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1、(10)申请公布号 CN 102888462 A (43)申请公布日 2013.01.23 CN 102888462 A *CN102888462A* (21)申请号 201210399113.4 (22)申请日 2012.10.18 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 新疆农垦科学院 地址 832000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 石河子乌伊公路 221 号 (72)发明人 宿俊吉 陈红 相吉山 邓福军 吴嫚 甘尚权 刘洋 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 利用 SSR 标记快速检测低频外源染色体小片。
2、 段或基因的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种检测待测样本中是否含有 目的 DNA 的方法。该方法包括如下步骤 ： 将待测 样本进行矩阵排列 ； 分别作行混合和列混合 ； 分 别检测混合后样本是否含目的 DNA 或其等价遗传 标记物 ； 将结果阳性的混合样本对应的混合前待 测样本均作标记 ； 若结果阳性的行混合样本只有 1 个， 和 / 或结果阳性的列混合样本只有 1 个， 则 标记两次的待测样本含目的 DNA， 其余待测样本 不含目的 DNA ； 若结果阳性的行混合样本和列混 合样本均有 2 个以上， 则分别检测标记两次的待 测样本是否含目的 DNA 或其等价遗传标记物， 结 果阳性的待。
3、测样本含目的 DNA， 其余待测样本不 含目的 DNA。该方法用于植物遗传背景外源染色 体片段或基因的追踪和鉴定， 可节约实验成本， 提 高工作效率、 加快实验进程。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种检测待测样本中是否含有目的 DNA 的方法， 包括如下步骤 ： （a） 将 N 个待测样本按照如式 （1） 所示的矩阵 A 进行排列 ； 式 （1） （b） 混合位于所述矩阵 A 中每一行的。
4、所有所述待测样本， 共得到 m 个行混合样本 ； 混合 位于所述矩阵 A 中每一列的所有所述待测样本， 共得到 n 个列混合样本 ； （c） 分别检测步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列混合样本中是否存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物 ； （d） 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所有所述行混合样本对 应的混合前所述待测样本均进行标记 ； 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标 记物的所有所述列混合样本对应的混合前所述待测样本均进行标记 ； （e）根据步骤 （d）的标记结果， 按照如下方法确定所述 N 个待测样本是否含有目的 DN。
5、A ： 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述行混合样本有且只有 1 个， 和 / 或经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述列混合样本有且只 有 1 个， 则步骤 （d） 中标记过两次的所述待测样本含有所述目的 DNA 或候选含有所述目的 DNA， 其余所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 若经步骤 （c） 检测存在所述目的DNA的等价遗传标记物的所述行混合样本有2个以上， 同时经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述列混合样本有 2 个以上， 则将步骤 （d） 中标记过两次的所述。
6、待测样本取出， 分别检测是否存在所述目的 DNA 的等价 遗传标记物， 存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述待测样本含有所述目的 DNA 或候 选含有所述目的 DNA， 其余所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 若所有所述行混合样本经步骤 （c） 检测不存在所述目的DNA的等价遗传标记物， 和/或 若所有所述列混合样本经步骤 （c） 检测不存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物， 则所有所 述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 其中， m 和 n 均为 3 以上的整数， N 等于 mn。 2. 一种检测待测样本中是否含有。
7、目的 DNA 的方法， 包括如下步骤 ： （a） 将 N 个待测样本按照如式 （1） 所示的矩阵 A 进行排列 ； 式 （1） 权 利 要 求 书 CN 102888462 A 2 2/2 页 3 （b） 混合位于所述矩阵 A 中每一行的所有所述待测样本， 共得到 m 个行混合样本 ； 混合 位于所述矩阵 A 中每一列的所有所述待测样本， 共得到 n 个列混合样本 ； （c） 分别检测步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列混合样本中是否存在所述目的 DNA ； （d） 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所有所述行混合样本对应的混合前所述待 测样本均进行标记 ； 将经步骤。
8、 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所有所述列混合样本对应的混 合前所述待测样本均进行标记 ； （e）根据步骤 （d）的标记结果， 按照如下方法确定所述 N 个待测样本是否含有目的 DNA ： 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所述行混合样本有且只有 1 个， 和 / 或经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所述列混合样本有且只有 1 个， 则步骤 （d） 中标记过两次的所 述待测样本含有所述目的 DNA 或候选含有所述目的 DNA， 其余所有所述待测样本不含有所 述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所述行混合样本。
9、有 2 个以上， 同时经步骤 （c） 检 测存在所述目的 DNA 的所述列混合样本有 2 个以上， 则将步骤 （d） 中标记过两次的所述待 测样本取出， 分别检测是否存在所述目的 DNA， 存在所述目的 DNA 的所述待测样本含有所述 目的DNA或候选含有所述目的DNA， 其余所有所述待测样本不含有所述目的DNA或候选不含 有所述目的 DNA ； 若所有所述行混合样本经步骤 （c） 检测均不存在所述目的 DNA， 和 / 或若所有所述列混 合样本经步骤 （c） 检测均不存在所述目的 DNA， 则所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或 候选不含有所述目的 DNA ； 其中， m 和 n 均为。
10、 3 以上的整数， N 等于 mn。 权 利 要 求 书 CN 102888462 A 3 1/8 页 4 利用 SSR 标记快速检测低频外源染色体小片段或基因的方 法 技术领域 0001 本发明涉及一种检测待测样本中是否含有目的 DNA 的方法， 特别涉及一种利用 SSR 标记快速检测低频外源染色体小片段或基因的方法。 背景技术 0002 植物遗传改良是通过对目标基因进行选择， 实现优良基因聚合的过程。如果在目 标基因导入植物的过程中， 对被转移的基因及其载体外源染色体或染色体片段进行追 踪和鉴定， 可以提高选择的准确性， 从而缩短育种周期， 提高育种效率。 因此， 对导入植物背 景中的外源。
11、染色体或染色体片段、 以及其所携带的外源基因进行有效鉴定十分重要。 目前， 基于遗传标记系统而建立起来的鉴定外源染色体或基因的方法， 主要包括 ： 形态标记、 细胞 学标记、 生化标记、 原位杂交和分子标记等， 其中分子标记是最有效鉴定方法之一。 0003 近年来随着分子生物学技术的发展， 出现了限制性片段长度多态性 （RFLP） 、 随机 扩增多态性 DNA （RAPD） 、 扩增片段长度多态性 （AFIP） 、 简单重复序列 （SSR） 标记和单核苷酸 多态性 （SNP） 等多种分子标记技术。 这些方法精确可靠， 而且可以弥补显带技术和原位杂交 技术只能鉴定较大片段的外源染色体的缺点， 可。
12、以鉴定检测比较小的外源染色体片段。通 过运用 RFLP， RAPD， AFLP， SSR， SNP 等方法建立各种外源染色体片段或基因的分子标记， 然 后利用这些标记来鉴定转移到植物背景中的外源遗传物质。 传统方法鉴定各种抗性和抗病 基因及其他性状比较费时费力， 利用与这些基因和性状连锁的分子标记进行检测和鉴定， 不仅省时省力， 而且准确性高， 提高了效率。齐莉莉等对源于簇毛麦染色体 6V 上抗白粉病 基因的分子标记的研究， 用OPH17， OPAL01， OPHAN03及OPHAL03等引物扩增出簇毛麦的特异 带， 可作为来源于簇毛麦 6VS 抗白粉病基因 Pro21 的 RAPD 标记。刘。
13、志勇等进一步将 OPH17 转化为与 Pm21 连锁的 SCAR 标记， 即 SCAR1400 和 SCAR1265。王芙蓉、 张军、 刘任重等利用花 粉管通道导入技术将海岛棉品种海 7124 的基因组总 DNA 导入陆地棉栽培品种石远 321 中， 获得了纤维品质优良的新种质系， 利用SSR标记对变异材料进行研究发现， 外源DNA已经整 合在陆地棉的基因组中， 并推测某些 DNA 片段可能是通过同源重组的机制整合到陆地棉染 色体上。 0004 染色体片段置换系 （chromosome segment substitution lines， CSSL） 是利用杂 交、 回交和分子标记辅助选择 。
14、（marker-assisted selection， MAS） 构建的覆盖作物整个基 因组的一系列近等基因系。它的基因组内只有来自供体亲本的一个纯合的染色体片段， 而 基因组的其余部分与轮回亲本相同。 它是进行基因组研究， 特别是QTL定位的理想材料。 南 京农业大学王鹏、 张天真等人以陆地棉遗传标准系TM-1为受体亲本， 海岛棉海7124为供体 亲本在 BC5S1 代借助分子标记辅助选择 （MAS） 培育了一套由 330 个株系构成的染色体片段 置换系。 0005 在科学实验中， 往往我们可以碰到在一个大群体中， 对一个或少数几个阳性植株 或目标基因进行筛选鉴定。若逐个筛选鉴定， 不仅需要。
15、大量人力物力， 而且需要较长时间， 说 明 书 CN 102888462 A 4 2/8 页 5 才能获得鉴定结果。 因此， 探寻出一条捷径， 提高大群体中低频率外源染色体片段或基因的 筛选鉴定效率， 就显得尤为重要。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种检测待测样本中是否含有目的 DNA 的方法。该方法尤其 适用于含有低频目的基因的大量待测样本的检测。 0007 本发明所提供的检测待测样本中是否含有目的 DNA 的方法具体可包括如下步骤 ： 0008 （a） 将 N 个待测样本按照如式 （1） 所示的矩阵 A 进行排列。 0009 0010 式 （1） 0011 （b） 混合位于所述矩。
16、阵 A 中每一行的所有所述待测样本， 共得到 m 个行混合样本 ； 混合位于所述矩阵 A 中每一列的所有所述待测样本， 共得到 n 个列混合样本。 0012 （c） 分别检测步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列混合样本中是否存在所述 目的 DNA 的等价遗传标记物 ； 0013 所述等价遗传标记物是与所述目的 DNA 连锁的遗传标记物， 所述等价遗传标记物 的存在指示所述目的 DNA 的存在。所述等价遗传标记物可以是单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism， 缩写 SNP） 、 简单重复序列 （SSR） 标记等 ； 在本发明的一个实施 例中，。
17、 所述等价遗传标记物具体为 SSR 标记。 0014 （d） 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所有所述行混合样 本对应的混合前所述待测样本均进行标记 ； 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗 传标记物的所有所述列混合样本对应的混合前所述待测样本均进行标记 ； 0015 （e） 根据步骤 （d） 的标记结果， 按照如下方法确定所述 N 个待测样本是否含有目的 DNA ： 0016 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述行混合样本有且只 有 1 个， 和 / 或经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述。
18、列混合样本有 且只有 1 个， 则步骤 （d） 中标记过两次的所述待测样本含有所述目的 DNA 或候选含有所述 目的 DNA， 其余所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 0017 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述行混合样本有 2 个 以上， 同时经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述列混合样本有 2 个 以上， 则将步骤 （d） 中标记过两次的所述待测样本取出， 分别检测是否存在所述目的 DNA 的 等价遗传标记物 （可进行 PCR 扩增， 也可测序鉴定） ， 存在所述目的DNA 的等价遗传标记物的。
19、 所述待测样本含有所述目的 DNA 或候选含有所述目的 DNA， 其余所有所述待测样本不含有 所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 0018 若所有所述行混合样本经步骤 （c） 检测不存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物， 和 / 或若所有所述列混合样本经步骤 （c） 检测不存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物， 则 说 明 书 CN 102888462 A 5 3/8 页 6 所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 0019 其中， m 和 n 均为 3 以上的整数， N 等于 mn。 0020 在上述方法步骤 （c） 中， 所述分别检测步。
20、骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列 混合样本中是否存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的方法具体可为 ： 以所述步骤 （b） 所 得的 m 个行混合样本和 n 个列混合样本分别作为模板， 采用扩增所述目的 DNA 的等价遗传 标记物的特异性引物进行 PCR 扩增， 根据扩增产物确定步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列混合样本中是否存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物。 0021 上述方法特别适用于在若干所述待测样本中检测低频出现的所述目的 DNA， 如在 培育植物新品种中， 构建BC2F2群体后， 利用SSR标记检测低频率出现的外源染色体小片段 或基因。所述低频。
21、率为出现频率低于 5%。 0022 在本发明的一个实施例中， 所述待测样本具体为以棉花品种新陆早 48 号为母本， 以海岛棉染色体片段置换系 CSSL-120 为父本， 获得 F1 代后， 以棉花品种新陆早 48 号为 轮回亲本， 获得的 BC2F2 群体的基因组 DNA ； 所述目的 DNA 为所述海岛棉染色体片段置换 系 CSSL-120 中片段编号为 IL024-D2-6 的染色体片段 ； 所述扩增所述目的 DNA 的等价遗传 标记物的特异性引物为扩增所述片段编号为 IL024-D2-6 的染色体小片段的 SSR 标记 NAU2987-320 或 BNL3145-290 的特异性引物， 。
22、更加具体的， 扩增所述 NAU2987-320 的特异性 引物为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA， 扩增所述BNL3145-290的特异性引物 为序列表中序列 3 和序列 4 的两条单链 DNA。 0023 在本发明的一个实施例中， 所述 m 和 n 均为 8， 所述 N 为 64。 0024 在本发明的一个实施例中， 检测结果显示所述片段编号为 IL024-D2-6 的染色体 小片段在 64 份所述待测样本中出现的频率为 2/64。 0025 本发明所提供的一种检测待测样本中是否含有目的 DNA 的方法， 也可包括如下步 骤 ： 0026 （a） 将 N 个待测样本按照如式 （1）。
23、 所示的矩阵 A 进行排列 ； 0027 0028 式 （1） 0029 （b） 混合位于所述矩阵 A 中每一行的所有所述待测样本， 共得到 m 个行混合样本 ； 混合位于所述矩阵 A 中每一列的所有所述待测样本， 共得到 n 个列混合样本 ； 0030 （c） 分别检测步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列混合样本中是否存在所述 目的 DNA ； 0031 （d） 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所有所述行混合样本对应的混合前所 述待测样本均进行标记 ； 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所有所述列混合样本对应 的混合前所述待测样本均进行标记 ； 003。
24、2 （e） 根据步骤 （d） 的标记结果， 按照如下方法确定所述 N 个待测样本是否含有目的 DNA ： 说 明 书 CN 102888462 A 6 4/8 页 7 0033 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所述行混合样本有且只有 1 个， 和 / 或经 步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所述列混合样本有且只有 1 个， 则步骤 （d） 中标记过两次 的所述待测样本含有所述目的 DNA 或候选含有所述目的 DNA， 其余所有所述待测样本不含 有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 0034 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所述行混合样本有 2。
25、 个以上， 同时经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的所述列混合样本有 2 个以上， 则将步骤 （d） 中标记过两次的所 述待测样本取出， 分别检测是否存在所述目的 DNA（可进行 PCR 扩增， 也可测序鉴定） ， 存在 所述目的DNA的所述待测样本含有所述目的DNA或候选含有所述目的DNA， 其余所有所述待 测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 0035 若所有所述行混合样本经步骤 （c） 检测均不存在所述目的 DNA， 和 / 或若所有所述 列混合样本经步骤 （c） 检测均不存在所述目的 DNA， 则所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述。
26、目的 DNA ； 0036 其中， m 和 n 均为 3 以上的整数， N 等于 mn。 0037 在上述方法步骤 （c） 中， 所述分别检测步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列混 合样本中是否存在所述目的 DNA 的方法具体可为 ： 以所述步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本 和 n 个列混合样本分别作为模板， 采用扩增所述目的 DNA 的特异性引物进行 PCR 扩增， 根据 扩增产物确定步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列混合样本中是否存在所述目的 DNA。 0038 上述方法特别适用于在若干所述待测样本中检测低频出现的所述目的 DNA。所述 低频率为出现频率。
27、低于 5%。 0039 在本发明的一个实施例中， 所述待测样本具体为以棉花品种新陆早 48 号为母本， 以海岛棉染色体片段置换系 CSSL-120 为父本， 获得 F1 代后， 以棉花品种新陆早 48 号为轮 回亲本， 获得的 BC2F2 群体的基因组 DNA ； 所述目的 DNA 为所述海岛棉染色体片段置换系 CSSL-120 中片段编号为 IL024-D2-6 的染色体小片段。 0040 本发明所提供的一种检测待测样本中是否含有目的 DNA 的方法， 采用了将待测样 本进行矩阵排列混合的方式， 用于植物遗传背景中外源染色体片段或基因的追踪和鉴定， 可节约实验成本， 提高工作效率、 加快实验。
28、进程。在本发明中， 64 个单株 DNA 混合成 16 个 样品， 直接检测出含有外源基因的植株。以 1000 个单株群体中只直接进行外源染色体片 段或基因的鉴定， 需要 1000 个单株 DNA 样品 60 元 /DNA 样品 =6.0 万元， 而采用矩阵排 列混合 DNA 样品的方法， 1000 个单株的检测成本仅为 ： 1000 个 DNA 样品 60 元 /DNA 样 品 16/64=1.5 万元， 因此可节约 4.5 万元， 同时可加快实验进程。 附图说明 0041 图 1 为 64 个待测样本 （单株基因组 DNA） 的排列及混合处理情况。 0042 图 2 为引物 NAU2987。
29、 在所有 DNA 样品的扩增情况。其中， 泳道 M 为 DNA 分子量标 准， 从上到下分别为 750bp、 500bp、 250bp ； 泳道 1-64 为编号 1-64 单株的基因组 DNA ； 泳道 P1 为母本新陆早 48 号的基因组 DNA ； 泳道 P2 为父本染色体片段置换系 CSSL-120 的基因组 DNA。 0043 图3为引物BNL3145在所有DNA样品的扩增情况。 其中， 泳道M为DNA分子量标准， 从上到下分别为1000bp、 750bp、 500bp、 250bp ； 泳道1-64为编号1-64单株的基因组DNA ； 泳 说 明 书 CN 102888462 A 。
30、7 5/8 页 8 道 P1 为母本新陆早 48 号的基因组 DNA ； 泳道 P2 为父本染色体片段置换系 CSSL-120 的基 因组 DNA。 0044 图 4 为确定外源染色体片段或基因快速检测方法的图解。 具体实施方式 0045 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0046 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0047 棉花 （Gossypium hirsutum L.） 品种新陆早 48 号 ： 由新疆惠远农业科技发展有限 公司提供 ； 0048 海岛棉染色体片段置换系 CSSL-120 ： 由南京农业大学作物遗传与种质。
31、创新国 家重点实验室张天真教授惠赠。参考文献 ： 王鹏， 丁业掌， 陆琼娴， 郭旺珍， 张天真 . 陆地 棉遗传标准系 TM-1 背景的海岛棉染色体片段置换系的培育 . 科学通报， 2008， 53（9） ： 1065-1069. 该海岛棉染色体片段置换系经检测为高纤维长度。 0049 实施例 1、 利用 SSR 标记快速检测低频外源染色体小片段或基因 0050 本实施例利用 SSR 标记快速检测低频外源染色体小片段或基因的方法具体包括 如下步骤 ： 0051 （a） 将 N 个待测样本按照如式 （1） 所示的矩阵 A 进行排列 ； 0052 0053 式 （1） 0054 （b） 混合位于所。
32、述矩阵 A 中每一行的所有所述待测样本， 共得到 m 个行混合样本 ； 混合位于所述矩阵 A 中每一列的所有所述待测样本， 共得到 n 个列混合样本 ； 0055 （c） 分别检测步骤 （b） 所得的 m 个行混合样本和 n 个列混合样本中是否存在所述 目的 DNA 的等价遗传标记物 （如 SSR 标记） ； 0056 （d） 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所有所述行混合样 本对应的混合前所述待测样本均进行标记 ； 将经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗 传标记物的所有所述列混合样本对应的混合前所述待测样本均进行标记 ； 0057 （e） 根据步骤。
33、 （d） 的标记结果， 按照如下方法确定所述 N 个待测样本是否含有目的 DNA ： 0058 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述行混合样本有且只 有 1 个， 和 / 或经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述列混合样本有 且只有 1 个， 则步骤 （d） 中标记过两次的所述待测样本含有所述目的 DNA 或候选含有所述 目的 DNA， 其余所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 0059 若经步骤 （c） 检测存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述行混合样本有 2 个 以上， 同时经步骤 （c） 。
34、检测存在所述目的DNA的等价遗传标记物的所述列混合样本有2个以 上， 则将步骤 （d） 中标记过两次的所述待测样本取出， 分别检测是否存在所述目的 DNA 的等 说 明 书 CN 102888462 A 8 6/8 页 9 价遗传标记物， 存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物的所述待测样本含有所述目的 DNA 或 候选含有所述目的 DNA， 其余所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目 的 DNA ； 0060 若所有所述行混合样本经步骤 （c） 检测不存在所述目的 DNA 的等价遗传标记物， 和 / 或若所有所述列混合样本经步骤 （c） 检测不存在所述目的 DNA 的等价。
35、遗传标记物， 则 所有所述待测样本不含有所述目的 DNA 或候选不含有所述目的 DNA ； 0061 其中， m 和 n 均为 3 以上的整数， N 等于 mn。 0062 一、 待测样本及混合样本的获得 0063 1、 BC2F2 群体的构建 0064 本实施例以棉花 （Gossypium hirsutum L.） 品种新陆早 48 号为母本， 高纤维长度 的海岛棉染色体片段置换系 CSSL-120（片段编号为 IL024-D2-6， 鉴定该染色体片段标记为 NAU2987-320 和 BNL3145-290） 为父本， 进行杂交获得 F1 代， 以新陆早 48 号为轮回亲本， 获 得由 1。
36、47 株构成 BC2F2 群体。 0065 2、 待测样本及混合样本的获得 0066 提取步骤一获得的 BC2F2 群体各植株的基因组 DNA， 从中随机选择 64 个单株的基 因组 DNA 作为待测样本， 依次编号为 1-64， 将其按照如图 1 所示方式进行排列， 用排枪吸取 各基因组 DNA 5-10l， 分别按行混合单株基因组 DNA， 64 个待测样本混合形成 8 个行混合 样本， 记为 A-H ； 按列混合单株基因组 DNA， 64 个待测样本混合形成 8 个列混合样本， 记为 a-h。 0067 二、 PCR 扩增目的 DNA 0068 分别以步骤二中编号为1-64单株的基因组D。
37、NA、 16个DNA混合样本 （8个行混合样 本和8个列混合样本） 、 母本新陆早48号的基因组DNA、 父本染色体片段置换系CSSL-120的 基因组 DNA 为模版， 分别以扩增 NAU2987-320 标记的特异性引物 （简称为 NAU2987 引物） 、 扩 增 BNL3145-290 标记的特异性引物 （简称为 BNL3145 引物） ， 进行 PCR 扩增， 从而鉴定各待测 样本所对应的植株是否含有外源海岛棉染色体片段 IL024-D2-6。其中， 扩增 NAU2987-320 标记的特异性引物为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA、 扩增BNL3145-290标记 的特异性。
38、引物为序列表中序列 3 和序列 4 所示的两条单链 DNA。 0069 NAU2987 引物 ： 0070 5 -GGAAAAGGCTGCTACAAGTG-3 （序列 1） ； 0071 5 -CGAAGGATGTAACCGATACC-3 （序列 2） ； 0072 BNL3145 引物 ： 0073 5 -AACGAGGGAAAACGGAGAGT-3 （序列 3） ； 0074 5 -CAAAACGACGCCATTTAGGT-3 （序列 4） ； 0075 PCR 反应体系 （20l） 分为两类 ： 0076 （1） 编号为 1-64 单株的基因组 DNA、 母本新陆早 48 号的基因组 D。
39、NA， 以及父本染 色体片段置换系 CSSL-120 的 DNA 的 PCR 反应体系如下 ： 10PCR buffer 2.0l， dNTPs 0.2mmol/L， Taq DNA 聚合酶 2U， SSR 引物 （NAU2987 引物或 BNL3145 引物）上下游引物各 0.3mol/L， 模版 DNA20ng。 0077 （2） 16 个 DNA 混合样本 （8 个行混合样本和 8 个列混合样本） 的 PCR 反应体系如 说 明 书 CN 102888462 A 9 7/8 页 10 下 ： 10PCR buffer 2.0l， dNTPs 0.2mmol/L， Taq DNA 聚合酶 。
40、2U， SSR 引物 （NAU2987 引 物或 BNL3145 引物） 上下游引物各 0.3mol/L， 模版 DNA 60ng。 0078 反应程序均为 ： 95预变性 2min， 一个循环 ； 94变性 30s， 57退火 45s， 72延 伸 1min， 共 35 个循环 ； 72延伸 7min， 一个循环 ； 4保存待用。 0079 电泳与银染检测 ： PCR 扩增产物采用 6% 变性聚丙烯酞胺凝胶电泳， 恒电压 180V 电 泳 45 60min。在固定液 （10% 体积含量的乙醇， 0.5% 体积含量的冰醋酸） 固定 10min ； 利 用蒸馏水快速漂洗 2 次 ； 然后 0.2。
41、%（0.2g/100ml） AgNO3溶液染色 12min ； 蒸馏水快速漂洗 2 次 ； 显影液 （1.5%(1.5g/100ml)NaOH， 0.5% 体积含量的甲醛） 显影 ； 在固定液 （10% 体积含 量的乙醇， 0.5% 体积含量的冰醋酸） 定影， 然后用蒸馏水漂洗 1-2 次。用数码相机照相， 并 统计带型。 0080 三、 结果与分析 0081 1、 单株 DNA 样品扩增 0082 SSR 引物 NAU2987 在单株 1-64、 棉花品种新陆早 48 号、 染色体片段置换系 CSSL-120 的 DNA 样品扩增情况见图 2 （泳道 1-64， 及 P1 和 P2） ， 引。
42、物 BNL3145 在单株 1-64、 新陆早 48 号、 置换系 CSSL-120DNA 样品扩增情况见图 3（泳道 1-64， 及 P1 和 P2） 。如图所 示， 引物 NAU2987 和 BNL3145 均在样品 9、 30 及染色体片段置换系 CSSL-120 中扩增海岛棉 染色体片段 IL024-D2-6 的特异带 （引物 NAU2987 扩增的海岛棉染色体片段 IL024-D2-6 的 特异带大小约为 320bp， 引物 BNL3145 扩增的海岛棉染色体片段 IL024-D2-6 的特异带大小 约为 290bp） ， 而其余 62 个单株和棉花品种新陆早 48 号中无海岛棉染色。
43、体片段 IL024-D2-6 的特异带出现。 0083 2、 混合 DNA 样品扩增 0084 SSR引物NAU2987和BNL3145在行混合样本A-H， 列混合样本a-h， 共16个DNA样品 扩增情况分别见图 2（泳道 A-H 及 a-h） 和图 3（泳道 A-H 及 a-h） 。扩增发现行混合样本 B、 D， 以及列混合样本a、 f中上述两对引物均扩增海岛棉染色体片段IL024-D2-6的特异带 （引 物 NAU2987 扩增的海岛棉染色体片段 IL024-D2-6 的特异带大小约为 320bp， 引物 BNL3145 扩增的海岛棉染色体片段 IL024-D2-6 的特异带大小约为 2。
44、90bp） ， 而其余 14 个混合样本中 无海岛棉染色体片段 IL024-D2-6 的特异带出现。 0085 3、 分析 0086 将在如图 1 所示的 64 个单株的基因 DNA 排列图中， 将能扩增出海岛棉染色体片段 IL024-D2-6特异带DNA样品的行、 列分别画直线 （即对PCR扩增得到阳性结果的所有所述行 混合样本对应的混合前所述待测样本均进行标记， 同时对 PCR 扩增得到阳性结果的所有所 述列混合样本对应的混合前所述待测样本均进行标记） ， 4 条直线相交获得 4 个交点 （即 PCR 扩增得到阳性结果的所述行混合样本有 2 个， 同时 PCR 扩增得到阳性结果的所述列混合。
45、样 本也有 2 个） ， 编号分别为 9、 14、 25 和 30（即标记过两次的所述待测样本） （如图 4 所示） 。 将编号为 9、 14、 25 和 30 的单株基因组 DNA 样本参照上述步骤二中 （1） 所述的 PCR 反应体系 进行逐个PCR， 分析发现样品1-64中DNA样品9、 30能扩增出海岛棉染色体片段IL024-D2-6 的特异带， 而 DNA 样品 14、 25 未能扩增出相应条带。以上结果表明， 编号为 1-64 的 64 个单 株中， 编号为9和30两个单株携带有外源染色体片段IL024-D2-6， 而其余的62个单株没有 携带外源染色体片段 IL024-D2-6。。
46、 说 明 书 CN 102888462 A 10 8/8 页 11 0087 四、 成本计算 0088 本发明中 64 个单株 DNA 混合成 16 个样品， 直接检测出含有外源基因的植株。以 由 1000 个单株组成的群体为例， 按照每个 DNA 样品的检测费用为 60 元计算， 若单个样本直 接进行外源染色体片段或基因的鉴定， 则需要1000个单株DNA样品60元/DNA样品=6.0 万元。而采用本发明矩阵排列混合 DNA 样品的方法， 1000 个单株的检测成本仅为 ： 1000 个 DNA 样品 60 元 /DNA 样品 16/64=1.5 万元。因此可节约 6.0 万元 -1.5 万元 =4.5 万元， 同时可加快实验进程。 说 明 书 CN 102888462 A 11 1/2 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 102888462 A 12 2/2 页 13 序 列 表 CN 102888462 A 13 1/2 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102888462 A 14 2/2 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102888462 A 15 。