一种葛仙米藻种的制备方法 技术领域：
本发明涉及微型藻类，更具体涉及葛仙米藻种的制备方法。
背景技术：
念珠藻是属于蓝藻门Cyanophyta蓝藻纲Cyanophyceae段殖藻目Hormogonales念珠藻科Nostocaceae的一类分布地域广、生态环境复杂、形态结构多样的藻类类群，其植物体胶状或革状，成熟植物体有球形、叶状、丝状、泡状等多种形状，中空或实心，营漂浮或着生生长。其原植体由许多直径数微米的纤细藻丝集结成群体，群体形状因“种”而异，如发菜(Nostoc flageliformeKütz.)、地木耳(Nostoc commune)、葛仙米(Nostoc sphaeroides)在新鲜状态下分别呈头发状、扁平耳状或小球状，干燥后程度不等地有所缩变，均具有丰富的营养价值，在《本草纲目》、《本草纲目拾遗》、《陕西中草药》、《梧州府志》、《全国中草药汇编》等医书中已有记载。念珠藻不仅在自然界普遍发生，而且自古以来都是我国民间的传统食物；其中葛仙米，学名：拟球状念珠藻，具有食疗、保健、滋补等功效，营养价值高，是典型的高蛋白、低脂肪、低热值的绿色保健食品；同时又具有药性，常食用能清热解毒，凉血明目，促进新陈代谢；葛仙米的天然生产状况已经衰落，需求和生产产量的矛盾不可回避。随着人类活动的加剧、旅游业的发展、以及过度的采集给生态和环境造成的破坏，使得自然资源日趋萎缩，葛仙米的现天然年产量不足一吨，由于其生长地逐渐缩小，产量在日趋减少。葛仙米在国内外市场很受欢迎，而现有的产量远远满足不了需求，有必要人工养殖葛仙米，以提高其产量，满足人们物质生活水平提高的需求。
中国专利文献：一种培养葛仙米地方法，申请号：99120005.5。该发明是一种培养葛仙米的方法，具体藻种制备中采用的方法是用氨苄青霉素除菌，然后纯培养并诱导藻殖段，最后对藻殖段进行培养，获得藻种。该方法操作复杂，需抗生素进行无菌纯化，藻种制备周期长，形成藻丝的数量相对较少，难以适应大规模培养藻种的需要。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种葛仙米藻种的制备方法，该方法通过选取藻种、清洗杀菌、匀浆、接种培养，得到大量的葛仙米藻种，本发明操作简单，效率高，周期短，适合葛仙米规大规模培养藻种的需要。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种葛仙米藻种的制备方法按下列步骤顺序进行：
1、将葛仙米球形群体用水洗净，置于70％-95％乙醇溶液浸泡10-40秒，去杂藻，然后在无菌水或培养液中清洗1-3次；
2、将葛仙米球形群体放入匀浆器中，加入葛仙米球形群体重量0.1-1.0倍的培养液，匀浆，成丝状藻浆；
3、培养液的配方为：
磷酸氢二钾20-60mg/L、
硫酸镁40-80mg/L、
氯化钙20-40mg/L、
柠檬酸4-8mg/L、
柠檬酸铁铵5-9mg/L、
乙二胺四乙酸二钠盐1-2mg/L、
碳酸钠5-30mg/L、
微量元素0.5-3ml/L、
余者为水；
其中微量元素为每1000毫升含：
硼酸1.5-3g、
氯化锰1-2g、
硫酸锌0.1-0.25g、
镍酸钠0.2-0.4g、
硫酸铜0.02-0.1g、
硝酸钴0.03-0.05g、
余者为水；
在培养液中加入其重量0.8-1.5％的琼脂，在灭菌锅灭菌10-20分钟，成固体培养基；
4、将丝状藻浆接种于固体培养基中，培养条件为18-33℃，光照强度为10-200μE·m-2·s-1，培养8-20天；
5、然后再接种在培养液中，培养条件条件为18-33℃，光照强度为10-200μE·m-2·s-1，经10-15天培养，藻丝便可形成微球体即成藻种；
6、制备大规格藻种时，将原培养液去掉，更换成新鲜的培养液，在光照强度为10-400μE·m-2·s-1中，通气培养。
一种葛仙米藻种的制备方法按下列步骤顺序进行：
1、将葛仙米球形群体用水洗净，置于70％-95％乙醇溶液浸泡10-40秒，去杂藻，然后在无菌水或培养液中清洗1-3次；
2、将葛仙米球形群体放入匀浆器中，加入葛仙米球形群体重量0.1-1.0倍的培养液，匀浆，成丝状藻浆；
3、培养液的配方为：
磷酸氢二钾20-60mg/L、
硫酸镁40-80mg/L、
氯化钙20-40mg/L、
柠檬酸4-8mg/L、
柠檬酸铁铵5-9mg/L、
乙二胺四乙酸二钠盐1-2mg/L、
碳酸钠5-30mg/L、
微量元素0.5-3ml/L、
余者为水；
其中微量元素为每1000毫升含：
硼酸1.5-3g、
氯化锰1-2g、
硫酸锌0.1-0.25g、
镍酸钠0.2-0.4g、
硫酸铜0.02-0.1g、
硝酸钴0.03-0.05g、
余者为水；
4、将接种在培养液中，培养条件条件为18-33℃，光照强度为10-200μE·m-2·s-1，经15-25天培养，藻丝便可形成微球体即成藻种；
5、制备大规格藻种时，将原培养液去掉，更换成新鲜的培养液，在光照强度为10-400μE·m-2·s-1中，通气培养。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)操作过程简单，
(2)不需要抗生素进行无菌纯化，
(3)藻种制备周期短，
(4)种藻群体全部转化为藻丝，因此形成的藻种数量多，适合大规模藻种制备的需要。
具体实施方式：
一种葛仙米藻种的制备方法按下列步骤顺序进行：
1、采集种藻：种藻的获得有两种方式，(1)野生葛仙米群体，(2)人工培养的葛仙米群体；对于野生的葛仙米，如果采集时间距制种时间在2天以上，可先将其晾干，长期保存，在制种之前用培养液充分浸泡使其复水成球状；对于人工培养的葛仙米群体，可在制种前采集，采集时最好处于葛仙米群体生长的对数期，选用表面光泽好、颜色墨黑、生长速度快、群体韧性好的藻体。
2、将葛仙米球形群体用水洗净，置于70％-95％乙醇溶液浸泡10-40秒，去杂藻，然后在无菌水或培养液中清洗1-3次。
3、将葛仙米球形群体放入匀浆器中，加入葛仙米球形群体重量0.1-1.0倍的培养液，匀浆，成丝状藻浆。
4、培养液的配方为：
磷酸氢二钾20-60mg/L、
硫酸镁40-80mg/L、
氯化钙20-40mg/L、
柠檬酸4-8mg/L、
柠檬酸铁铵5-9mg/L、
乙二胺四乙酸二钠盐1-2mg/L、
碳酸钠5-30mg/L、
微量元素0.5-3ml/L、
余者为水；
其中微量元素为每1000毫升含：
硼酸1.5-3g、
氯化锰1-2g、
硫酸锌0.1-0.25g、
镍酸钠0.2-0.4g、
硫酸铜0.02-0.1g、
硝酸钴0.03-0.05g、
余者为水；
在培养液中加入其重量0.8-1.5％的琼脂，在灭菌锅灭菌10-20分钟，成固体培养基。
5、将丝状藻浆接种于固体培养基中，培养条件为18-33℃，光照强度为10-200μE·m-2·s-1，培养8-20天。
6、然后再接种在培养液中，培养条件条件为18-33℃，光照强度为10-200μE·m-2·s-1，经10-15天培养，藻丝便可形成微球体即成藻种。
或者将步骤5和6合并为：将丝状藻浆直接接种在培养液中，培养条件条件为18-33℃，光照强度为10-200μE·m-2·s-1，经15-25天培养，藻丝便可形成微球体即成藻种。
7、制备大规格藻种时，将原培养液去掉，更换成新鲜的培养液，在光照强度为10-400μE·m-2·s-1中，通气培养。