一种海参胶原蛋白的提取方法技术领域
本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体是一种海参胶原蛋白的提取方法。
背景技术
海参，属棘皮动物，是一种古老的海洋软体生物。有着6亿多年的存活史，因其“性
温补、足敌山参”而胜名，在“海味八珍”中居首位，价值昂贵，为久负盛名的滋补珍品。海参
的营养价值极高，富含聚氨基葡萄糖、粘多糖、海洋生物活性钙、高蛋白、黏蛋白、多肽、胶原
蛋白、核酸、海参皂甙、硫酸软骨素、多种维生素、及各种氨基酸和碳水化合物等50多种养
分，是不可多得的不含胆固醇的高级滋补品。
海参中富含的聚氨基葡萄糖、生物活性钙、海参粘多糖、多肽、海参素、海参皂苷、
氨基酸、等活性成分，能有效修复受损关节软骨，恢复骨关节的正常功能。同时海参中营养
成分还具有扩张血管，增加血液流量；抑制血小板聚集，增强纤维蛋白的溶解，改善微循环；
促进炎症渗出物吸收；并有镇痛、镇静、抗炎、抗感染、提高机体免疫力的作用。蛋氨酸、牛磺
酸，微量元素钒、硒、锗、维生素PP等，这些物质都是人体生长发育不可缺少的物质，在机体
内起到不可替代的生理功能，如蛋氨酸、牛磺酸，能够促进生长发育，缓解疲劳；微量元素
钒，能够使机体内铁元素更有效的吸收，改善各种贫血；元素硒、锗等则具有清除人体自由
基，防癌、抗癌的作用。
从海参中可提取很多对人体有益的物质，如胶原蛋白，现有技术如授权公告号为
CN101532044B的中国发明专利，公开了一种海参煮液提取海参胶原蛋白小肽冻干粉的制备
方法，其采用海参煮液作原料，经 A 海参煮液获得 ；B生物酶解 ；C 海参胶原蛋白小肽的
纯化 ；D 冻干干燥及包装成品。该方法提高海参加工率和营养价值，采用 FD 航天生物冷
冻干燥技术，保持海参胶原蛋白小肽的活性、抗氧化、抗复聚、抗潮结性、水份低易保存。该
方法胶原蛋白的获取量不大，制备时间长，不适合大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海参胶原蛋白提取率高，能得到纯度高，活性强，能达
到皮肤真皮层，增加皮肤弹性，淡化皱纹的胶原蛋白的海参胶原蛋白的提取方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种海参胶原蛋白的提取方法，具体步骤为：
1）去腥：将海参切成小块，加入去腥剂，浸泡，浸泡时间为10~15h，沥干；
2）脱脂：将去腥后的海参匀浆，加入脱脂剂，回流提取，脱脂剂为丙酮-乙酸乙酯混合
液，丙酮：乙酸乙酯体积比为1:2~4，匀浆液：混合液体积比为1:20~25，回流温度为70~80℃，
回流时间为50~60min，重复脱脂1~3次。干燥，得到脱脂海参粉末。脂肪在酶解过程中被氧
化，会导致酶解液的色泽、气味发生变化；其次，脂肪与蛋白乳化会造成水解后的溶液难分
离；因此，对脂肪进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件。采用上述脱脂剂对海参进行脱
脂，脱脂率高。回收回流液，旋蒸去除脱脂剂，得到海参中脂溶性物质，如不饱和脂肪酸；
3）分步酶解：在脱脂海参粉末中按质量体积比为1g：（10~15）mL：（0.02~0.04）g加入蒸
馏水和助溶剂，再加入0.002~0.004%木瓜蛋白酶，酶解，酶解温度为53~56℃，pH为6.5~7.2，
酶解时间为2.7~3.2h，酶解结束后沸水浴灭酶。调节pH，加入0.004~0.007%胰凝乳蛋白酶，
酶解，酶解温度为57~70℃，pH为7.1~7.6，酶解时间为1.2~1.5h，酶解结束后沸水浴灭酶。调
节pH，加入0.003~0.006%风味蛋白酶，酶解，酶解温度为46~52℃，pH为6.0~6.7，酶解时间为
1.8~2.3h，酶解结束后沸水浴灭酶，过滤。先用内切酶木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解，使
海参蛋白的氨基酸酶切位点暴露率增加，再用外切酶风味蛋白酶进行酶解，将海参蛋白充
分酶解，增加海参胶原蛋白的量，提高产率；
4）醇沉：在滤液中加入95~98%的乙醇，滤液：乙醇体积比为1:3.5~4.5，搅拌，静置，离
心。高浓度乙醇能使蛋白质沉淀的同时不会破坏蛋白质的结构，不会影响其活性。醇沉能使
海参胶原蛋白进行初步的纯化，回收离心所得上清液，旋蒸去除乙醇和水，可得到海参中既
能溶于水，又能溶于高浓度乙醇的物质；
5）超滤、干燥：在步骤4得到的沉淀中加入蒸馏水，沉淀：蒸馏水质量体积比为1g：（5~8）
mL。超滤，先用6~9kDa超滤膜超滤，取滤过液，再用300~500Da超滤膜超滤，取滞留液，旋蒸浓
缩，冷冻干燥，得到海参胶原蛋白粉末。回收第一次超滤的滞留液可得到分子量大于6~9kDa
的物质，如海参粘多糖；回收第二次超滤滤过液，可得到分子量小于300~500Da的物质，如牛
磺酸、微量元素钒、硒、锗。最后得到的海参胶原蛋白的纯度高，分子量小，能够直达皮肤真
皮层，锁住水分，增加皮肤的弹性，淡化皱纹；活性强，抗氧化能力强，清除体内自由基，起到
抗衰老的作用。
优选的，去腥液成份及其重量份为：15~20份紫苏提取物、10~12份姜提取物、5~10
份蒜提取物、1~3份乙醇、4~8份肉桂棒提取物、3~5份甲鱼胆汁提取物。上述去腥液既能与三
甲胺反应产生季铵盐，又能溶解三甲胺，且溶解度高，浸泡时间短，去腥效果显著。
优选的，助溶剂成份及其重量份：0.04~0.07份辛烯基琥珀酸淀粉钠、0.001~0.003
份没食子酸、0.001~0.002份酪蛋白酸钠、0.002~0.005份毛地黄皂苷和0.001~0.003份吐
温-80。助溶剂既能将胶原蛋白的疏水段包裹起来，减少蛋白质-蛋白质之间的相互作用，又
能增强蛋白质-水之间的离子相互作用，增加胶原蛋白在水中的溶解度，提高胶原蛋白的提
取率。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用丙酮-乙酸乙酯混合液作为脱脂剂，对
海参的脱脂率高；毛地黄皂苷和没食子酸通过烯基琥珀酸淀粉钠促进增强蛋白质-水之间
的离子相互作用，胶原蛋白在水中的溶解，提高胶原蛋白提取率；先用内切酶木瓜蛋白酶和
胰凝乳蛋白酶酶解，使海参蛋白的氨基酸酶切位点暴露率增加，再用外切酶风味蛋白酶进
行酶解，将海参蛋白充分酶解，增加海参胶原蛋白的量，提高产率；通过醇沉对胶原蛋白进
行初步分离纯化；通过超滤，对胶原蛋白再次分离纯化，提高胶原蛋白的纯度；最后得到的
海参胶原蛋白的纯度高，分子量小，能够直达皮肤真皮层，锁住水分，增加皮肤的弹性，淡化
皱纹；活性强，抗氧化能力强，清除体内自由基，起到抗衰老的作用；将制备海参胶原蛋白的
过程中产生的废弃物进行回收纯化，得到经济价值高的产品，如聚氨基葡萄糖、生物活性
钙、海参粘多糖、多肽、海参素、海参皂苷、氨基酸；本发明操作步骤简单，得到的产品经济价
值高，增加了海参的经济附加值，为海参的处理增加了一条新的途径。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种海参胶原蛋白的提取方法，具体步骤为：
1）去腥：将海参切成小块，加入去腥剂，浸泡，浸泡时间为10~15h，沥干；
2）脱脂：将去腥后的海参匀浆，加入脱脂剂，回流提取，脱脂剂为丙酮-乙酸乙酯混合
液，丙酮：乙酸乙酯体积比为1:2~4，匀浆液：混合液体积比为1:20~25，回流温度为70~80℃，
回流时间为50~60min，重复脱脂1~3次。干燥，得到脱脂海参粉末。脂肪在酶解过程中被氧
化，会导致酶解液的色泽、气味发生变化；其次，脂肪与蛋白乳化会造成水解后的溶液难分
离；因此，对脂肪进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件。采用上述脱脂剂对海参进行脱
脂，脱脂率高。回收回流液，旋蒸去除脱脂剂，得到海参中脂溶性物质，如不饱和脂肪酸；
3）分步酶解：在脱脂海参粉末中按质量体积比为1g：（10~15）mL：（0.02~0.04）g加入蒸
馏水和助溶剂，再加入0.002~0.004%木瓜蛋白酶，酶解，酶解温度为53~56℃，pH为6.5~7.2，
酶解时间为2.7~3.2h，酶解结束后沸水浴灭酶。调节pH，加入0.004~0.007%胰凝乳蛋白酶，
酶解，酶解温度为57~70℃，pH为7.1~7.6，酶解时间为1.2~1.5h，酶解结束后沸水浴灭酶。调
节pH，加入0.003~0.006%风味蛋白酶，酶解，酶解温度为46~52℃，pH为6.0~6.7，酶解时间为
1.8~2.3h，酶解结束后沸水浴灭酶，过滤。先用内切酶木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解，使
海参蛋白的氨基酸酶切位点暴露率增加，再用外切酶风味蛋白酶进行酶解，将海参蛋白充
分酶解，增加海参胶原蛋白的量，提高产率；
4）醇沉：在滤液中加入95~98%的乙醇，滤液：乙醇体积比为1:3.5~4.5，搅拌，静置，离
心。高浓度乙醇能使蛋白质沉淀的同时不会破坏蛋白质的结构，不会影响其活性。醇沉能使
海参胶原蛋白进行初步的纯化，回收离心所得上清液，旋蒸去除乙醇和水，可得到海参中既
能溶于水，又能溶于高浓度乙醇的物质；
5）超滤、干燥：在步骤4得到的沉淀中加入蒸馏水，沉淀：蒸馏水质量体积比为1g：（5~8）
mL。超滤，先用6~9kDa超滤膜超滤，取滤过液，再用300~500Da超滤膜超滤，取滞留液，旋蒸浓
缩，冷冻干燥，得到海参胶原蛋白粉末。回收第一次超滤的滞留液可得到分子量大于6~9kDa
的物质，如海参粘多糖；回收第二次超滤滤过液，可得到分子量小于300~500Da的物质，如牛
磺酸、微量元素钒、硒、锗。最后得到的海参胶原蛋白的纯度高，分子量小，能够直达皮肤真
皮层，锁住水分，增加皮肤的弹性，淡化皱纹；活性强，抗氧化能力强，清除体内自由基，起到
抗衰老的作用。
去腥液成份及其重量份为：15~20份紫苏提取物、10~12份姜提取物、5~10份蒜提取
物、1~3份乙醇、4~8份肉桂棒提取物、3~5份甲鱼胆汁提取物。上述去腥液既能与三甲胺反应
产生季铵盐，又能溶解三甲胺，且溶解度高，浸泡时间短，去腥效果显著。
助溶剂成份及其重量份：0.04~0.07份辛烯基琥珀酸淀粉钠、0.001~0.003份没食
子酸、0.001~0.002份酪蛋白酸钠、0.002~0.005份毛地黄皂苷和0.001~0.003份吐温-80。助
溶剂既能将胶原蛋白的疏水段包裹起来，减少蛋白质-蛋白质之间的相互作用，又能增强蛋
白质-水之间的离子相互作用，增加胶原蛋白在水中的溶解度，提高胶原蛋白的提取率。
实施例2：
一种海参胶原蛋白的提取方法，最优选步骤为：
1）去腥：称取10kg海参，用清水洗净，将海参切成1cm×1cm×1cm的小块，加入去腥剂，
将海参小块浸没，去腥液成份及其最优选重量份为：18份紫苏提取物、12份姜提取物、7份蒜
提取物、3份乙醇、6份肉桂棒提取物、4份甲鱼胆汁提取物。上述去腥液既能与三甲胺反应产
生季铵盐，又能溶解三甲胺，且溶解度高，浸泡时间短，去腥效果显著。浸泡，浸泡时间为
15h，沥干；
2）脱脂：将去腥后的海参匀浆，加入脱脂剂，回流提取，脱脂剂为丙酮-乙酸乙酯混合
液，丙酮：乙酸乙酯体积比为1:3，匀浆液：混合液体积比为1: 25，回流温度为76℃，回流时
间为60min，重复脱脂2次。干燥，得到脱脂海参粉末。脂肪在酶解过程中被氧化，会导致酶解
液的色泽、气味发生变化；其次，脂肪与蛋白乳化会造成水解后的溶液难分离；因此，对脂肪
进行处理是保证蛋白顺利制备的重要条件。采用上述脱脂剂对海参进行脱脂，脱脂率高。回
收回流液，旋蒸去除脱脂剂，得到海参中脂溶性物质，如不饱和脂肪酸；
3）分步酶解：在脱脂海参粉末中按质量体积比为1g：14mL：0.04g加入蒸馏水和助溶剂，
助溶剂成份及其最优选重量份：0.05份辛烯基琥珀酸淀粉钠、0.003份没食子酸、0.001份酪
蛋白酸钠、0.004份毛地黄皂苷和0.002份吐温-80。助溶剂既能将胶原蛋白的疏水段包裹起
来，减少蛋白质-蛋白质之间的相互作用，又能增强蛋白质-水之间的离子相互作用，增加胶
原蛋白在水中的溶解度，提高胶原蛋白的提取率。再加入0.003%木瓜蛋白酶，酶解，酶解温
度为55℃，pH为6.9，酶解时间为3.0h，酶解结束后沸水浴7min灭酶。调节pH，加入0.006%胰
凝乳蛋白酶，酶解，酶解温度为58℃，pH为7.4，酶解时间为1.3h，酶解结束后沸水浴7min灭
酶。调节pH，加入0.005%风味蛋白酶，酶解，酶解温度为50℃，pH为6.2，酶解时间为2.1h，酶
解结束后沸水浴8min灭酶，过滤。先用内切酶木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解，使海参蛋白
的氨基酸酶切位点暴露率增加，再用外切酶风味蛋白酶进行酶解，将海参蛋白充分酶解，增
加海参胶原蛋白的量，提高产率；
4）醇沉：在滤液中加入98%的乙醇，滤液：乙醇体积比为1:3.9，搅拌，静置，离心。高浓度
乙醇能使蛋白质沉淀的同时不会破坏蛋白质的结构，不会影响其活性。醇沉能使海参胶原
蛋白进行初步的纯化，回收离心所得上清液，旋蒸去除乙醇和水，可得到海参中既能溶于
水，又能溶于高浓度乙醇的物质；
5）超滤、干燥：在步骤4得到的沉淀中加入蒸馏水，沉淀：蒸馏水质量体积比为1g：7mL。
超滤，先用8kDa超滤膜超滤，取滤过液，再用400Da超滤膜超滤，取滞留液，旋蒸浓缩，冷冻干
燥，得到海参胶原蛋白粉末。回收第一次超滤的滞留液可得到分子量大于8kDa的物质，如海
参粘多糖；回收第二次超滤滤过液，可得到分子量小于400Da的物质，如牛磺酸、微量元素
钒、硒、锗。最后得到的海参胶原蛋白的纯度高，分子量小，能够直达皮肤真皮层，锁住水分，
增加皮肤的弹性，淡化皱纹；活性强，抗氧化能力强，清除体内自由基，起到抗衰老的作用。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅
为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、
补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。