dATP、 dTTP、 dCTP、 。
21、dGTP 的质量比为 1 1 1 1。 0014 检测步骤 ： 在装有 19ul LAMP 反应液的反应管中加入 5ul 待检样品模板 DNA 和 说 明 书 CN 102888455 A 6 5/5 页 7 1ul Bst DNA聚合酶 ； 于恒温水浴箱或金属浴中6065放置4590分钟 ； 于80 95放置 3 5 分钟终止反应， 取出观察结果。 0015 （3） 结果检测步骤， 选择以下三种扩增产物检测方法中的任意一种进行检测 ： A: 将扩增产物离心目测白色沉淀来检测结果 ； B ： 加入显色液观察反应液颜色来检测结果 ； C ： 1.5% 琼脂糖凝胶电泳， 通过电泳带形分析检测结果。。
22、 0016 其中采用 A 方法检测时， 阳性结果会产生白色沉淀， 如图 1 所示。在环介导等温扩 增过程中， dNTP 不断添加进新合成的核苷酸链， 同时会生成大量的副产物 - 焦磷酸镁。焦 磷酸镁是一种白色沉淀， 由于整个扩增试验都是在 61左右进行， 所以焦磷酸镁沉淀无法 溶解， 最终， 随着阳性核苷酸链的增加， 焦磷酸镁沉淀也在不断积累。从而在反应结束后可 以直接通过观察白色沉淀而确定阳性反应。 0017 采用 B 方法检测时， 阳性结果如果加入 SYBR Green 染料， 溶液变为绿色。阳性的 环介导等温扩增会合成大量的核苷酸链。反应后， 向阳性产物中加入 SYBR Green 染料。
23、后， SYBR Green分子会大量嵌入核苷酸链中， 从而使SYBR Green分子产生绿色荧光。 而阴性结 果由于没有目的基因片段， 无法扩增出核苷酸链， SYBR Green 也无法同核苷酸链结合， 结果 只能是橙色， 如图 2 所示。 0018 如采用 C 方法检测时， 阳性结果在电泳中表现为阶梯状条带。环介导等温扩增的 原理是， FIP 引物杂交在目标 DNA 的 F2C 区段， 启动互补链合成， 导致 DNA 哑铃状的产生。此 哑铃状结构很快以自身为模板， 进行 DNA 合成延伸， 形成茎 - 环 DNA 结构， 该茎 - 环结构是 LAMP法基因扩增循环的起始结构。 LAMP反应以。
24、此DNA结构为起始结构， 进行再循环和延伸， 靶 DNA 序列大量交替重复产生， 形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎 - 环结构的 DNA。因此随着扩增的不断进行， 积累了以这一环状结构为基数的核苷酸链， 反应在电泳中 即表现为形成阶梯状电泳条带， 如图 3 所示。 0019 本发明可应用于结核分枝杆菌检测领域。 说 明 书 CN 102888455 A 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 珠海市银科医学工程有限公司 环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试剂盒及其引物 5 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 misc_feature (。
25、1)(20) 外引物 F3 1 accgaggtca aatcgtttgt 20 2 18 DNA 人工序列 misc_feature (1)(18) 外引物 B3 2 atccgtggaa cggcaatc 18 3 40 DNA 人工序列 misc_feature (1)(40) 内引物 FIP 3 序 列 表 CN 102888455 A 8 2/2 页 9 cgaggacaca gccttgttca cagaacagct gacccactgg 40 4 38 DNA 人工序列 misc_feature (1)(38) 内引物 BIP 4 cgtatcgcgg cacgtaaggc gg。
26、gcaatcca ccgatgtc 38 5 216 DNA 结核分枝杆菌 （Mycobacterium Tuberculosis， TB） 5 accgaggtca aatcgtttgt gcagaaggtc tgtaacgaac agctgaccca ctggtttgaa 60 gccaacccca ccgacgcgaa agtcgttgtg aacaaggctg tgtcctcggc gcaagcccgt 120 atcgcggcac gtaaggcacg agagttggtg cggcgtaaga gcgccaccga catcggtgga 180 ttgcccggca agctggccga ttgccgttcc acggat 216 序 列 表 CN 102888455 A 9 1/3 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102888455 A 10 2/3 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102888455 A 11 3/3 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 102888455 A 12 。