牙髓间充质干细胞上清液在制备治疗口腔溃疡药物中的应用及漱口液和其制备方法技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及牙髓间充质干细胞上清液在制备治疗口腔
溃疡药物中的应用及漱口液和其制备方法。
背景技术
口腔溃疡俗称“口疮”，是一种常见的发生于口腔黏膜的溃疡性损伤病症，多见于
唇内侧、舌头、舌腹、颊黏膜、前庭沟、软腭等部位，这些部位的黏膜缺乏角质化层或角化较
差。舌头溃疡指发生于舌头、舌腹部位的口腔溃疡。口腔溃疡发作时疼痛剧烈，局部灼痛明
显，严重者还会影响饮食、说话，对日常生活造成极大不便；可并发口臭、慢性咽炎、便秘、头
痛、头晕、恶心、乏力、烦躁、发热、淋巴结肿大等全身症状。
口腔溃疡的病因目前尚未明确，通常认为口腔溃疡的发生是多种因素综合作用的
结果。免疫、遗传和环境可能是口腔溃疡发病的“三联因素”，即遗传背景与适当的环境因素
可引发异常的免疫反应而出现口腔溃疡特征性病损。
现有的口腔溃疡治疗药物主要有：局部抗菌药物、局部皮质类固醇、局部止痛剂、
局部抗炎制剂或全身的抗菌抗炎用药。虽然以上治疗药物对口腔溃疡可以产生不同程度的
治疗效果，但也会引起一定的不良反应，如对口腔粘膜的刺激性，患者感觉不舒适，不易接
受等，还有一些药物会产生全身的副作用。在口腔溃疡的治疗过程中，通常都先采用清净水
或生理盐水漱口，使口腔保持清洁，然后再涂抹药物，避免了口腔内患处不洁净而影响药
效。但采用清净水或生理盐水漱口仅能使口腔保持清洁，功能单一，目前尚缺乏可以配合药
物治疗的合适的漱口液。
徐娜于2015年发表的《含漱人骨髓间充质干细胞上清液对肾移植术后口腔溃疡的
疗效》中报道了体外培养的骨髓间充质干细胞上清液含有多种细胞因子，具有抗炎、促进血
管形成及修复受损组织的功能。但申请人研究发现骨髓间充质干细胞治疗口腔溃疡的总有
效率仅83％。因此，对于口腔溃疡治疗总有效率更高的干细胞制剂仍有需求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了牙髓间充质干细胞上清液在制备治疗口腔溃疡药物中的
应用及漱口液和其制备方法。该牙髓间充质干细胞上清液治疗口腔溃疡的总有效率可高达
90％以上。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了牙髓间充质干细胞上清液在制备治疗口腔溃疡药物中的应用。
目前有报道显示体外培养的骨髓间充质干细胞上清液具有治疗口腔溃疡的作用，
本发明研究发现，与骨髓间充质干细胞上清液相比，体外培养的牙髓间充质干细胞上清液
在治疗口腔溃疡的疗效上更为显著。因此，将牙髓间充质干细胞上清液用于口腔溃疡的治
疗或辅助治疗具有更为广阔的前景。
本发明还提供了一种用于治疗口腔溃疡的漱口液，包括牙髓间充质干细胞上清
液。
在本发明提供的实施例中，牙髓间充质干细胞上清液的制备方法为：取牙髓间充
质干细胞采用完全培养基进行第一培养，然后采用无血清的DMEM/F12培养基进行第二培
养，收集细胞培养基的上清液，得到牙髓间充质干细胞上清液。
作为优选，牙髓间充质干细胞为第3～5代牙髓间充质干细胞。
作为优选，第一培养的牙髓间充质干细胞的接种密度为(1～10)×103个/cm2。
在本发明提供的实施例中，第一培养的牙髓间充质干细胞的接种密度为7×103
个/cm2。
作为优选，第一培养的培养时间为20～30小时。
在本发明提供的实施例中，第一培养的培养时间为24小时。
作为优选，第一培养的培养条件为37℃、5％CO2。
作为优选，第二培养的培养时间为40～60小时。
在本发明提供的实施例中，第二培养的培养时间为48小时。
作为优选，第二培养的培养条件为37℃、5％CO2。
在本发明提供的实施例中，收集细胞培养基的上清液之后还包括离心、取上清、滤
膜过滤的步骤。
在本发明提供的实施例中，离心的转速为1000rpm，时间为5min。
在本发明提供的实施例中，过滤所采用的滤膜的孔径为0.22μm。
作为优选，用于治疗口腔溃疡的漱口液还包括药学上可接受的辅料。
作为优选，得到的牙髓间充质干细胞上清液的存贮温度为-20～-80℃。
本发明还提供了该漱口液的制备方法，包括：取牙髓间充质干细胞采用完全培养
基进行第一培养，然后采用无血清的DMEM/F12培养基进行第二培养，收集细胞培养基的上
清液，得到牙髓间充质干细胞上清液。
作为优选，牙髓间充质干细胞为第3～5代牙髓间充质干细胞。
作为优选，第一培养的牙髓间充质干细胞的接种密度为(1～10)×103个/cm2。
在本发明提供的实施例中，第一培养的牙髓间充质干细胞的接种密度为7×103
个/cm2。
作为优选，第一培养的培养时间为20～30小时。
在本发明提供的实施例中，第一培养的培养时间为24小时。
作为优选，第一培养的培养条件为37℃、5％CO2。
作为优选，第二培养的培养时间为40～60小时。
在本发明提供的实施例中，第二培养的培养时间为48小时。
作为优选，第二培养的培养条件为37℃、5％CO2。
在本发明提供的实施例中，收集细胞培养基的上清液之后还包括离心、取上清、滤
膜过滤的步骤。
在本发明提供的实施例中，离心的转速为1000rpm，时间为5min。
在本发明提供的实施例中，过滤所采用的滤膜的孔径为0.22μm。
在本发明提供的实施例中，牙髓间充质干细胞的分离培养方法为：
将从脱落或拔出的智齿中，破开牙冠，挑出牙髓组织，用0.1％～0.5％I型胶原酶
消化后30～60min，以1500rpm离心5min，用无血清培养基重悬细胞沉淀，接种于培养皿中，
无血清培养基中，放置37℃、5％CO2培养箱中培养，3天换液；当贴壁细胞汇合度达80％～
90％后，用0.1％～0.25％胰蛋白酶消化，以1000～1500rpm离心5min，按照(0.5～1)×
104cells/cm2细胞密度传代，取用3～5代细胞用于实验。
本发明提供了牙髓间充质干细胞上清液在制备治疗口腔溃疡药物中的应用及漱
口液和其制备方法。该漱口液包括牙髓间充质干细胞上清液。本发明至少具有如下有益效
果之一：
1、本发明研究显示牙髓间充质干细胞上清液治疗口腔溃疡的总有效率可高达
90％以上，试验结果表明，牙髓间充质干细胞上清对口腔溃疡的疗效要显著好于骨髓间充
质干细胞上清的疗效；
2、本发明提供的漱口液对口腔黏膜无刺激，不会引起任何不良反应，患者容易接
受。
附图说明
图1示流式细胞仪检测分离培养的牙髓间充质干细胞表面抗原的检测结果；其中，
1-1～1-6分别示CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况；
图2示流式细胞仪检测分离培养的骨髓间充质干细胞表面抗原的检测结果；其中，
2-1～2-6分别示CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。
具体实施方式
本发明公开了牙髓间充质干细胞上清液在制备治疗口腔溃疡药物中的应用及漱
口液和其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要
指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包
括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不
脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来
实现和应用本发明技术。
术语解释：
牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类
具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。
本发明提供的牙髓间充质干细胞上清液在制备治疗口腔溃疡药物中的应用及漱
口液和其制备方法中的应用及药物中所用生物材料、试剂、仪器等均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
1、牙髓间充质干细胞的分离培养及传代扩增
将从脱落或拔出的智齿中，破开牙冠，挑出牙髓组织，用0.3％I型胶原酶消化后
30min，以1500rpm离心5min，用无血清培养基重悬细胞沉淀，接种于在培养皿中，无血清培
养基中，放置37℃、5％CO2培养箱中培养，24小时换液，随后2～3天换液；当贴壁细胞汇合度
达80％～90％后，用0.25％胰蛋白酶消化，以1000rpm离心5min，按照0.8×104cells/cm2细
胞密度传代。
2、牙髓间充质干细胞的鉴定
取P3细胞，当细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，并计数后
每管加入2×105细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打
混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、及HLA-DR抗体各2μL，并设一管为空白对照；
在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上
清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞
表面抗原。检测结果见图1。
由图1可见，间充质干细胞阳性表面标记物CD73、CD90、CD105的表达量均大于
95％，而阴性表面标记物CD34、CD45、HLA-DR表达量均小于2％，符合间充质干细胞表面标记
物特征。说明分离培养的牙髓间充质干细胞保持间充质干细胞的特性。
2、牙髓间充质干细胞培养基上清的收集
取第3代牙髓间充质干细胞，先按照7×103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基
进行培养24小时后，用生理盐水清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养48小时后，
收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000pm离心5min。去除沉淀，收集上清。
用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在-20℃
培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。
实施例2：
牙髓间充质干细胞培养基上清的收集：
取实施例1中第4代牙髓间充质干细胞，先按照7×103/cm2细胞密度接种培养皿，完
全培养基进行培养24小时后，用生理盐水清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养
48小时后，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000pm离心5min。去除沉淀，
收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放
置在-20℃培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。
实施例3：
牙髓间充质干细胞培养基上清的收集：
取实施例1中第5代牙髓间充质干细胞，先按照7×103/cm2细胞密度接种培养皿，完
全培养基进行培养24小时后，用生理盐水清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养
48小时后，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000pm离心5min。去除沉淀，
收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放
置在-20℃培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。
对比例1：
1、分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞
1)从医院取正常人的骨髓样本在无菌环境下，在骨髓中加入等体积的生理盐水，
轻轻混匀，得到骨髓混合液A；在新的离心管中加入骨髓混合液(A)等体积的淋巴细胞分离
液；用注射器吸取骨髓混合液(A)缓慢沿着管壁加入到淋巴细胞分离液中；以300-400g离心
10-15min，离心后可见液体分层用巴氏吸管吸取中间层的单核细胞层，转移到含有5-10ml
Hanks缓冲溶液的离心管中，轻轻混匀；以200-300g离心5-15min，去上清，用Hanks再次清洗
1-2次；用骨髓间充质干细胞生长培养基(无血清培养，含10ng/ml bFGF，10ng/ml EGF)重悬
细胞，并接种中培养皿中；放置在37℃、5％CO2培养箱中培养；48小时后，去除培养上清，重
新换上骨髓间充质干细胞生长培养基；每3天换液，4-8天即可见细胞汇合度达到80-90％；
细胞传代操作：用0.25％-0.125％胰蛋白酶消化贴壁细胞，以200-300g离心5-10min，用生
长培养基重悬细胞沉淀，按照5000-10000/cm2细胞密度接种培养皿中，传代至P3-P5代。
2)骨髓间充质干细胞的鉴定
取P3细胞，当细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，并计数后
每管加入2×105细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打
混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、及HLA-DR抗体各2μL，并设一管为空白对照；
在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上
清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞
表面抗原。检测结果见图2。
由图2可见，间充质干细胞阳性表面标记物CD73、CD90、CD105的表达量均大于
95％，而阴性表面标记物CD34、CD45、HLA-DR表达量均小于2％，符合间充质干细胞表面标记
物特征。说明分离培养的骨髓间充质干细胞保持间充质干细胞的特性。
2、骨髓间充质干细胞培养基上清的收集：
取第4代骨髓间充质干细胞，先按照7×103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基
进行培养24小时后，用生理盐水清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养48小时后，
收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000pm离心5min。去除沉淀，收集上清。
用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在-20℃
培养箱保存6-12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。
试验例干细胞上清对口腔溃疡模型的小鼠的疗效
用0.025g/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，用NaOH晶体在双侧下唇靠口角粘膜处烧灼5～
8s，生理盐水冲洗后形成溃疡。选取60只健康小鼠随机分为实验组和对照组，每组30只。
实验组：口腔溃疡用生理盐水清洁溃疡表面后，用棉签蘸取实施例1～3牙髓干细
胞培养基上清液涂抹溃疡处。
对照组：口腔溃疡用生理盐水清洁溃疡表面后，用棉签蘸取对比例1骨髓间充质干
细胞培养基上清液涂抹溃疡处。
连续给药7天，每日记录溃疡变化情况，按以下标准判读疗效：
(1)显效：溃疡面积明显缩小，疼痛感明显减轻，患者可以正常进食；
(2)有效：溃疡面积较前有缩小，疼痛较前减轻；
(3)无效：疡面积未缩小甚至扩大，临床症状无改善甚至恶化。
各组疗效结果如下：
表1各组干细胞上清对小鼠口腔溃疡的治疗效果
如表1试验数据可知，相比对照组，实验组的牙髓间充质干细胞上清在治疗口腔溃
疡的总有效率更高。试验结果显示，牙髓间充质干细胞上清对口腔溃疡的疗效要显著好于
骨髓间充质干细胞上清的疗效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。