本发明涉及适于用作鸟类卵内活疫苗的经修饰微生物。在孵化前或刚孵化后，本发明的卵内活疫苗可用于对经修饰的微生物的致病型或与经修饰微生物免疫学上相关的微生物或致病性生物或携带有在活疫苗内由经修饰微生物表达的抗原决定簇的病毒引起免疫反应。有关本题的卵内活疫苗在提高新孵出的禽鸟的存活率上特别有效。 由微生物、病毒、蠕虫、酵母菌和原生动物所致的鸟类感染可有严重的环境、生态学和商业问题。不仅有鸟类本身的危险，而且还有扩散到其他动物包括人的感染原的潜在危险。
由于饲养鸟（特别是新孵出的饲养鸟）对迅速扩散的感染的易感性，家禽业特别易受显著的经济损失。在禽鸟类，沙门氏菌属地感染（一般称作沙门氏菌病）是引起高死亡率感染的最常见形式。沙门氏菌的很多种也引起人和其他动物的感染，因此，禽鸟沙门氏菌病的控制是特别重要的。从禽鸟分得的两种最常见的沙门氏菌种是鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella tryphimurium）和肠类沙门氏菌（Salmonella enteritidis）。这两种微生物均与沙门氏菌病的暴发流行明显有关，事实上，八十年代中期，肠类沙门氏菌噬菌体4型的出现，成为对英国公众健康的威胁。
化学治疗和化学预防已被用作战胜诸如沙门氏病的家禽疾病的保护措施。但是，这样的措施并非总是成功的，且很费钱，又会导致感染原中耐药性的产生，未必会被公共卫生当局接受用于作为人或动物消费品的鸟类。由于这些和其他相关的原因，选择鸟类保护的方式成为重点科学研究的主题。
提出的一种保护方式是发展抗家禽疾病的疫苗。减毒的沙门氏菌活疫苗已被证明能保护小鸡（Cooper et al.，Microb.Pathog.，9：255-265，1990;Hassan and Curtiss Ⅲ，Res.Microbiol.，141：839-850，1990）。而且，芳香族生物合成通路的aroA或接近aroA处插入转座子的沙门氏菌株已被证明是减毒的，还能在组织中保留足够的时间以刺激免疫反应（Stocker，Vaccine，6：141-145，1988;美国专利No.4，735，801;美国专利No.5，210，035）。Cooper等（Vaccine 10：247-254，1992）制成两株在aroA基因上有突变的肠类沙门氏菌噬菌体4型。这些突变菌株被用作抗口服和静脉内激发的口服活疫苗。前述Cooper等得出的结果表明，肠类沙门氏菌疫苗口服摄取后在鸡身上是有保护作用的。
尽管包括沙门氏菌属在内的口服活疫苗在保护小鸡上有所声称的效能，但新孵出的鸟（鸡）对沙门氏菌感染特别敏感，刚孵出后的高死亡率可有严重的经济后果。而且，给予口服活疫苗并不总是方便的，在确定鸟接受的合适剂量上可产生困难。因此，另一个选择是当鸟在卵中时进行接种。
欧洲专利申请No.0 291 173提出引入可在孵化前的胚胎上诱发免疫反应的非复制性免疫原。此方法据说对于用形成孢子的禽艾美球虫（Eimeria tenella）卵囊提取物免疫鸟抗鸟球虫病是特别有用的。美国专利No.4，458，630还提出用复制性病毒疫苗在孵化前注射卵，可免疫鸟抗Marek’s疾病。但是，在这两种情况下，接种均在胚胎内注射，如注入卵黄囊或浆膜尿囊液。如果细菌以这种方式被接种，细菌会“炸开”卵，使其破碎，引起胚胎死亡。
因此，有必要改进涉及卵内疫苗的技术以使鸟类能受保护，对抗致病性生物如沙门氏毒株的攻击。按照本发明，发明者们发现可将已经减毒的或无毒的微生物接种到卵内特定组织，鸟在孵化时即受保护，免遭相应野生型微生物的攻击。本发明的方法还能使用携带抗原表位的经修饰的微生物，这些抗原表位作为对其他鸟类病原免疫原的形式，以诱导对这些病原产生免疫反应。在保护新孵化的鸟类和对家禽业提供显著的商业利益上，本发明代表了一个主要的突破点。
因此，本发明的一个方面是为鸟类提供包含减毒微生物的卵内活疫苗，该减毒微生物
（a）对一种或一种以上生长因子呈营养缺陷型，因此在缺乏所述一种或一种以上生长因子的最低限度培养基上不能生长;
（b）能移生于一种或一种以上孵化前的胚胎组织;及
（c）能在胚胎中，在孵化前或刚孵化后，引起对所述微生物的致病型或具有免疫交叉反应的微生物或携带有所述减毒微生物表达的抗原决定簇的致病性生物或病毒的免疫反应。
本发明的另一方面着眼于含减毒沙门氏菌的用于禽鸟的卵内活疫苗，该减毒沙门氏菌
（a）对一种或一种以上生长因子呈营养缺陷型，因此在缺乏所述一种或一种以上生长因子的最低限度培养基上不能生长;
（b）能移生于一种或一种以上孵化前的胚胎组织;及
（c）能在胚胎中，在孵化前或刚孵化后，引起对所述沙门氏菌的致病型或具有免疫交叉反应的沙门氏菌或携带有所述无毒沙门氏菌表达的抗原决定簇的致病性生物或病毒的免疫反应。
本发明的另一方面是用病原微生物免疫鸟来抗感染的方法，所述方法包括卵内给予减毒微生物，该减毒微生物
（a）对一种或一种以上生长因子呈营养缺陷型，因此在缺乏所述一种或一种以上生长因子的最低限度培养基上不能生长;及
（b）能以有效量移生于一种或一种以上孵化前的胚胎组织，在这种情况下在孵化前或刚孵化后，有效地诱导对所述减毒微生物的致病型或具有免疫交叉反应的微生物或携带所述减毒微生物表达的抗原决定簇的致病性生物或病毒引起免疫反应。
本发明还有另一方面涉及用病原微生物免疫禽鸟抗感染的方法，所述方法包括卵内给予含减毒沙门氏菌的疫苗，该减毒沙门氏菌
（a）对一种或一种以上生长因子呈营养缺陷型，因此在缺乏所述一种或一种以上生长因子的最低限度培养基上不能生长;及
（b）能以有效量移生于一种或一种以上孵化前的胚胎组织，在这种情况下在孵化前或刚孵化后，有效地诱导所述沙门氏菌的致病型或携带所述减毒沙门氏菌表达的抗原决定簇的致病性生物或病毒引起免疫反应。
本发明的另一方面着眼于从禽鸟中得到的具有气囊的受精卵，其中气囊接种了经修饰的微生物，该微生物
（a）对一种或一种以上生长因子呈营养缺陷型，因此在缺乏所述一种或一种以上生长因子的最低限度培养基上不能生长;
（b）能在胚胎破裂后通过气囊移生于一种或一种以上孵化前的胚胎组织;及
（c）能在孵化前或刚孵化后的胚胎中，引起对所述微生物的致病型或具有免疫交叉反应的微生物或携带所述无毒微生物表达的抗原决定簇的致病性生物或病毒的免疫反应。
图1是S.typhimurium STM-1及其野生型亲本中的质粒图（profile）的照片。第1条带：Hin dⅢ消化的Lambda标准品;第2条带：野生型;第3条带：STM-1。
图2是S.typhimurium STM-1及其野生型亲本引起的脾大的图解说明。野生型;STM-1;对照。
图3是感染有野生型S.typhimurium的小鼠脾脏中的存活计数图解。野生型;对照。
图4是感染有S.tvphimurium STM-1的小鼠脾脏中的存活计数图解。STM-1;对照。
图5是感染有S.typhimurium STM-1及其野生型的小鼠脾脏中的存活计数图解。野生型;STM-1;对照。
图6是接种了S.typhimurium STM-1后的小鸡体内的抗体滴度（IgG）图解。
图7是口服接种了S.typhimurium STM-1后的小鸡体内的抗体滴度图解。
图8是口服接种了S.typhimurium STM-1后的小鸡体内的抗体滴度图解。
图9是皮下接种了S.typhimurium STM-1后的小鸡体内的抗体滴度图解。
图10是皮下接种了S.typhimurium STM-1后的小鸡体内的抗体滴度图解。
本发明的一个方面提供卵内活疫苗形式的经修饰的微生物，它能有利于保护鸟类不受微生物感染或免疫鸟类抗活疫苗中表达的免疫原的。用在本说明书和权利要求书中的术语“卵内活疫苗是在其最宽的意义上加以考虑的，具体地包括不能在最低限度培养基上增殖而又保持其移生于孵化前卵内胚胎组织的能力的减毒或无毒微生物。在这方面较佳的胚胎组织与气囊相关联，特别是气囊膜。在孵化后或将要孵化前，减毒的或无毒的微生物移生于组织，如结肠、呼吸道和肺。本发明的卵内活疫苗还可提供从新孵化鸟竞争性排除病原性微生物的附加的优点，疫苗的存在通常可刺激鸟的免疫系统抗其他潜在的抗原。
本发明注重的鸟类包括鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡、鹌鹑和鸽子。最佳的鸟类是商业上重要的禽鸟、如鸡、鸭和火鸡。
可在寻求保护的基础上选择用于卵内活疫苗的候选者。例如，当寻求对特定的微生物种或微生物属的保护时，选择该种或属的减毒或无毒株。这样的选择要求减毒或无毒的微生物保持引起与相应野生型株有交叉反应的免疫反应，同时又不成为对鸟类或其他动物（如人）的致病原。然而，在卵内活疫苗被用作免疫原（一般是重组免疫原）的载体时，减毒或无毒的微生物引起对其相应的野生型微生物的交叉免疫反应不是必要的。虽然减毒或无毒的微生物携带的免疫原或抗原表位暴露在细胞表面或被细胞合成或释放出足够量以引起对免疫原或抗原表位的免疫反应似乎可能有好处，但非必需的。这种免疫反应保护鸟类不受天然表达该免疫原的微生物或其他病原的感染。
本发明的这一方面所涉及的鸟病原包括一种或一种以上选自微生物、蠕虫、原生动物、酵母和病毒的因子。较佳的免疫原或抗原表位是如下疾病的致病原，如鸟类造白细胞组织增生、网状内皮组织增生、感染性支气管炎、感染性粘液囊疾病、Newcastle’s病、腺病毒疾病、呼肠病毒病、痘病、喉气管炎、鸟流感、感染性鼻炎、鸡伤寒、球虫病、隐孢子虫病和禽霍乱。另一较佳的免疫原或抗原表位来自艾美球虫属（Eimeria），如Eimeria acervulina，Eimeria mivati，Eimeria mitis，Eimeria praecox，Eimeria hagani，Eimeria necatrix，Eime-ria maxima，Eimeria brunetti和Eimeria tenella。最佳的种是禽艾美球虫属（E.tenella）。
不考虑用来选择用于卵内活疫苗的微生物的标准，受试微生物必须经受同样的减毒或灭毒（当该微生物是病原性的时）和/或引起实质不可回复的一处或多处突变。此处将实质上不可回复的突变株看成是回复频率≤10-8，较好为≤10-9，更好为≤10-10。在一个最佳实施方案中，本发明涉及一种事实上回复可能性为0的突变。
合适的突变涉及单个或更好为多个多核苷酸取代、缺失和/或添加到候选微生物基因组的靶遗传序列上。在上下文中，基因组包括染色体外成分，如质粒DNA。突变被设计成确保微生物不能在最低限度培养基上生长，因为它不能合成一种或几种对于微生物生长必需的因子。这样的突变体微生物叫做营养缺陷型突变体。突变成营养缺陷型也可导致微生物的减毒或灭毒，后者可能需要另外的步骤，例如通过营养培养基继续传代。卵内活疫苗中营养缺陷型突变体的使用通过鸟排出实质上在环境中不能生长的微生物而有助于减少微生物的扩散。
本发明的方法部分依据于使用能移生于胚胎组织（特别是气囊组织）而实质上对胚胎无病原性的减毒或无毒微生物的使用。接种的较佳部位是与气囊相关联的组织，如气囊膜，本发明的经修饰的微生物被认为是能移生于气囊膜的气囊侧而对发育中的胚胎实质上无病原性，即不引起胚胎死亡，或与野生型微生物相比减少胚胎死亡。然而，这样的微生物如接种到胚胎组织的不同部分，可显示某种程度的病原性。
对本发明的实践有用的较佳微生物为Salmonella，Shigella，Klebsiella，Enterobacter，Serratia，Proteus，Yersinia，Vibrio，Aeromonas，Pasteurella，Pseudomonas，Acinetobacter，Moraxel-la，Flavobacterium，Mycoplasma和Escherichia coli。这些微生物在受到减毒或灭毒后，对于诱导对野生株或对或其表达的抗原如重组体抗原的免疫反应是有用的。更佳的微生物包括沙门氏属，如Salmonella typhimurium，Salmonella paratyphi A或C，Salmonel-la schottmulleri，Salmonella choleraesuis，Salmonella montevideo，Salmonella newport，Salmonella enteritidis，Salmonella galli-narum，Salmonella pullorum，Salmonella abortusovi，Salmonella abortus-equi，Salmonella dublin，Salmonella sofia，Salmonella havana，Salmonella bovismorbificans，Salmonella hadar，Salmonella arizonae和Salmonella anatum，以及所知的感染鸟类特别是禽鸟的其他微生物。特别好的是选择表达与一种或一种以上其他沙门氏菌种免疫相关的抗原的沙门氏菌，以促进种间交叉保护。
较佳的沙门氏菌为按脂多糖抗原的血清学试验而定的B、C（包括C1和C2）及D组沙门氏菌。更佳的沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）和肠炎沙门氏菌（S.enteritidis）。最佳的微生物是鼠伤寒沙门氏菌。
通过在诸如氨基酸或维生素或其他必需分子的生物合成途径中诱导突变，使微生物如沙门氏菌属特别是鼠伤寒沙门氏菌得到修饰。突变可影响丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸中一种或一种以上氨基酸的生物合成。突变的较佳部位是芳香族维生素生物合成途径，特别是aro途径。在此途径中，磷酸烯醇丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸缩合生成3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸。该途径继续通过一系列中间体如莽草酸盐、分支酸盐和邻氨基苯甲酸盐，得到L-色氨酸。从分支酸盐，得到诸如以下分子：对氨基苯甲酸盐（导致叶酸）、对羟基苯甲酸盐（导致辅酶Q）、3，4-二羟基苯甲酸盐（导致维生素K）和预苯酸盐（导致L-苯丙氨酸和L-酪氨酸）。突变的较佳部位是在分支酸盐前的基因上，更佳在一个或一个以上aroA、aroB、aroC或aroD上。选择最佳突变部位以使微生物减毒或无毒，而保留微生物侵袭和移生组织的能力。这种突变体是在aroA基因上。
很多技术可用来修饰微生物，以引起生物合成途径上的突变。一种合适的技术涉及使用可转位成分如转座子。转座子是双股DNA的片断，它通常包含抗抗生素或其他可选择标志物及引起在微生物基因组的一个或多个部位插入转座子所需的基因。
通过确定微生物的营养缺陷型要求从功能上和/者从遗传学上，例如用合适的探针杂交，可确定插入受试微生物基因组的转座子的定位。经修饰的微生物可被使用，它有转座子插入靶基因，或可通过如抗生素耐药性的丧失或可选择标志的缺失，可选择转座子的缺失。转座子的切除常常伴随邻近DNA的切除，导致靶序列的缺失。在这方面较佳的缺失类型导致2个或2个以上核苷酸的缺失，较佳地导致2-5个核苷酸的缺失，更佳地导致5个以上邻近的核苷酸的缺失。
用诸如转导、接合和转化等技术可促进特定微生物的突变。例如，可用一般的转导噬菌体（如P1或P22）转导非功能性生物合成基因，如用从原宿主插入（或切割）转座子到新的靶微生物中而使其失活。噬菌体（如P1或P22）宿主范围宽，因而在生物界产生相同突变的可能性增加。可应用的接合，其涉及将致病株和在生物合成基因上具有所需的非回复性突变的非致病株的交联。通过与F-致病株交联，可从Hfr或F+株出现突变基因的转化，引起野生型基因被突变基因重组替换。这些技术的应用在两个或两个以上生物合成途径上引起两个或多个独立的突变体方面是特别有用的。这些技术还可用来从其他种系或鸟病原体产生异种抗原。
用于禽鸟的范例性和最佳微生物为S.typhimurium株STM-1。令人吃惊地发现，这株S.typhimurium能移生于气囊膜的气囊侧，而在移生后对胚胎无特别致病性。还令人吃惊地发现，该菌株能在胚胎和新孵化的鸟中侵袭和移生组织，使对致病型微生物或免疫相关的微生物建立免疫反应。S.typhimurium的举例决不在于将本发明限制于该微生物，本发明延伸到能用作本文所述卵内活疫苗的所有经修饰的微生物。
S.typhimurium STM-1的样品于1993年10月26日保藏于the Australian Government Analytical Laboratories （a Budapest Treaty Depositry），1 Suakin Street，Pymble，New South Wales，2037，Australia，受理号为N93/43266。亲本野生株原始分离自感染有沙门氏菌的饲养鸡。然后用噬菌体P22转导将从S.typhimurium LT2得到的aroA基因Tn∶10插入的转座子转导到S.typhimurium STM-1中。然后选择仍然是aroA-的转座子缺失突变体。S.typhimurium STM-1还是对丝氨酸的营养缺陷型。
根据本发明的这一方面，提供了适于用作卵内活疫苗的经修饰的沙门氏菌。该经修饰的沙门氏菌在编码生物合成途径的酶的基因上携带了事实上为非回复性的突变。更特别的是，本发明提供了适于用作卵内活疫苗的S.typhimurium突变株。该突变株在编码所述微生物分支酸盐生物合成所需的酶的基因上携带了事实上为非回复性的突变。突变以在aroA、aroB或aroC为佳，以在aroA为更佳，而更佳的是，微生物在另一生物合成途径如色氨酸的生物合成途径携带一个或多个突变。最佳的是，微生物为S.typhimurium STM-1。
本发明的经修饰的微生物被用在卵内疫苗的制备上。根据本发明的这一方面，提供包含在编码生物合成途径的酶的基因上携带事实上为非回复性突变的经修饰的沙门氏微生物的卵内疫苗。更特别地，本发明提供包含在编码所述微生物分支酸盐生物合成所需酶的基因上携带事实上非回复性突变的S.typhimurium突变株的卵内疫苗。突变和微生物以上文所限定的为佳。更佳的是，含有S.typhimurium STM-1的卵内疫苗。
本发明的疫苗组合物必须适于蛋的注射应用。疫苗可包含单一类型的经修饰的微生物，也可根据是否需要多价疫苗而包含2种或2种以上类型。组合物还必须具有足够的流动性，使易于注射，还应不含污染的细菌或其他生物。在这方面，一种常规的方法是使用经修饰的微生物，它抗特定的抗生素，因而在疫苗组合物中存在该抗生素的情况下能保存该微生物。抗生素的存在会杀灭或抑制污染生物的生长。
术语“多价”疫苗是在其最全面的意义上使用的，并延伸到能对直接在经修饰的微生物上表达或被经修饰的微生物表达的至少2个抗原表位激发免疫反应的经修饰的微生物。在这点上，多价疫苗包括诸如能对在经修饰的微生物上或被经修饰的微生物表达的2个不同的抗原表位诱导抗体反应的微生物，这2个或多个表位是经修饰的微生物所固有的。然而，更通常的是，多价疫苗包括经修饰的微生物，其能对所述微生物的致病型及所述微生物表达的不是微生物所固有的，异种抗原（如重组抗原或转导、接合或转化）产生免疫反应。在这一点上，多价疫苗是指2种或多种病原体。
较佳的多价疫苗是能对一种或多种沙门氏菌及对来自一种或多种选自微生物、蠕虫、原生动物、酵母菌和病毒的鸟类病原体的至少一种抗原表位产生免疫反应的疫苗。本发明这方面所涉及的沙门氏菌包括一种或多种Salmonella typhimurium，Salmonella paratyphi A或C，Salmonella schottmulleri，Salmonella choleraesuis，Salmonella montevideo，Salmonella newport，Salmonella enteritidis，Salmonella gallinarum，Salmonella pullorum，Salmonella abortusovi，Salmonella abortus-equi，Salmonella dublin，Salmonella sofia，Salmonella havana，Salmonella bovismorbifi-cans，Salmonella hadar，Salmonella arizonae和Salmonella ana-tum..
更佳地，免疫反应是就S.typhimurium和/或S.enteritidis而言。本发明这方面涉及的非沙门氏菌鸟类致病原包括从鸟类造白细胞组织增生、网状内皮组织增生、感染性支气管炎、感染性粘液囊疾病、Newcastle’s病、腺病毒疾病、呼肠病毒病、痘病、喉气管炎、鸟流感、感染性鼻炎、鸡伤寒、隐孢子菌病、球虫病和禽霍乱中一种或几种病原体所得的一种或几种抗原表位的致病原。
较佳的致病原是艾美球虫属（Eimeria），如Eimeria acervulina，Eimeria mivati，Eimeria mitis，Eimeria praecox，Eimeria hagani，Eimeria necatrix，Eimeria maxima，Eimeria brunetti和Eimeria tenella。最佳的艾美球虫是E.tenella。
按惯例，经修饰的微生物以冻干状态或可在冰冻条件下保存。这样的条件包括，例如，于-70℃下贮存于甘油或其他合适的介质中。通常，经修饰的微生物贮存时，每剂重建的疫苗含最低限度为106-1012个可存活浓度的细胞。贮存的经修饰微生物在简单的生长培养基如营养肉汤或补充了酵母提取物的胰蛋白酶大豆肉汤中可以容易地重建。胰蛋白酶大豆肉汤含酪蛋白和大豆粗粉的消化物及右旋糖、氯化钠和磷酸二钾。当培养大容量疫苗培养物时，最初特别方便的是培养200-700ml培养物，并用此培养物接种7-15升生长培养基。然后将这些大容量培养物接种生产发酵罐。用诸如光学密度等任何可利用的方法监测发酵罐中培养物的生长。当光学密度是生长参数时，培养生物量保留在峰密度，检查纯度，然后冷却、浓缩，在冷冻干燥前与适当的载体混合。当贮存技术是冷冻干燥时，可用灭菌氮气重新充填含培养生物量的样品。冻干的培养物可以任何合适的稀释剂重建，然后用于立即注射到卵中。可使用任何合适的载体，最佳载体为脱脂乳粉。其他可用的载体包括水、乙醇、多元醇（如甘油、丙二醇和液状聚乙二醇等）、植物油及其合适的混合物。
本发明进一步涉及免疫新孵化的鸟抗病原微生物感染的方法。该方法可进而或选择地发展对重组抗原产生免疫反应。本发明方法是通过卵内给予一定量一种或多种减毒或无毒的经修饰微生物而完成的，这些微生物能对相应的“野生型”微生物，对免疫学上有交叉反应的微生物和/或对在经修饰的减毒或无毒微生物中表达的任何异源性或非固有的（如重组体）抗原产生免疫反应。经修饰的微生物也可竞争性地排除组织中的其他生物体和/或全面促进鸟类宿主的免疫反应。
在一较佳实施方案中，经修饰的减毒或无毒微生物能以接种量移生于孵化前或孵化后的鸟组织，而对孵化力和/或其后小鸟的存活性基本无不良效应。根据本发明的这个较佳方面，提供在新孵化的鸟上对一种或多种病原微生物引起免疫反应的方法，所述方法包括卵内给予一定量能有效地移生于所述鸟的一种或多种组织的减毒或无毒微生物，其中所述减毒或无毒微生物在编码所述微生物分支酸盐生物合成所需酶的基因上携带突变体（如核苷酸的缺失，替代或加成）。
较佳的移生组织包括，但不限于，心、肝、小肠、法氏囊和气囊。为达最好结果，接种有效量在每卵102-1014菌落形成单位（cfu）的范围内。接种量决定移生的程度和孵化后免疫反应的持续时间，并因所用微生物的类型而异。较佳的接种包括约101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、cfu/卵。更佳的接种包括约102-1010cfu/卵。最佳的接种是在5×102-5×104cfu/卵。当疫苗接种到气囊中时得到最好的结果，疫苗中的微生物在此移生于气囊膜的气囊侧。孵化前，胚胎穿破气囊膜，与微生物接触，然后，在孵化前、孵化时和/或孵化后，微生物移生于胚胎的一种或多种组织。
在接种期的后一半时间，减毒或无毒微生物一般接种到整个卵中。例如，对于鸡，一般从孵育的第12天至约孵育第20天接种卵。较佳地在第14天至约第19天接种，更佳地在约第15-18天接种鸡卵。对于鸭卵，较佳的接种时间从约第16天至约第27天，更佳地从约第18天至约第26天，甚至更佳地从约第22天至约第24天。
本发明还延伸到在孵化前接种疫苗的受精卵。这些卵方便地包装待售，有或无其后孵育的指令。
根据本发明的这一方面，提供用经修饰的微生物接种气囊的禽鸟的受精卵，该经修饰的微生物
（a）对一种或一种以上生长因子呈营养缺陷型，因此在缺乏所述一种或一种以上生长因子的最低限度培养基上不能生长;
（b）能在胚胎破裂通过气囊后移生于一种或一种以上孵化前的胚胎组织;及
（c）能在孵化前或刚孵化后的胚胎中，引起对所述微生物的致病型或具有免疫交叉反应的微生物或携带所述无毒微生物表达的抗原决定簇的致病性生物或病毒的免疫反应。
接种可方便地通过注射来完成，一般注入气囊。微生物移生于气囊，鸟在孵化前，破裂通过气囊后暴露于微生物。然后，鸟可经呼吸道和/或口腔摄入微生物。尽管气囊是卵内接种的较佳途径，其他区域如卵黄囊，或绒膜尿囊液也可被注射接种。在接种到卵黄囊或其他液体中时，较低量接种通常较好，以及/或用生长率降低的减毒或无毒生物体以减少胚胎的死亡。在任一情况下，当气囊不是接种对象时，虽然不是商业上不可接受的水平，但孵化率可能轻微降低，注射的技巧对本发明的实践不是关健的，但最好针头对卵或发育中的胚胎组织或器官或围绕胚胎的胚胎外膜不产生过分的损伤。
配以约22＃针头的皮下注射器一般是合适的。本发明的方法特别适于使用自动注射系统，如美国专利No.4，903，635;5，056，464和5，136，979中所描述的那些系统。
本发明特别适于保护禽鸟如鸡免受沙门氏菌感染。根据本发明的较佳方面，为禽鸟提供包含减毒沙门氏菌的卵内活疫苗，该减毒沙门氏菌
（a）对一种或一种以上生长因子呈营养缺陷型，因此在缺乏所述一种或一种以上生长因子的最低限度培养基上不能生长;
（b）能移生于一种或一种以上孵化前的胚胎组织;及
（c）能在孵化前或刚孵化后的胚胎中，引起对所述沙门氏菌的致病型或具有免疫交叉反应的沙门氏菌或携带所述无毒沙门氏菌表达的抗原决定簇的致病性生物或病毒的免疫反应。
该疫苗较宜应用于接种到气囊中以使胚胎破裂后通过气囊真正地暴露于疫苗。用作被修饰的微生物的较佳沙门氏菌是Salmonella typhimurium，Salmonella paratyphi A或C，Salmonella schottmulleri，Salmonella choleraesuis，Salmonella montevideo，Salmonella newport，Salmonella enteritidis，Salmonella galli-narum，Salmonella pullorum，Salmonella abortusovi，Salmonella abortus-equi，Salmonella dublin，Salmonella sofia，Salmonella ha-vana，Salmonella bovismorbificans，Salmonella hadar，Salmonella arizonae和Salmonella anatum..更佳的被修饰的微生物为S.typhimurium或S.enteritidis。突变通常在芳族生物合成通路上，如在aroA、aroB、aroC或aroD。最佳在aroA。
本发明的这些方面和其他方面用如下非限制性实施例作进一步举例说明。
实施例1
鼠伤寒沙门氏菌STM-1
来源
母本野生株鼠伤寒沙门氏菌分离自the Veterinary Research Institute，Parkville，Victoria，Melbourne，Australia的沙门氏菌感染的饲养鸡。分离物以冷冻培养物形式贮存。突变株S.typhimurium LTD 1545株（aroA Tn：10）来源于Dr J Roth，U-niversity of Utah，USA。通过噬菌体转导，用P22将aroA Tn：10从1545株转导到从饲养鸡分离得到的野生型S.typhimurium，将STM-1突变株传代。选择插入转座子Tn：10的突变株，然后分离转座子缺失的aroA缺失突变株。该突变株称作S.typhimurium STM-1，样品于1993年10月26日保存于
Australian Government Analytical Laboratories，1 Suakin Street，Pymble，New South Wales，2037，Australia，获受理号N93/43266。
培养基
补充有酵母提取液（1%W/V）的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）用于制备种子培养物和生产活疫苗。TSB含酪蛋白和大豆粗粉的消化产物，以及右旋糖、氯化钠和磷酸二钾。培养基在用前于121℃高压消毒锅灭菌。脱脂牛奶用作冻干的冷冻保护剂。
含酪蛋白的生长培养基在使用前用高压消毒锅121℃灭菌。在疫苗的冷冻干燥中用澳大利亚产脱脂乳粉。该物质在非灭菌条件下得到，使用前送往澳大利亚悉尼的Ansell-Steritech实验室作2.5兆拉德（megarads）γ-辐射。
将粉末生长培养基溶于蒸馏水，121℃灭菌至少15分钟。将脱脂乳粉在卡纸盒中包装成1kg量，用来作2.5兆拉德γ-辐射。释放消毒粘贴标签用作γ-辐射的效果测定，在确认灭菌时γ-辐射指示剂已变色，在冷冻干燥前，将灭菌的脱脂乳与发酵后的培养物搅拌混合并浓缩。
鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）STM-1的特征
S.typhimurium STM-1是aroA-和ser-。该微生物在最低限度培养基上不会生长。STM-1具有符合于其生长需要对氨基苯甲酸（PABA）和对羟基苯甲酸（PHBA）的aroA缺失微生物的生长特征、Tn：10转座子的插入及在近STM-1的aroA基因处其相继的缺失导致沿丝氨酸的生物合成通路的另一突变。这得到如下支持：在补充了芳族通路所有终产物的最低限度培养基上不生长，而只有当培养基中加入丝氨酸或既加甘氨酸又加胱氨酸时才出现生长。丝氨酸缺失不限制体内试验中突变株的生长。
用H2S阴性可容易地从生物化学上将STM-1与其亲本株及相关株区分开来。在XLD琼脂上STM-1的生长以出现粉红菌株为标志。在MacConkey’s琼脂上的生长见于明显的特征性沙门氏菌乳糖（Lac）阴性菌落的出现。
STM-1株与其亲本一样链霉素、新生霉素和镰孢菌酸，与亲本株不同的是对青霉素和磺胺异噁唑显示较大的敏感性。
在血清学上，STM-1菌落和肉汤对多价“0”抗原和B组沙门氏菌抗原试验呈阳性。
STM-1微生物具有与其野生型亲本同样的可检出质粒组合物，有在23kb、27.5kb（见图1）的质粒和在60-100kb范围内的两个较大的质粒。野生型和STM-1均表达11KDa隐性质粒。
S.typhimurium STM-1事实上是非致病性的，比其亲本致病性弱10，000倍以上。在小鼠模型上野生型亲本和STM-1的侵袭力比较表明，突变株能侵入甚至保留在脾中几天而不引起临床疾病（图2）。在整个10天期间，感染STM-1的小鼠无一死亡，从其皮毛色泽上判断，所有小鼠均健康。相反，在感染后5天，所有感染野生型株的小鼠显现弓背和蓬松不健康的皮毛色泽。感染后约第8天，所有野生型株感染小鼠均死亡。约第6天，在感染野生型株的小鼠的脾脏中有野生株的增殖，存活计数超出接种剂量的存活数，而STM-1的存活计数从未达到高于105CFU/ml的计数。结果见表1。
表1
（）表示与对照小鼠相比脾脏体积的增大
经口或腹腔接种STM-1、再以野生型株10×LD50攻击的小鼠，受到保护，能抗沙门氏菌。记录接种后10天期间的脾大数据。野生型感染小鼠脾大显著，而STM-1感染小鼠脾大是轻微的，第3天达峰值，约第10天迅速降至正常大小。对照株不显示脾脏体积增大。图2至图5比较了STM-1和野生型株的生长特性。
根据本发明，在广泛的鸡试验中经口、皮下（SC）和腹腔（IP）途径使用STM-1。口服滴度应用到1.2×1010，未见引起疾病。事实上，表明接种疫苗的鸡一致地，明显地重于相应的接种对照物的鸡。
实施例2
母本和生产种子的制备
S.typhimurium STM-1培养物的生长同上。将培养物用于接种100ml补充有1%W/V酵母提取液的含TSB生长培养基。将肉汤于37℃振摇培育过夜。用革兰氏染色、在血琼脂上生长、在XLD琼脂、MacConkey′s琼脂和三糖铁（TSI）肉汤中生长，保证培养物的纯度。在灭菌脱脂乳存在下，将培养物冷冻干燥，使每一安瓿含109个微生物。这便是母本种子。
然后，按同样的过程，用1安瓶母本种子制备一批生产种子。母体和生产种子安瓿贮存于-20℃。
实施例3
疫苗的制备
用2安瓿生产种子接种2个抽吸瓶，每个瓶含约500ml生长培养基（TSB+酵母提取液），开始生长过程。每500ml培养物用来接种在硼硅酸玻璃大瓶中的10升生长培养基。再将大瓶用来接种生产发酵罐。直至大瓶培养阶段的所有操作均在生物危害培育箱或层流培育箱中无菌操作。大瓶培养物转移到发酵罐通过蒸汽灭菌管/硬管件连接而达到。
6-8小时后，如果接种物是粘稠的混浊物，用革兰氏染色和纯度板显微镜检为纯品时，将接种物转移。通过蒸汽消毒的接管将培养物连接于不锈钢发酵罐。并用来接种发酵罐内容物。用光学密度监测培养物在发酵罐内的生长。在峰密度时，使培养物通过连续流动式离心机以获得浓缩生物团块，并再测纯度。在此过程中，培养物冷却。将冷却的浓缩物与灭菌脱脂乳粉混合，混合物填充入准备冷冻干燥的药用玻璃瓶。在冻干循环末，盖上橡皮塞前，用灭菌的干燥氮气重新填充瓶子，并从冷冻干燥机中移除。每个瓶子加上铝环形圈封盖。接着给瓶子贴标签，包装进用于发送的进纸箱。在启用前，检验疫苗的效价，安全性、水分含量、纯度和同一性。
实施例4
疫苗的安全性和效能
实施例1提供了STM-1缺乏毒力的数据。下面阐述口服和皮下注射STM-1的一系列实验，证明该微生物的安全性和效能。
实验1
设计一剂量反应实验以确定在鸡血清产生强烈抗体（IgG）反应而对鸡无不良反应的口服所需的STM-1剂量范围。分四组，各25只鸡：对照组每只鸡接受100ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）（0.145MNaCl、0.01M磷酸钠[pH7.1]），3个接种组每只鸡分别接受104、106或1010STM-1。这些鸡均在1日龄时接种。接种后第7、14、21和28天从每组5只鸡取血。用酶联免疫吸附试验（ELISA）检验从这些血得到的血清对经超声处理STM-1的体液应答。低剂量（1×104）细菌不产生明显的IgG应答，中剂量（1×106）在鸡接种后第21和28天产生明显的应答，高剂量（1×1010）在鸡接种后第7、14、21和28天产生明显的应答。
实验2
将实验1中收集到的信息用于检测经口和皮下接种109STM-1的鸡血清和肠洗出液中的IgG、IgM和IgA应答反应。在经口和皮下接种的鸡上这一体液应答的检测用来提供这些接种途径引起的抗体应答水平的信息。4组1日龄鸡作了接种。2组各30只鸡接种STM-1，一组经口、另一组皮下接种。另2组各22只鸡经口或皮下接受PBS。接种后第7、14、21和28天时从每组5只鸡取血。在所有鸡被杀和取出肠子制备肠洗出液前，在和取血相同的日子，从经口接种的鸡取粪拭子。用ELISA法检测从这些鸡得到的血清和肠洗出液对STM-1抗原的IgG、IgM和IgA应答。
在7日鸡的血清和肠洗出液中未检出抗体反应。最初检出的有统计学显著意义的抗体应答是14日鸡血清中对超声处理的STM-1的IgG应答和对STM-1脂多糖（LPS）的IgM应答。首次对STM-1LPS的有意义的IgA应答是在21日鸡血清中检出的。经口接种鸡的肠洗出液中的抗体应答限于IgG和IgA，在21日鸡肠洗出液中检出的应答是对STM-1LPS的IgG应答。有趣的是，在血清中未检出对STM-1 porins或在肠洗出液中未检出对任何STM抗原的有意义的IgM应答。
表2和图6、7和8概括了这些发现。表2和图9、图10还显示了用STM-1皮下免疫的鸡的体液应答。
首次有统计学意义的IgG、IgM和IgA应答在14、7和21日鸡的血清中检出。IgM应答针对所有3种抗原，包括STM porins。在肠洗出液中无抗体反应检出。肠洗出液中对STM-1的高度IgG应答和血清中对STM-1porins的IgM应答见于28日对照鸡。然而，当STM-1 LPS用用ELISA测定的抗原时，不能检出抗体反应的水平的这一升高。
皮下接种1×108STM-1、7天后用1×108有毒S.typhimurium皮下攻击的鸡全部存活，而未接种组也用1×108有毒S.typhimurium皮下攻击却全部死亡。在以有毒S.typhimurium经口攻击前经口接种STM-1的鸡停止排泄未接种前鸡排出的微生物。在实验中，没有鸡死亡，但在攻击后均排泄有毒微生物。然而，约在攻击后35天，粪拭子显示所有接种鸡均停止排泄有毒微生物，但30只未接种鸡中超出10只仍排泄微生物。
实施例5
鼠伤寒沙门氏菌STM-1对体重增长的效应
为了测试经口接种STM-1对鸡体重增长的效应，将鸡经口接种并称重。结果见表3。
鸡经口接种1×109或5～109STM-1不影响鸡的体重增长，因为接种的鸡比同龄对照鸡体重明显大。在实验室经历的和表3中所显示的体重增加也见于饲养场试验中。
表3
经饮水接种STM-1的Broiler Chickens的体重和死亡率（按日计）
实施例6
疫苗株的播散和存留
当鸟类保持高密度聚居时，疫苗对鸟类显示出播散作用。在实验室鸡群（其中只有2只被接种）中研究STM-1的播散，揭示了当鸡群密切接触并养在硬地上时，该/微生物迅速播散。粪拭子揭示所有鸡在5天内排泄该微生物，但约第14天时从鸡中消除。
然而，在饲养场条件下，地面不同，鸟的距离较大，鸟与鸟的传递有明显减少。事实上，鸟与鸟的传递率不足以引起保护反应。在饲养棚试验中仅60%接触的鸟显示STM-1播散，但不能达到提供保护反应的水平上。
在实验室中，STM-1如果给予1日龄鸡，第28天后不能分离出来，接种后第7、14、21和28日取的粪拭子揭示，经口接种的鸡仅在试验的前两个取样时间排泄该微生物。饲养场试验结果显示了类似的模式。
表4列出的是在30，000个鸡的饲养场试验中STM-1的分离率。
表4
表示为STM-1数日的S.typhimurium STM-1分离率
1.1只从死亡者得到的肝，直接培养和通过肉汤增菌培养
2.由培养物直接检测和增菌培养后检测均阳性
3.仅经含硒增菌培养后呈阳性
4.一份标本因异常的过度生长而丢弃
5.由棚地面的盲肠喷出滴液
6.在免疫棚与对照棚中，每棚均有4株鉴定为Salmonella sofia的菌被分离得，但无STM-1发现。
7.在免疫组30棚中有3棚系Salmonella sofia
8.在对照组30棚中有6棚系Salmonella sofia
环境拭抹和从一个试笔和2个商用供焙烤小鸡的棚分离STM-1的结果表明，接种疫苗后，超过21天，STM-1即不再保留于环境或鸡体内。
将STM-1在含1%W/V酵母提取物的TSB中继续传代，连续传10代。将10ml一份培养物加到预温过的新鲜培养基中，37℃孵育过夜。此过程每天进行，连续10天。在每次传代时，评估培养物的纯度，aroA缺失的存在和细胞数。每次传代时的细胞密度约为5×109/ml。完成10次传代时，确认微生物为STM-1。由于该微生物不能在鸟-鸟接触传代上以足够的量充分地直接传代过第三代，因此在代与代之间增菌的方案被用于鸡的传代。钭细胞密度5×109的STM-1经口接种于24日龄鸡。24小时后，收集粪拭子，在含硒肉汤中增菌，并筛择STM-1。然后将再分离得的STM-1菌在TSB+1%W/V酵母提取物中37℃培养过夜，将5×109个菌（约1ml过夜培养物）接种到第2只鸡上，如此下去，共传代10次。将每次传代得到的分离菌和任何沙门氏菌样分离株进行全面特性鉴定（不能发现沙门氏菌变异株），最终分离菌被确认为STM-1。
本研究表明，STM-1可用作控制沙门氏菌病的工具，及为肠道致病原中的抗原提供媒介物。肠中的繁殖增生确保了所选择的抗原能长时间保留并方便宿主的防御机制所识别。该细菌即使在高接种剂量（1.2×1010）下也无不良反应，并可能有促进生长效应，表明STM-1具有前生物潜能。
实施例7
孵育18天时卵内气囊接种鼠伤寒
沙门氏菌突变株STM-1后在小鸡器官的“孵化前”和“孵化后”增殖。
本实验的目的是测定以不同水平疫苗卵内接种后第18天时，STM-1的组织移生和粪便排出。
将孵育16天的蛋保留在孵育箱内，每天常规翻动2次。将新孵化的鸡在标准红外小鸡饲养灯下分组饲养。任意饮水，使用无化疗饲料。在孵育的第18天，给鸡胚卵内接种108菌落形成单位（cfu）或104cfu的S.typhimurium STM-1生长培养物。给予方式是直接接种到蛋的气囊中。在另一实验中，将106cfu或104cfuSTM-1突变株给蛋接种。
结果
无论接种104、106或108cfu，孵化的小鸡均在孵化后最初3天排出疫苗株。在3-12天之间，从接种STM-1株的鸡有显著的排出。在长达8天内，从每蛋给108cfu的全部小鸡和每蛋给104和106cfu的大部分小鸡的所有器官均培养出STM-1突变株。作为例子，从接种104cfuSTM-1的蛋孵出的4日小鸡（5只）显示如下组织的有菌繁殖：
4/5 心
5/5 肝
5/5 小肠
5/5 盲肠
这些结果表明，可在第18天给蛋接种突变株STM-1，每蛋104-108cfu，对孵化率和其后鸡的生存力无不良反应。第18天卵内接种疫苗后，该微生物在小鸡广泛的器官和组织中繁殖，并有微生至少在孵化后8天期间内存在有微生物的排出。
实施例8
卵内接种STM-1抗有毒S.typhimurium皮下攻击的效应
本实验的目的是测定卵内接种含STM-1疫苗是否保护鸡在孵化后7天皮下给S.typhimurium时不发生临床效应。
材料和方法
效应的主要标准是死亡率。第2个量度是特异的粪便排出和器官中增殖。
将蛋在孵育18天时接种104或106STM-1，小鸡孵化后第7天用比野生型S.typhimurium的LD50大1倍或100倍的剂量攻击。每个接种疫苗剂量，有2组，各10只鸡，以106或108cfu皮下攻击，而第3组各10只鸡不受攻击。3组各10只未接种疫苗的鸡用作对照，2组受攻击，1组不受攻击。每天两次监测所有鸡的健康。在指定的日子，通过培养泄殖腔拭子监测所有鸡的粪便排出。在所有死亡的鸡上测定器官中增殖，而每组存活的鸡在攻击后第14天处死，培养指定的器官。
攻击株是S.typhimurium 82/6915株。
鸡接受装在10kg真空密封的多层纸和PVC容器中的经γ-辐射处理的无化疗饲料（Barastoc Stock Feeds，St Arnaud，Victoria，Austrialia）每盒分别测试沙门氏菌的存在。
按一般经验，将孵化的小鸡在红外加热灯下饲养，在整个试验阶段任意摄食和饮水。
将40只蛋一组分别以每蛋104cfu和每蛋106cfuSTM-1接种，以保证在孵化后第7天每剂量有至少30只鸡可用于攻击。
结果
1.孵化力
接种106cfu/蛋、104cfu/蛋和不接种疫苗的蛋的孵化率见表5。
表5
孵化力
2.用S.typhimurium攻击
以每只鸡108cfu野生型S.typhimurium攻击的未接种鸡在最初72小时内迅速死亡。11只中10只死亡。在每只鸡以106cfuS.typhimurium攻击的接种鸡上，9只中2只死于最初72小时。以108cfu攻击的接种小鸡，8只中4只死于攻击后最初72小时。接种104或106STM-1之间略有差异。
与未接种组相比，两组的结果表明接种疫苗的步骤提供显著水平的保护。
皮下给予108cfu/鸡的攻击剂量被测得为该沙门氏菌分离物LD50的100倍，令人吃惊的是，该攻击微生物并非总是压倒卵内接种疫苗的鸡的免疫系统。使用每只鸡106cfu致病性沙门氏菌的较低攻击剂量组中，临床作用较慢发生。根据这些结果得出的结论是，卵内接种STM-1明显地保护小鸡，抗毒性野生型S.typhimurium的皮下攻击。
微生物学资料表明，卵内接种104和106STM-1后，孵化后第4天的小鸡中100%STM-1繁殖。在接种疫苗的鸟的粪便中该微生物的排泄长至第10天，而约第14天，38只接种疫苗的鸟中仅1只小肠中STM-1阴性。因此，卵内接种后，STM-1在鸡中有全身的繁殖。
实施例9
卵内接种鼠伤寒沙门氏菌STM-1抗毒性肠炎沙门氏菌皮下攻击的效能
本实验的目的是测定卵内接种含STM-1疫苗是否保护鸡抗的野生型S.enteritidis的皮下攻击。
材料和方法
效应的主要标准是死亡率。第二个量度是特异的粪便排出和器官中增殖。卵内接种每蛋104或106cfu疫苗，每鸡皮下给序5×107cfu攻击。鸡接受装在10kg真空密封的多层纸和PVC容器中的经γ-辐射处理的无化疗饲料（Barastoc Stock Feeds，St Arnaud，Vic-toria）。每盒分别测试沙门氏菌的存在。
按一般经验，将孵化的小鸡在红外加热灯下饲养，在整个试验阶段任意摄食和饮水。攻击株为S.enteritidis 446302株。
将蛋在孵育第18天接种104或106/蛋，小鸡在孵化后第7天接受攻击。
结果
未接种组、每蛋接种104cfu组和每蛋接种106cfu组的蛋的孵化百分率分别为87.2%、95.6%和69.6%。体重分别为49.0g、48.3g和45.0g。孵化率依赖于孵育箱的性能，每蛋接种106cfu的低孵化率可能因孵育箱而非因疫苗之故。
在以每鸡5×107cfu野生型S.enteritidis攻击的未接种小鸡中，有迅速死亡（第5天12只中11只死亡）。在以同量S.enteritidis攻击的接种疫苗小鸡中，在较长时间有不同型式的小鸡死亡。每蛋接种106cfu然后受攻击的，8只鸡中4只死于最初6天内，1只死于8天后。每蛋接种104cfu的，在攻击后第4-6天11只鸡中4只死亡，1只在第11天死亡，1只在第13天死亡。这些结果表明，与未接种疫苗组相比，接种过程提供程度明显的交叉保护。
皮下给予每鸡5×107cfu的攻击剂量被测得为该沙门氏菌分离物LD50的100倍。
孵化后鸡的血清IgG水平分析显示，接种疫苗的鸡比未接种的鸡有较高IgG水平。该结果表明，卵内接种在刺激小鸡的IgG反应上有效，所得结果至少与野生型沙门氏菌攻击幸存小鸡上所见的一样好。
研究确定了18天鸡胚接种104或106cfu STM-1均导致孵化时疫苗免疫组中100%有有效繁殖。卵内接种证实了对皮下给以5×107cfu剂量S.enteritidis的攻击有抗攻击的交叉保护。
实施例10
卵内接种鼠伤寒沙门氏菌STM-1抗毒性肠炎沙门氏菌经口攻击的效能
本实验的目的是确定17天时卵内接种S.typhimurium STM-1的小鸡在以S.enteritidis经口攻击后7天和14天是否有较少的组织中增殖。
材料和方法
效能的主要标准是特异的粪便排出和组织中增殖的测量。疫苗在卵内接种，每蛋102或104cfu，攻击经口给予，每鸡1×107cfu或每鸡6×108cfu。
鸡接受装在10kg真空密封的多层纸和PVC容器中的经γ-辐射处理的无化疗饲料（Barastoc Stock Feeds，St Arnaud，Victoria）。每盒分别测试沙门氏菌的存在。
按一般经验，将孵化的小鸡在红外加热灯下饲养，在整个试验阶段任意摄食和饮水。攻击株为S.enteritidis 446302株。
结果
疫苗对孵化力和平均体重的效应见表6。在孵化力或体重上无明显差异。
表6
在以毒性微生物（S.enteritidis）攻击后，仅1只鸡在攻击后期间死亡。这只鸡是从接种102cfu/蛋的蛋中孵出的。这可能是偶然死亡，而非由于沙门氏菌感染。
关于体重增长，在整个试验期间所有鸡是一致的。在孵化后第4天，卵内接种STM-1的50只鸡中49只排出疫苗株。结果见表7。
表7
-表示不可检出S.typhimurium
结果表明，接种过程是安全的，看来不影响孵化率或小鸡生存能力，并理想地适于大量供烤焙小鸡的孵化。
实施例11
在孵育第17天接种后鼠伤寒沙门氏菌STM-1卵内复制能力的测定
本实验的目的是评估经气囊接种102cfu/蛋或104cfu/蛋STM-1后在4天孵育期间（孵育的第17-21天）匀浆化卵内组织中可重获的S.typhimurium STM-1微生物的量。
材料和方法
在孵育的第17天，通过壳将STM-1微生物接种到气囊空间中。主要的量度是测量孵育后一系列指定的时间间距内蛋壳组织上的STM-1菌落形成单位。
将孵育17天的蛋按如下接种：
18只蛋每蛋102cfu;
18只蛋每蛋104cfu。
通过26＃针头接种到气囊中。在接种疫苗后21/2、26、45、69和100小时，将蛋打成匀浆并培养。
用Waring混合器制匀浆。加入含50ml营养肉汤+1%W/V酵母提取物和50mlPBS的100ml混合液体。将内容物低速匀浆60秒，保留用于培养。
结果
在21/2小时测试时，任何稀释液中均无STM-1菌落存在。在孵育后26小时时，在一个蛋（接种了104cfu/蛋）中，在100μl和1.0ml板上记录到STM-1（分别为2和8个菌落，1只蛋的估测量为1.2×103cfu）。在这个时间以后，在所有受试蛋中出现STM-1复制的显著增加。结果见表8：
表8
结果表明，最初至少45小时有一个起始的静止相，无明显的卵内STM-1微生物复制。在45-100小时期间，有明显的STM-1复制。
实施例12
在孵育第14天卵内接种后鼠伤寒沙门氏菌STM-1卵内复制能力的测定
本实验的目的是评估在7天孵育期间（经气囊玷接种102cfu/蛋后孵育的第14-21天）中从蛋可重获STM-1微生物的量。
材料和方法
将STM-1微生物通过壳接种到气囊中。主要的量度是测量孵育后一系列指定时间间距内蛋壳组织内的STM-1菌落形成单位。
按如下所述接种孵育14天的蛋：
1.36只蛋，102cfu/蛋;
2.9只蛋，接种0.1mlPBS。
按如下所述接种孵育17天的蛋：
1.30只蛋，102cfu/蛋;
2.15只蛋，102cfu/蛋。
保留10只不处理的蛋作对照。
按实施例11所述将蛋制成匀浆，然后计数存在的微生物数来评估接种（指定剂量）后24、72、96和168小时细苗的复制。每个时间分析2只蛋。
结果：
24小时后复制：
17天＠1019.0×103cfu
14天＠1024.5×105cfu
阴性
17天＠1027.7×104cfu
2.1×104cfu
72小时后复制：
14天＠1021.8×105cfu
1.6×105cfu
17天＠1021.3×105cfu
0.2×105cfu
96小时后复制：
17天102＜104cfu
8.0×105cfu
17天1019.0×107cfu
8.0×106cfu
168小时后复制：
14天1024.0×106cfu
2.0×106cfu
接种的微生物无胚胎毒性。上面的结果显示在最初24小时中蛋内STM-1微生物明显复制的证据。
在早至孵育后第14天接种101cfu/蛋STM-1的蛋在第21天孵化前（168小时复制）含106微生物，表明STM-1微生物即使在低的起始接种时也能显著地复制。
在孵育期间分析胚胎组织及气囊的细菌生长。STM-1在卵内时不掺入器官/组织。细菌复制被证明是发生在气囊内。在孵化前当鸡突破气囊膜时，在发育中的鸡内就有STM-1的迅速复制。在孵化后第4天和第8天，在所有器官分离到STM-1，当然，对照组例外，在蛋中或从其中孵出的鸡中均无STM-1存在。
实施例13
在蛋的不同部位作卵内接种沙门氏菌后发育中胚胎的生存力
本实验的目的是比较卵内接种沙门氏菌到气囊、卵黄囊和绒膜尿囊膜（CAM）中后发育中鸡胚的生存力。
材料和方法
用1×106cfuSTM-1或S.typhimurium或S.enteritidis的有毒株进行气囊、卵黄囊和CAM内接种。本实验用孵育17天的蛋。所用的有毒沙门氏菌为S.typhimurium82/6915和S.enteritidis446382。
结果
本实验的结果如下：
气囊接种
STM-1 7/7孵出
S.typhimurium 2/4孵出
S.enteritidis 6/8孵出
卵黄囊接种
STM-1 1/7孵出(20天时1个蛋被啄碎,是
活的)
5/7死于第21天
S.typhimurium 7/7死于24小时内
S.enteritidis 7/7死于24小时内
CAM接种
STM-1 2/7孵出
5/7死于第21天
S.typhimurium 7/7死于24小时内
S.enteritidis 7/7死于24小时内
结果表明，经卵黄囊和CAM途径接种2种已知的沙门氏菌致病原，即S.typhimurium82/6915和S.enteritidis 446302，导致胚胎迅速死亡。这些接种途径模拟非胃肠道途径，如皮下给予孵出的鸡。
结果还表明，这两种已知的致病原经气囊给予同样接种剂量的某价效应。在S.enteritidis的情况下，对鸡生存力似无不良效应。
假设微生物在气囊内存留或复制，小鸡直至孵出前24小时内破裂通过气囊膜才被感染。
结果还表明，与其他两种已知的致病株比是S.typhimurium STM-1低致病性在STM-1接种到卵黄囊和CAM中后，鸡的生存力受损，但与接种已知的致病株相比，对胚胎的生存力危害不大。
实施例14
抗原表位在S.typhimurium STM-1中的表达
本发明扩展到含包括S.typhimurium STM-1的沙门氏菌属的疫苗，以免疫鸡，抗相同微生物的毒性型株或免疫学上有交叉反应的微生物。本发明还扩展到携带重组表达抗原例如从另一种鸟类病原菌来的抗原的沙门氏菌的使用。
很多可表达沙门氏菌中的基因序列的载体已被公开，根据本发明可被使用。这些载体包括Schodel et al.，vaccine，11：143-148，1993和Schodel et al.，J.Immunol.，12：4317-4321，1990。中描述的那些载体。或者，诸如转导、接合和/或转化等技术可用于沙门氏菌传化株这些株表达通常不与该特定菌株相关的抗原。这种经修饰的沙门氏菌株作为多价疫苗是有用的。
一旦产生经遗传学修饰的S.typhimurium STM-1株，就按本文所述方法将其接种到气囊中。通常在孵育的第17或18天进行接种。在孵出后，用致病剂攻击接受接种的小鸡，为此，分析抗原决定簇和/或进行血清学分析和/或进行微生物学分析。这种接种疫苗的鸡对抗原表位来源的毒型株应当显示如单独用STM-1接种蛋所出现的类似保护作用。
实施例15
Aro突变株的制备
按美国专利No.4，735，801;5，210，035和4，837，151所描述的方法制备Aro缺失突变株。所有这些文件以其整体结合于此作为参考。用携带插入aroA，aroB，aroC和aroD的Tn10转座子的噬菌体对野生型Salmonella，Shigella，Klebsiella，Enterobacter，Serrati-a，Proteus，Yersinia，Vibrio，Aewromanas，Pasteurella，Pseu-domonas，Acinetobacter，Moraxella，Flavobacterium和Es-cherichia coli作噬菌体转导。将得到的突变株作耐四环素选择。
按本文所述方法将经遗传学修饰的微生物（如沙门氏菌株）接种到气囊中。在孵出后，用野生型株攻击接受疫苗的小鸡。接种疫苗的小鸡显示抗毒性野生型株的保护作用。