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1、(10)申请公布号 CN 102899289 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102899289 A *CN102899289A* (21)申请号 201210407966.8 (22)申请日 2012.10.24 C12N 5/078(2010.01) (71)申请人 扬州维克斯生物科技有限公司 地址 225101 江苏省扬州市开发区吴州东路 198 号 A1 栋 4 层 101 室 (72)发明人 胡伟明 (74)专利代理机构 扬州市锦江专利事务所 32106 代理人 江平 (54) 发明名称 一种超级 CIK 杀伤细胞的制备方法 (57) 摘要 一种超级 CIK 杀伤。
2、细胞的制备方法， 属于医 疗技术领域， 本发明采用在体外扩增肿瘤杀伤细 胞达到所需数量后， 体外加载 CTLA4 抗体以覆盖 所有细胞表面的 CTLA4 分子， 加载完毕后清洗掉 所有多余的 CTLA4 抗体。这样制备的高活性肿瘤 杀伤细胞， 经过静脉回输后 CTLA4 抗体既发挥抗 体药物的疗效， 又避免大剂量静脉注射 CTLA4 抗 体导致严重的毒副作用， 能够持续对肿瘤细胞造 成杀伤， 最终能够达到对肿瘤组织长效性的抑制 甚至清除的目的。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 。
3、页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种超级 CIK 杀伤细胞的制备方法， 其特征在于 ： 先在体外扩增肿瘤杀伤细胞， 并加 载 CTLA4 抗体， 然后清洗掉多余的 CTLA4 抗体， 即形成超级 CIK 杀伤细胞。 2. 根据权利要求 1 所述超级 CIK 杀伤细胞的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1） 在 PBMC 细胞中加入， 在 37 ， 5 CO2 孵箱中培养 ； 2） 24 小时后加入 CD3McAb 和 IL-2， 继续在 37、 5 CO2 孵箱中培养 ； 3） 随后每三天更换新培养液， 并添加 IL-2 ； 4） 第九天更换液后， 加入载有肿瘤抗。
4、原的树突细胞， 并加入 CTLA4 抗体 ； 5） 在第 12 天收集超级 CIK 杀伤细胞时， 加入 CTLA4 抗体， 在室温下静置 30 分钟， 随后 用 PBS 洗涤去除游离的 CTLA4 抗体， 最后悬浮于生理盐水中。 3. 根据权利要求 1 所述超级 CIK 杀伤细胞的制备方法， 其特征在于在所述步骤 4） 中， 所述加入的 CTLA4 抗体使 CTLA4 抗体的终浓度到达 1ug/ml。 权 利 要 求 书 CN 102899289 A 2 1/4 页 3 一种超级 CIK 杀伤细胞的制备方法 技术领域 0001 本发明属于医疗技术领域， 特别是肿瘤生物技术中用于治疗的杀伤细胞的。
5、制备方 法。 背景技术 0002 肿瘤生物治疗是继手术、 放疗、 化疗之后的第四种治疗方法。 细胞因子诱导的杀伤 细胞 (cytokine-induced killer cells , CIK) 治疗是目前最有效的肿瘤生物治疗手段。 CIK 细胞是一种体外增殖能力强、 杀瘤活性高及对多重耐药肿瘤细胞较敏感的广谱抗瘤免 疫活性细胞。 0003 目前国内外制备的用于肿瘤免疫治疗的 CIK 细胞是体外扩增出的以 CD3+ CD56+、 CD3+ CD8+为主的异质性细胞群。 该细胞群是在多种细胞因子如IL2、 IFN-及单克隆抗体 (CD3McAb) 的刺激下， 由从外周血、 骨髓或脐血中分离出来的。
6、单个核细胞在体外培养扩增而 成， 具有广泛的抗肿瘤活性(Schmidt-Wolf , Negrin, Kiem, et al. : J Exp Med, 1991, 174:139-149） 。 0004 近年来大量关于CIK细胞的动物实验和临床研究证实了CIK细胞用于肿瘤治疗的 前景广阔。到目前为止， CIK 细胞用于治疗肝癌、 食管癌、 乳腺癌、 胃癌、 结肠癌、 肾细胞癌、 肺癌以及各种类型白血病等取得初步成效。但是， CIK 细胞治疗的临床数据也显示出了它 明显的局限性， 如它治疗早期小型肿瘤效果好于晚期巨型肿瘤 ； 它的中短期效果 （无癌存活 期, cancer-free survi。
7、val） 好于对照组， 但长期效果 （最终存活期, ultimate survival） 却与对照组区别不明显。究其原因， 肿瘤组织的免疫逃逸性对 CIK 细胞活力的削弱是其中 主要原因之一。 0005 肿瘤组织的免疫逃逸性就是生物体为避免免疫细胞攻击的一种机制。免疫 T 细胞 包括 CIK 细胞， 在其细胞表面表达着一类受体， 它们的作用是一但与其相应的配体结合， 就 能产生一系列信号来抑制或削弱T细胞的活力。 生物体通过这一机制来控制T细胞的活力， 甚至减少其数量以避免它们攻击自身细胞， 防止产生自身免疫反应。众所周知的细胞表面 CTLA4 分子就是这类受体。在免疫 T 细胞被激活、 扩增。
8、的各个步骤中， 一旦遭遇到表达着辅 助激活配体 （B7-1,CD80， CD86） 的树突细胞或肿瘤细胞时， 激活的 T 细胞通过提高 CTLA4 分 子的表达， 使之替代 CD28 与 B7-1 结合， 从而降低 T 细胞的活性。 CTLA4 的拮抗型抗体能 阻挡 CLTLA4 分子与 B7 配体的结合， 从而导致了增强的 T 细胞活力和更强力的抗肿瘤活力。 CTLA4 的拮抗型抗体因而也能够损伤正常组织对自体抗原的免疫耐受， 刺激病人体内对皮 肤， 下垂体及小肠的免疫攻击， 造成炎症和毒性。 0006 肿瘤组织逃避杀伤细胞攻击的方式之一就是升高其细胞表面 CTLA4 配 体， B7-1 的。
9、 表 达 量。 在 肿 瘤 的 微 环 境 内， 一 旦 杀 伤 细 胞 上 的 CTLA4 与 肿 瘤 细 胞 上的 B7-1 结合， 就会使杀伤细胞产生一种能量耗尽的表象， 其特征为活力因子 减少， 细胞数量减少， 肿瘤细胞因而得到了保护。 说 明 书 CN 102899289 A 3 2/4 页 4 0007 利用拮抗型抗体来防止或破坏CTLA4与其配体B7的结合， 在理论上和实验中都已 被证明能增强杀伤型 T 细胞的活力， 也在动物和临床试验中证明能有效地提高免疫系统对 肿瘤生长的抑制作用， 甚至能引起肿瘤的坏死。但是直接静脉注射 CTLA4 抗体， 在达到抗肿 瘤的剂量水平上也引起了。
10、非常严重的自身免疫反应(Hodi, O Day et al. :N Engl J Med, 2010,363:711-723） 。 虽然有些副反应可以用大剂量的激素药物来控制， 但有些副反应却是 致命的。而所有这些自身免疫反应是由这类抗体药的根本药理决定的。系统给药， 不仅激 活了肿瘤组织里的T细胞， 也大大激活了全身血液循环中和各器官内T细胞， 其毒副作用也 非常严重。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种制备超级杀伤细胞的方法， 在体外加载 CTLA4 抗体以覆 盖所有细胞表面的 CTLA4 分子， 提高杀伤细胞的杀瘤活性， 降低 CTLA4 抗体的毒副作用。 0009 本发明技术方。
11、案是 ： 先在体外扩增肿瘤杀伤细胞， 并加载 CTLA4 抗体， 然后清洗掉 多余的 CTLA4 抗体， 即形成超级 CIK 杀伤细胞。 0010 本发明采用在体外扩增肿瘤杀伤细胞达到所需数量后， 体外加载 CTLA4 抗体以覆 盖所有细胞表面的 CTLA4 分子， 加载完毕后清洗掉所有多余的 CTLA4 抗体。这样制备的高 活性肿瘤杀伤细胞， 经过静脉回输后 CTLA4 抗体既发挥抗体药物的疗效， 又避免大剂量静 脉注射 CTLA4 抗体导致严重的毒副作用。 0011 本发明方法制成的超级杀伤 CIK 细胞， 一次静脉回输的细胞所需 CTLA4 抗体数量 仅是直接静脉注射用 CTLA4 抗体。
12、剂量的 1%， 而且静脉回输时的杀伤细胞将没有自由抗体去 激活体内 T 细胞， 由此大大减低了 CTLA4 抗体可能引起的自身免疫反应的副作用 ； 同时被 CTLA4 抗体覆盖的杀伤细胞将不会与 B7-1 结合， 不会被肿瘤微环境灭活， 避免肿瘤组织的 免疫逃逸性， 从而能够持续对肿瘤细胞造成杀伤， 最终能够达到对肿瘤组织长效性的抑制 甚至清除的目的。 0012 本发明具体包括以下步骤 ： 1） 在 PBMC 细胞中加入， 在 37 ， 5 CO2 孵箱中培养 ； 2） 24 小时后加入 CD3McAb 和 IL-2， 继续在 37， 5 CO2 孵箱中培养 ； 3） 随后每三天更换新培养液，。
13、 并添加 IL-2 ； 4） 第九天更换液后， 加入载有肿瘤抗原的树突细胞， 并加入 CTLA4 抗体 ； 5） 在第 12 天收集超级 CIK 杀伤细胞时， 加入 CTLA4 抗体， 在室温下静置 30 分钟， 随后 用 PBS 洗涤去除游离的 CTLA4 抗体， 最后悬浮于生理盐水中。 0013 在所述步骤 4） 中， 所述加入的 CTLA4 抗体使 CTLA4 抗体的终浓度到达 1ug/ml。 0014 本发明的有益效果是 ： 本发明方法制成超级杀伤细胞的杀伤活力可以随着 CTLA4 抗体加载而提高， 而且加载量只需直接静脉注射用 CTLA4 抗体剂量的 1%， 而且回输时的杀 伤细胞将。
14、没有游离的 CTLA4 抗体去激活体内 T 细胞， 由此大大减低了 CTLA4 抗体使用时引 起的自身免疫反应的副作用。 附图说明 说 明 书 CN 102899289 A 4 3/4 页 5 0015 图 1 为超级 CIK 杀伤细胞制备方法的流程图。 0016 图 2 为超级 CIK 细胞生长活力检测结果图。 0017 图 3 为超级 CIK 细胞杀伤活力检测结果图。 具体实施方式 0018 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商 所建议的条件。 0019 一、 CIK 细胞的制备 1、 本发明的超级 CIK 细胞的制备， 如图 1 所示 ： （1） 外。
15、周血单个核细胞 （PBMC） 的采集制备 用血细胞分离机在无菌条件下采集肿瘤患者抗凝血， 比重为 1.077 的淋巴细胞分离液 Ficoll-Paque Plus 与血按 1:2 加入离心管中， 离心 1500rpm/30min， 取界面层细胞， PBS 洗 涤 2 次， 悬浮于无血清 GT-T561 培养基中， 调整细胞浓度 1106 细胞 /mL。 0020 （2） 制备超级 CIK 杀伤细胞 在当日制备的PBMC细胞中， 加入， 在37 ， 5 CO2 孵箱中培 养。 0021 24 小时后加入 CD3McAb(50 ng m1)， IL-2(300 u m1)， 继续在 37， 5 C。
16、O2 孵箱中培养。 0022 随后每三天更换新培养液， 加 IL-2(300 u m1)。 0023 第九天更换液后， 加入 10% 的载有肿瘤抗原的树突细胞， 并加入 CTLA4 抗体 （ipilimumab， 百时美施贵宝Bristol-Myers Squibb生产） 使CTLA4抗体的终浓度到达1ug/ ml。 0024 在第 12 天收集超级 CIK 杀伤细胞时， 加入 CTLA4 抗体 （1ug/ml） ， 在室温下静置 30 分钟， 随后用 PBS 洗涤 2 次以去除游离的 CTLA4 抗体， 最后悬浮 CIK 于生理盐水中， 以备静 脉回输。 0025 2、 对照组 CIK 杀伤。
17、细胞的制备 对照组制备 CIK 杀伤细胞时， 除不加 CTLA4 抗体外， 其他处理方法同上。 0026 二、 超级 CIK 杀伤细胞和对照组 CIK 杀伤细胞各指标的检测 1、 无菌试验和热源检测 超级 CIK 杀伤细胞和对照组 CIK 细胞的无菌试验和热源检测均为阴性。 0027 2、 表型检测 用流式细胞仪检测细胞表型， 表型检测结果， 采用以上方法制备的超级 CIK 杀伤细胞 和对照组 CIK 细胞中， T 淋巴细胞的数量和各亚群的比例无明显差异。T 淋巴细胞 （CD3+ 细 胞） 占细胞总数的 90% 以上， 其中 T 淋巴细胞中各亚群的比例因血液来源差异有一定变化范 围 ： CD3。
18、+CD56+ 细胞的比例为 40%55%， CD8+ 细胞的比例为 6580%， CD3-CD56+ 细胞的比例 为 2540%。 0028 3、 活细胞技术检测 检测方法为常规台盼兰 （Trypan Blue） 染色， 显微镜观察活细胞数量。 说 明 书 CN 102899289 A 5 4/4 页 6 0029 活细胞技术检测结果 ： 超级 CIK 杀伤细胞和对照组 CIK 细胞中活细胞百分比都大 于 90%， 无明显差异。 0030 4、 超级 CIK 细胞生长活力和杀伤活力检测 采用 MTT 方法检测细胞生长活力。 0031 采用方法检测超级 CIK 细胞杀伤活力。 0032 1） 取。
19、第 12 天生长的超级 CIK 杀伤细胞， 以细胞浓度为 5104 /mL ， 0.1 mL 铺于 96 孔平底板中， 所有样品设 3 个复孔。 PMA（植物血凝素） 500ng/ml 用于激活 CIK 细胞 中 T 细胞， B7-1 重组蛋白 1ug/ml 用于模拟体内肿瘤微环境内的抑制机制来抑制 T 细胞活 力。CTLA4 抗体 （ipilimumab） 按终浓度 1， 10， 100， 1000， 10000ng/ml 加入实验孔， 用于中 和 B7-1 对 T 细胞的抑制作用。 96 孔板放置在 37， 5 CO2 培养中培养 24 小时后， 将培 养吸出 50ul 用于 ELISA 。
20、方法检测浓度 ； 96 孔板继续培养 48 小时后， 每孔加入浓度 为 5mg/ml 的噻唑蓝 （MTT） 0.02ml， 继续培养 4 小时， 每孔加入 0.1ml 二甲亚砜 （DMSO） 后， 在 570nm 处测定吸光率。 0033 2） 超级 CIK 细胞生长活力和杀伤活力检测结果 ： 在模拟体内肿瘤微环境下， 被激 活的 CIK 细胞在接触到 B7-1 时， 其生长活力和杀伤活力分别被抑制到最高活力水平的 30% （如图 2 所示） 和 20%（如图 3 所示） ； 而加入拮抗型 CTLA4 抗体后， 阻断了 B7-1 和 CIK 细胞 表面的CTLA4的结合， 因而解除了CTLA4。
21、信号系统引起的抑制作用， CIK细胞的生长活力 （如 图 2 所示） 和杀伤活力 （如图 3 所示） 都得到恢复， 且活力恢复程度与 CTLA4 抗体的剂量成 正比。CIK 生长活力在 CTLA4 抗体中高剂量 （1-10ug/ml） 下得以完全恢复 （如图 2 所示） ； 其 杀伤活力则在 CTLA4 抗体同等剂量下恢复了 80% 的活力 （如图 3 所示） 。 0034 由此结果可以得出以下结论 ： 常规 CIK 细胞 （无 CTLA4 抗体阻断其抑制信号系统） 在进入肿瘤微环境后， 其活力将受到极大地抑制 ； 相反， 本发明方法制成的超级 CIK 细胞 （被 CTLA4 抗体覆盖并阻断其抑制信号系统） 在进入肿瘤微环境后， 其活力将被完好地保持， 使之能够有效而长效地杀伤肿瘤组织。 说 明 书 CN 102899289 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102899289 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 102899289 A 8 。