一种新型FSH-Fc融合蛋白及其制备方法和用途技术领域
本发明属于人类生殖疾病治疗和辅助生殖领域。本发明涉及促性腺生长激素。更
具体地说,本发明涉及一种新型长效促性腺激素及其制备方法,以及其在辅助生殖中的用
途。
背景技术
促卵泡生成素(Follicle Stimulating Hormone,FSH),是一种由脑垂体前叶嗜碱
性细胞合成并分泌的糖基化蛋白,天然FSH由α亚基和β亚基所组成,其中α亚基与脑垂体分
泌的其他糖蛋白激素如促黄体生成素(LH)、促甲状腺激素(TSH),以及胎盘分泌的促绒毛膜
激素(HCG)中的α亚基相同,而β亚基则具有其特异性,是FSH生物活性的决定因素。已知FSH
的α亚基由92-96个氨基酸组成,β亚基由109-115个氨基酸组成。两个亚基之间通过内部二
硫键维持自身正确的高级结构,此外N-糖基化对形成正确的高级结构也有较大影响。FSH主
要通过β亚基的C端与其受体FSHR相结合,FSH与FSHR结合后产生两种信号作用,一是活化芳
香化酶,另一作用是诱导LH受体生成。内膜细胞在黄体生成素LH(luteotropic hormone,简
称LH)作用下合成19-雄烯二酮或睾酮,它们通过基底膜进入颗粒细胞,活化的芳香化酶把
它们转变为17-β雄二醇。促卵泡生成素与LH在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要
的作用。FSH在女性机体内的生理作用是促使卵泡发育和成熟,引起排卵,抑制卵巢闭锁;与
黄体生成素一起促进雌激素分泌;在男性体内的生理作用是促进生精上皮发育及精子的发
生和成熟。因此,FSH可以单独使用或与LH联合应用治疗不育不孕症。
FSH可以从脑垂体或尿液中分离提取(EP322,438),也可以重组制备(US5,639,
640、US5,156,957、US4,923,805、US4,840,896、EP211,894)。重组人FSH纯度好于提取的
FSH,二者疗效差别不大,不过两种类型的FSH均需连续给药8-10天来刺激女性卵泡发育,每
天至少皮下注射1次FSH给患者带来诸多不便和痛苦。长效重组FSH是解决这些问题的一个
方向。
已有多篇现有技术报道了长效FSH的设计,最初是通过增加FSH的糖基化位点来达
到提高半衰期的目的。专利US5,338,835和US5,585,345中公开了一种改造的FSH-β亚基,其
C-末端谷氨酸与hCG的羧基末端肽(CTP)基团融合。目前该设计相应的产品(E lonva)已于
2010年由德国默克公司开发上市,其具有天然FSH的生物活性,在人体内的半衰期达到69h,
但由于存在免疫原性等问题,临床给药方案改为第一次给药一周,然后再连续给药3天,也
就是说,长效FSH的设计仍面临着很大的难题,亟待改进。
将FSH与白蛋白或IgG的Fc片段融合,是用来提高活性蛋白体内半衰期的常用手
段。专利US0,186,662公布了通过构建FSH-Fc融合蛋白同二聚体、异二聚体,在大鼠体内半
衰期延长至60小时,同时比活性也有所提高。但是该设计中制备重组FSH时,很难将副产物
FSHα2或FSHβ2的同二聚体,与目标产物FSHαβ异二聚体彻底分离,除非额外引入如HIS等纯
化标签,而纯化标签的引入,又会限制其应用临床治疗。专利CN201210476665公开了一种仅
将FSH-β亚基与Fc融合的设计,产生的异二聚体FSH在大鼠体内的半衰期为30-40h,在该设
计中制备重组FSH时,产物有两种,一种是分子形式为FSHα-FSHβ-Fc2的异二聚体,另一种是
(FSHα-FSHβ-Fc)2的同二聚体,因此在构建重组表达细胞株和纯化产品时,同样需要面对同
二聚体的副产物干扰,使药物的质量控制面临更多挑战。
本发明旨在提供改进的FSH-Fc融合蛋白及其制备方法,以获得保有活性、质量均
一的长效异二聚体FSH-Fc融合蛋白。
发明内容
本发明的发明思路和原理为:参考天然FSH结构中α和β亚基之间通过非共价紧密
连接形成异二聚体的特点,将FSH的α和β亚基分别与两种不同的单链Fc片段的N端融合。所
述不同的单链Fc片段,是通过对天然Fc双链结合面上的某些氨基酸,进行不同的定点突变
所生成的,通过突变,使其中一条Fc链上CH3结构域中的氨基酸突变为带小侧链的氨基酸,
形成“锁式(holes)”结构,将另一条Fc链上与之相对应的氨基酸突变为带大侧链的氨基酸,
形成“扣式(knobs)”结构。因空间构象的对应关系,含有“扣式”的CH3结构域与含有“锁式”
的CH3结构域之间能形成“锁扣(knobs-into-holes”结构”。这种“锁扣”结构促使两条异源
单链Fc片段之间的二聚化作用,使其更倾向于形成异源双链二聚体。因此,本发明中,将FSH
的α亚基直接或者通过链接元件间接融合在“锁式Fc”(hole-Fc)链的N端,同时将FSH的β亚
基直接或者间接通过链接元件融合在“扣式Fc”(Knob-Fc)链的N端。或者反之,将所述FSH的
α亚基直接或者通过链接元件间接融合在“扣式Fc”(Knob-Fc)链的N端,同时将FSH的β亚基
直接或者间接通过链接元件融合在“锁式Fc”(hole-Fc)链的N端。这种融合蛋白的分子设
计,使分子的N-端处于FSHα与β亚基之间的天然二聚化作用之下,而分子的C-端则处于锁扣
式Fc之间的人工二聚化作用之下,并因此形成结构上极为稳定的异源双链二聚体(见图1)。
这种将FSHα、β亚基与不同单链Fc融合的设计,既实现了在保持天然FSH活性的同时,引入Fc
片段以延长FSH半衰期的目标,又克服了使用同源Fc片段所引发的重组FSH-Fc融合蛋白生
产工艺的问题,具有很高的实用价值。
本发明与现有技术(US20050186662和CN201210476665)中的FSH-Fc融合蛋白的最
大区别在于,分别将FSHα和β亚基分别融合于“锁式”和“扣式”Fc链的N端,或者反之。现有技
术中,没有将FSH的α和β亚基间的非共价结合二聚化作用与Fc“锁扣”式二聚化作用结合起
来。本发明的原理一方面基于“knobs-into-holes”的CH3结构设计理念('Knobs-into-
holes'engineering of antibody CH3domains for heavy chain
heterodimerization.Ridgway JB,Presta LG,Carter P.Protein Eng.1996Jul;9(7):
617-21.在此引入作为参考)。“knobs-into-holes”设计在抗体工程中经常用于双特异性抗
体分子设计。具体而言,是把两个针对不同抗原的抗体链,通过CH3的特殊结构组装成异源
二聚体:首先在A抗体重链的CH3结合位点处,将一个或几个较小侧链氨基酸,突变成含有较
大侧链的氨基酸,使其形成“扣式”结构;然后在B抗体重链的CH3结合位点处,反其道而行
之,通过将较大侧链氨基酸突变成较小侧链氨基酸,使其形成“锁式”结构。扣式结构与锁式
结构之间会产生类似“锁扣”的作用,从而促进异二聚体的形成。
通常利用重组表达系统制备双特异性抗体时,直接由抗体A和抗体B基因共转染,
表达产物中自发形成的异源二聚体AB比例不到25%,而通过CH3突变产生的AB异源二聚体
的比例则提高到50%以上。要想进一步提高异源二聚体的比例,可以通过优化转染编码DNA
比例,将瞬时转染细胞获得的异源二聚体比例提高至90%,但在稳定转染细胞中,很难获得
高于50%的异二聚化的双特异性抗体。而工业生产中,通常必须使用稳定表达细胞株来生
产重组抗体。因此,在制备双特异性抗体时,需要在Fab段引入额外的突变以增加异二聚体
的稳定性(Progress in overcoming the chain association issue in bispecific
heterodimeric IgG antibodies.Klein C等,MAbs.2012;4(6):653-63.)。
本发明中,由于FSH-α亚基与FSH-β亚基之间存在天然的非共价紧密结合,二者之
间的特异性相互作用促使αβ异源二聚化。因此,将FSH的α亚基直接或者通过链接元件间接
融合在“锁式Fc”链的N端,同时将FSH的β亚基直接或者间接通过链接元件融合在“扣式Fc”
链的N端;或者反之,将所述FSH的α亚基直接或者通过链接元件间接融合在“扣式Fc”链的N
端,同时将FSH的β亚基直接或者间接通过链接元件融合在“锁式Fc”链的N端,则融合蛋白N
端FSH-α亚基与FSH-β亚基之间、融合蛋白C端“锁”式Fc链和“扣式”Fc链片段之间,均存在稳
定异源双链二聚体结构的分子作用。在这两种共同作用下,异源二聚体FSHα-Fch-FSHβ-Fck
的结构稳定性,远高于仅含有“hole”结构域的同源二聚体(FSHα-Fch)2或(FSHβ-Fch)2。因
此在通过转染细胞制备重组FSH-Fc融合蛋白时,表达产物折叠过程中,更倾向于生成结构
稳定的异源双链二聚体产物,而同源双链二聚体副产物的比例接近0%,从而大大提高了表
达产物的均一性。
一方面,本发明提供了一种长效FSH融合蛋白,所述的FSH融合蛋白包括两条不同
的肽链,其中一条为FSHα亚基直接或者通过链接元件间接连接在锁式Fc链(Fch)N端形成的
肽链FSHα-Fch,另一条为FSH的β亚基直接或者通过链接元件间接连接在扣式Fc链(Fck)N端
形成的FSHβ-Fck。两条肽链,即FSHα-Fch和FSHβ-Fck,在FSHα亚基与FSHβ亚基之间的非共价
结合作用、以及锁式Fc链和扣式Fc链CH 3上的锁扣结构之间的双重作用下,折叠成稳定的
FSHα-Fch-FSHβ-Fck形式的异二聚体。
或者反之,还可以是在本发明所述的长效FSH融合蛋白中,其中一条为所述FSHα亚
基直接或者通过链接元件间接连接在扣式Fc链(Fck)N端形成的肽链FSHα-Fck,另一条为
FSH的β亚基直接或者通过链接元件间接连接在锁式Fc(Fch)片段N端形成的肽链FSHβ-Fch。
同样在上述非共价结合作用和锁扣式结构双重作用下形成另一种稳定形式的异二聚体FSH
α-Fck-FSHβ-Fch。
本发明中的FSH为哺乳动物FSH,优选为人FSH。
本发明所述锁式Fc链具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。或者所述锁式Fc链包
含在SEQ ID NO:1上缺失、添加或取代1、2或3个残基得到的氨基酸序列。
本发明所述扣式Fc链具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。或者所述扣式Fc链包
含在SEQ ID NO:2上缺失、添加或取代1、2或3个残基得到的氨基酸序列。
本发明所述的肽链FSHα-Fch具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。或者在SEQ ID
NO:3上缺失、添加或取代1、2或3个残基得到的氨基酸序列。
本发明所述肽链FSHβ-Fck具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或者在SEQ ID NO:4
上缺失、添加或取代1、2或3个残基得到的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方案中,所述长效FSH融合蛋白包括两条不同的肽链FSH
α-Fch和FSHβ-Fck,其中所述FSHα-Fch具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列,所述FSHβ-Fck具
有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
本发明还提供了一种载体,该载体含有编码肽链FSHα-Fch的cDNA。在本发明的一
个具体实施方案中,所述肽链FSHα-Fch具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
本发明还提供了一种载体,该载体含有编码肽链FSHα-Fck的cDNA。在本发明的一
个具体实施方案中,所述肽链FSHβ-Fck具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
本发明还提供了一种载体,该载体含有上述编码SEQ ID NO.3的cDNA和编码SEQ
ID NO.4的cDNA。通过在哺乳动物细胞,如NS0细胞、CHO细胞、HEK293细胞等中表达这种FSH
融合蛋白,本发明实现了在保留FSH生物活性的前提下,延长了FSH的体内半衰期的目标,并
且表达产物纯度更高、易于制备,其生产工艺更具可行性,进而提供了一种可减少给药频次
却仍能发挥FSH在生殖相关疾病中治疗作用的方法。
另一方面,本发明提供了所述长效FSH融合蛋白在在制备用于治疗多囊卵巢综合
症或其他不排卵疾病或病症的药物中的用途。
另一方面,本发明提供了所述的长效FSH融合蛋白在制备用于辅助生殖技术中的
促超排卵中的用途。
另一方面,本发明提供了一种制备长效FSH融合蛋白的方法,该方法包括:(1)合成
两条不同的肽链的编码cDNA序列,其中一条为FSHα亚基直接或者通过链接元件间接连接在
锁式Fc链(Fch)N端形成的肽链FSHα-Fch,另一条为FSH的β亚基直接或者通过链接元件间接
连接在扣式Fc链(Fck)N端形成的FSHβ-Fck;(2)将编码肽链FSHα-Fch和FSHβ-Fck的cDNA序
列酶切连接方式引入哺乳动物表达载体中,得到重组双表达载体;(3)用步骤(2)得到的重
组双表达载体转化哺乳动物细胞,回收和纯化得到的FSH融合蛋白。
本发明涉及的FSH-Fc融合蛋白可以用标准的实验手段从宿主细胞中纯化。包括但
不限于,用蛋白A进行亲和纯化。
本发明的中的Fc指的是人免疫球蛋白链恒定区,特别是免疫球蛋白重链恒定区的
CH2和CH3片段。天然人免疫球蛋白Fc段在不同个体中会有个别氨基酸的差异。本发明中人
免疫球蛋白Fc也包括对于天然人免疫球蛋白Fc序列的氨基酸所有改变,包括但不限于,Fc
区域局部某些氨基酸的改变,如包括铰链区某些氨基酸位点突变,某些降低免疫功能的氨
基酸突变,或者其他无义突变。
在具体实施方式中,本发明所用的人免疫球蛋白Fc包括至少一个免疫球蛋白绞链
区,一个CH2结构域和一个CH3结构域,具体为一种人IgG4Fc的突变体。
本发明涉及的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO,HEK293。宿主细胞也可以是酵
母或者原核细胞如E.Coli。
因此,本发明提供了一种在保持FSH生物活性的基础上,延长其体内半衰期的,并
便于制备FSH-FC融合蛋白的方法。
附图说明
图1为FSHα-Fch-FSHβ-Fck融合蛋白异二聚体示意图。1.α亚基;2.β亚基;3.IgG
CH2片段;4.锁式IgG CH3变体片段;5.扣式IgG CH3变体片段。
图2图示的是FSHα-Fch-FSHβ-Fck生物活性测定结果。
实施例
实施例1.FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体表达质粒构建
根据NCBI数据库中的FSHα亚基的氨基酸序列(Gene bank No.NP_000726.1)、人
FSHβ亚基氨基酸序列(Gene bank No.NP_000501.1),以及如SEQ ID NO:1所示的锁式Fc链
氨基酸序列(含有T148S、L150A、Y189V突变,形成较小侧链结构)和SEQ ID NO:2所示的扣式
Fc链的氨基酸序列(含有T148W突变,形成较大侧链结构),分别人工合成FSHα-Fch(SEQ ID
NO:3)和FSHβ-Fck(SEQ ID ID NO:4)的编码DNA序列。合成时在编码序列上、下游分别引入
限制性内切酶SapI的酶切位点。
编码DNA合成好后,利用SapI酶切位点,将FSHα-Fch插入表达载体pQKpX1载体中,
生成pQKpX1-α质粒;将FSHβ-Fck插入pQKpX2载体中,再利用NotI和PvuI酶切位点,将pQKpX2
载体中的FSHβ-Fck表达元件切下,插入pQKpX1-α质粒中,生成双表达质粒pQKpX-αβ。
取构建成功的双表达质粒pQKpX-αβ,用PvuI限制性内切酶消化。酶切产物通过
0.8%的琼脂糖电泳分离纯化,并回收约11000bp大小的线性化DNA片段,准备用于转染CHO-
K1细胞。
实施例2.FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体蛋白的表达与纯化
2.1 FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体的稳定表达
将驯化至无血清培养基培养的CHO-K1(ATCC,CCL-61)细胞,以5×106cells/ml的
密度接种于30ml CD-CHO培养基中培养,24hr后细胞密度应达到1~2×106cells/ml。取细
胞悬液800rpm离心5min,弃上清液,用50ml CD CHO培养基清洗细胞2次,弃上清,重悬于1ml
CD CHO培养基中。将细胞和质粒按照1×107cells∶40μg DNA的比例混合,设置电穿孔转染
参数:电压300V;电容900μF,进行电脉冲,转染后细胞转入100ml CD-CHO培养基中,分装于
10块96孔板内,每板孔100μL。24小时后分别补加100μL的MSX工作液进行加压筛选。细胞板
经培养3周后,板孔中形成细胞克隆。挑选分离度良好的单克隆细胞,依次转至24孔板、6孔
板进行扩增培养,培养上清利用HPLC-ProteinA色谱柱定量检测,选择10株表达水平较高的
细胞克隆在摇瓶中进一步培养,培养上清进行非还原SDS-PAGE电泳检测。
2.2 FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体蛋白纯化
经SDS-PAGE电泳和western-blotting检测发现,培养上清中主要组份为异二聚体
和部分降解产物,几乎检测不到同源二聚体或含有极少量同源二聚体。因此可通过protein
A亲和层析结合离子交换进行纯化。细胞上清液经离心,收集上清液用0.22μm滤膜过滤,准
备上样。Protein A亲和层析柱用pH7.0,含有50mM NaCl的20mM PB缓冲液平衡后,将过滤好
的样品上样,上样结束后用平衡缓冲液淋洗,然后用0.1M pH3.0的柠檬酸洗脱目的蛋白。经
一步纯化后,HPLC结果显示纯度达到95%以上。进一步使用阴离子交换进行纯化,使用
Hitrap Q HP离子交换柱,经20mM PB缓冲液平衡后上样,用含有1M NaCl的20mM PB缓冲液
洗脱,洗脱的目的蛋白经HPLC检测纯度达到99%。
实施例3 FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体生物学活性检测
根据我国药典,采用大鼠卵巢重量增加法测定FSH重组蛋白的生物活性。以HCG辅
助受试FSH药物,刺激未成熟的21日龄雌性大鼠,触发卵巢卵泡生长和卵细胞生成,通过测
量给药末期卵巢重量,可以明确评价受试药物的生物活性。取3周龄、体重40-60g的SPF雌性
大鼠,按照平均体重分为7个实验组,设立一个空白对照组,高、中、低剂量的阳性对照药物
剂量组以及高、中、低剂量的受试药物组。对照药物丽申宝(购自丽珠制药)每日给药1次,受
试样品FSHα-Fch-FSHβ-Fck仅给药一次,给药方式为皮下注射。72小时后,对各实验组大鼠
进行卵巢称重,结果表明如图2所示,相对于丽申宝连续三天每日给药一次,FSHα-Fch-FSH
β-Fck异二聚体重组蛋白在仅一次给药,对卵巢增重的刺激作用明显,优于对照药物。
实施例4.FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体半衰期测定
按照0.1mg/kg体重,单次给予猕猴皮下注射FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体融合蛋
白,分别于给药后第2、4、8、12hr,2、3、4、8、10、12day采集0.6mL静脉血,以夹心ELISA测定样
品中FSH含量,采用WinNonlin软件计算猕猴血清中FSH的PK参数,结果如下表表1所示。药代
动力学参数表明,本发明的FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体融合蛋白具有较高的药时曲线下
面积,经计算其半衰期约为248小时,而同时测定的果纳芬的半衰期为17.3小时,可知FSHα-
Fch-FSHβ-Fck异二聚体半衰期为后者的14倍(表1)。
表1:FSHα-Fch-FSHβ-Fck异二聚体融合蛋白药代动力学参数
序列表
<110> 北京启康兴业生物医药科技有限公司
<120> 一种新型FSH-Fc融合蛋白及其制备方法和用途
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 锁式Fc链Fch
<222> (1)..(229)
<400> 1
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly
225
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly
225
<210> 3
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 肽链FSHα-Fch
<222> (1)..(336)
<400> 3
Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro
1 5 10 15
Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys
20 25 30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
35 40 45
Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
50 55 60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr
65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr
100 105 110
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
130 135 140
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
145 150 155 160
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
165 170 175
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
180 185 190
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
195 200 205
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
210 215 220
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
225 230 235 240
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
260 265 270
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
275 280 285
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
290 295 300
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
305 310 315 320
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325 330 335
<210> 4
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 肽链FSHβ-Fck
<222> (1)..(355)
<400> 4
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1 5 10 15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
20 25 30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
35 40 45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
50 55 60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65 70 75 80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
115 120 125
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165 170 175
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180 185 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
195 200 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210 215 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
225 230 235 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245 250 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
260 265 270
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275 280 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
305 310 315 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Gly
355