人SFRP1变体及其应用技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及肿瘤抑制蛋白变体。
背景技术
SFRP，分泌型Frz相关蛋白(secreted frizzled-related proteins)，含有一个富
含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)，但缺少七次跨膜域，它可能与卷曲蛋
白(frizzled，Frz)竞争结合Wnt蛋白，从而抑制Wnt蛋白的过量表达。Wnt是一类分泌型糖蛋
白，对人体正常细胞增殖起调整促进作用。近期实验发现，抑制这种蛋白质作用的基因SFRP
发生异常时，Wnt蛋白质的机能会随之出现异常，使得癌细胞不断增殖，导致发生大肠癌。当
把正常的SFRP基因注入癌细胞后，就会控制癌细胞增殖和杀死癌细胞。研究表明，90％的大
肠癌患者与SFRP基因异常有关。
在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的活性位点进行特异性的突变和
取代，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性，申请人
通过大量的实验，针对SFRP1氨基酸序列中特定的位点进行了点突变，从而获得了比SFRP1
蛋白本身具有更高抑制活性的变体。
发明详述
本发明涉及亲本蛋白的分离的变体，其在至少一个对应于SEQ ID NO:1的成熟多
肽的位置34Y、39F、42D、50R、58C、63A、89E、100L、122L、137R、151W、174A、198I、220N、242D、
271M、286K或293E的位置包含修饰。具体而言，本发明的变体具有改善的抑制活性。
优选地，应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体为以下任一修饰：
34Y/A、39F/D、42D/R、50R/S、58C/G、63A/H、89E/A、100L/D、122L/R、137R/S、151W/G、174A/R、
198I/A、220N/S、242D/G、271M/D、286K/R或293E/L。
本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法，包括(a)培养宿主细胞；和(b)回收
所述蛋白变体。
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培
养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下
进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料
分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所
述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据
公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养
基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物
(lysate)回收。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养
培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析
(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型
(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，
Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
本发明的多肽用于制备相应的药物，去用于治疗癌症。
具体实施方式
1.SFRP1基因的获得
PCR扩增SFRP1的ORF区共314个氨基酸，模板为含有人类基因组的样本。两端引入
酶切位点BamHI和EcoRI，酶切后与用同样的酶消化的pET载体连接，转化大肠杆菌后挑单克
隆，测序。测得其氨基酸序列如序列1所示。
所用的引物序列如下，SFRP1的引物为(不去除终止密码不含his-myc)：
Sfrpl 3.1B(-)：F：5’-CGGGATCCATGGGCATCGGG-3’：
R：5’-CGGAATTCCGTCACTTAAACACGGACT-3’。
2.SFRP1变体的构建
突变点的引入
(1)根据相应的突变位点设计相应的诱变引物，采用PCR定点突变法在SFRP1基因
上把野生型对应的氨基酸位点进行突变；
(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶进行酶切，与经过相同酶切的
质粒PCDNA3.1片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
3.2.鉴定重组质粒：用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到
突变后的核苷酸序列。
4.PCDNA3.1-SFRP1变体质粒构建
将第二步构建获得的SFRP1变体基因的两端引入酶切位点BamHI和EcoRI，酶切后
与用同样的酶消化的PCDNA3.1连接，鉴定后，将质粒转染细胞株：7721肝癌细胞，检验SFRP1
变体能的抑制肝癌细胞生长的效果。具体结果如下：
表1 SFRP1变体过表达抑制细胞生长情况
通过上述结果可以看出，一些突变体对肝癌细胞生长的抑制活性相对于野生型
SFRP1蛋白有了大幅度的提高，可以进一步应用于肝癌治疗。
序列表
<110>李露青
〈120〉人SFRP1变体及其应用
〈160〉1
〈210〉1
〈211〉314
〈212〉PRT
〈213〉智人(Homo sapiens)
〈400〉1
1 MGIGRSEGGR RGAALGVLLA LGAALLAVGS ASEYDYVSFQ SDIGPYQSGR
51 FYTKPPQCVD IPADLRLCHN VGYKKMVLPN LLEHETMAEV KQQASSWVPL
101 LNKNCHAGTQ VFLCSLFAPV CLDRPIYPCR WLCEAVRDSC EPVMQFFGFY
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