一种万能引物的PCR方法及其反应液和在多重PCR中的应用 【技术领域】
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其反应液和在多重PCR中的应用。
技术背景
PCR是一种简单、专一、灵敏、快速的基因扩增方法，其过程通常包括20-40个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。PCR方法的关键是根据目标基因顺序设计一对具有高严谨性的、与目标基因DNA的二条链分别互补的引物。双链DNA在变性温度下解开成二条单链，当降至退火温度时，正、反引物分别与模板DNA的二条链结合，然后在延伸温度下DNA聚合酶在引物与模板结合的3’端开始按5’至3’的方向使链延伸，从而完成一个循环的扩增。所以，使用一对引物是PCR方法的基石。从八十年代中PCR发明至今天，虽然各种改进和衍生方法层出不穷，但是从未突破上述基本模式，即每一个目标基因地扩增过程都是自始至终通过与模板互补的一对正、反引物来完成的，本发明的聚合酶链式反应方法则采用了一种新的模式。
本发明的PCR方法包括了一对起“引物之引物”作用的前导引物和一对能普遍应用的万能引物。一对前导引物仅仅在PCR反应的最初三个循环中发挥作用，而PCR反应的其余循环只是由一对万能引物单独来完成的。根据PCR扩增的原理，严格地说目标扩增产物的真正合成是从PCR的第三个循环以后开始的，从此意义上说本发明的聚合酶链式反应的扩增过程自始至终是由万能引物来实现的。
现有的多重PCR是采用多对与目标模板碱基序列相匹配的引物对同时加入一个PCR反应管中实现多重扩增的，整个PCR扩增过程中始终利用与原始模板互补的引物，事实上，每对引物各自与模板配对然后延伸，各个PCR互不关联，由于引物自身结构、与模板结合效率以及引物浓度在反应全程的变化在各对引物对之间差异较大，各个PCR的扩增效率也无法一致，甚至会产生某些“弱势PCR”被“强势PCR”所掩盖的缺陷，无法产生足够的产物。
【发明内容】
发明所需解决的技术问题
本发明所需解决的技术问题是提供一种万能引物的聚合酶链式反应方法及其反应液和在多重PCR中的应用，以突破现有技术中整个PCR扩增过程中始终利用与原始模板互补的引物的常规，克服多重PCR的扩增效率受引物浓度、引物自身结构以及与模板结合效率影响较大的缺陷。
技术方案
本发明的万能引物顺序与目标基因顺序无关，因此万能引物的设计完全独立于被测基因，每一个已设计确定的万能引物能适用于扩增其他各种基因。
万能引物长度为15-40碱基，优选长度18-30碱基；万能引物用最邻近碱基法计算，解链温度为60-100℃，优选范围为80-95℃；万能引物的发夹柄碱基数应尽量低，优选发夹柄碱基数为0，即无发夹结构的寡核苷酸；万能引物自身3’端互补碱基数应尽量低，优选3’端自身互补碱基数为零的寡核苷酸；万能引物自身总互补碱基数应尽量低，优选自身总互补碱基为零的寡核苷酸。
正、反前导引物均由二个部分组成，前导引物的3’区域与目标基因顺序完全互补，可用引物软件或人工方法设计，应符合通常优秀引物的高严谨性。前导引物3’区域的长度为15-40碱基，优选20-30碱基。正、反前导引物的5’端顺序均与万能引物顺序完全相同。正、反前导引物的总长度大于35碱基，优选40-50碱基；前导引物的最邻近碱基法解链温度为75-100℃，优选85-95℃，针对上述万能引物，前导引物的3’端应避免有较多的自身配对或正反引物间配对碱基，特别是不要出现有三个以上连续的同一碱基，避免出现发夹结构和导致产生引物二聚体。
前导引物和万能引物在装配PCR反应液时与其他试剂一起混合，由于万能引物顺序与目标基因不匹配，在反应的最初几个循环中完全起不了作用。前导引物的5’端只有少数几个碱基与模板匹配，但其3’端与模板完全匹配而且有较高的结合强度，所以仍能在较高的温度下专一地与目标基因退火。经过三个循环的反应，在反应液中形成了完整的目标扩增产物，扩增产物每条链的5’端顺序与万能引物的顺序完全互补，所以，万能引物能在随后的循环中发挥作用。
本发明中万能引物PCR反应的反应液，其组成包括：一对前导引物和一对万能引物引物、四种脱氧核糖核酸、镁离子、缓冲液、耐热DNA聚合酶和目标DNA。通常PCR反应的引物最终浓度在100-1000nM，本发明中前导引物的功能只是支持最初几个循环的扩增反应，在反应液中的最终浓度为5-100nM，优选5-50nM，即为通常引物浓度下限的一半至二十分之一。而万能引物在反应液中的最终浓度1-500μM，优选10-100μM。换言之，PCR反应液中万能引物的浓度比前导引物高100-10,000倍，万能引物的解链温度与前导引物接近，所以，当PCR进入第四循环万能引物就以其浓度优势替代先导引物在扩增过程中起主导作用，直至反应结束。
所说的万能引物的聚合酶链式反应也适合在多重PCR中应用，区别在于反应体系中同时加入多对与不同模板序列互补的前导引物和一对万能引物，其余反应条件相同。前导引物同时引发多个复制过程，经过三个循环的反应后，在反应液中形成多个完整的目标扩增产物，扩增产物每条链的5’端顺序与万能引物的顺序完全互补，万能引物能在随后的循环中发挥作用。
本发明所采用的模板DNA为cDNA，由人肌肉组织总RNA(1μg/1λ，Clontech公司，)利用cDNA制备试剂盒(Advantage-RT-for-PCR-kit，Clontech公司)制备，反转录所用引物为试剂盒提供的Oligo(dT)18，PCR反应体积10μL，每管加cDNA，1μL。本发明的PCR反应均采用Clontech公司Advantage 2试剂盒。
有益效果
万能引物PCR方法比标准PCR方法有很大的优越性。第一，前导引物浓度比通常引物浓度低10-100倍，使反应的严谨性提高，有利于减少或消除非专一扩增产物和引物二聚物。第二，扩增的主要过程由万能引物来完成，避免了通常由于正、反引物的解链温度、结合强度、浓度及与模板结合强度不同等所造成的二条链的扩增效率不完全一致。即消除了引物之间不匀一性对扩增的可能的负面影响。第三，万能引物顺序是独立于基因顺序而设计的，具有理想的严谨性，反应液中终浓度高而无负面影响，而高浓度万能引物能推迟PCR平坡的出现，扩展产物的直线累积期，有利于多重PCR或多重定量PCR的实现。
万能引物的多重PCR方法与普通多重PCR相比，由于多对前导引物引发各自模板合成的各个扩增产物在PCR全程的绝大部分循环中享用同一对万能引物，并以相同效率反应，故使得各反应间消除了引物浓度、引物自身结构以及与模板结合效率的差异，使多重PCR反应在一致的背景下进行，提高了检测的准确性，避免出现因扩增效率差异导致的假阴性或不正确的半定量判断。
【具体实施方式】
实施例1.
万能引物的设计：按照技术方案中万能引物设计的原则设计下列引物(表1)。
表1.万能引物设计举例 万能引物U1 万能引物U2长度 18碱基 25碱基序列(5’-3’) CCCCC CCCCC GCCCC CCC CCCCC CCCCC CCTCC CCCCC CTTTT％GC法解链温度Tm(℃) 90.9 90.5最邻近碱基法解链温度Td(℃) 86.6 91.2结合强度 619 639发夹柄碱基数 1 03’端互补碱基数 0 0最稳定总互补碱基数 2 0
实施例2.
基于万能引物的聚合酶链式反应。
针对人肌动球蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)基因序列设计前导引物(表2)。
表2.以人肌动球蛋白和G3PDH基因序列为例设计前导引物(5’-3’) 8A1U1(5′)CCC CCC CCC CGC CCC CCC GCT ACG TCG CCC TGG ACT TC 8A2U1(3′)CCC CCC CCC CGC CCC CCC CCG CCA GAC AGC ACT GTG TT 8G1U1(5′)CCC CCC CCC CGC CCC CCC CGA CAG TCA GCC GCA TCT TC 8G2U1(3′)CCC CCC CCC CGC CCC CCC ACG TAC TCA GCG CCA GCA TC 8G3U2(5′)CCC CCC CCC CCC TCC CCC CCC TTT TAT GGC ACC GTC AAG GCT GA 8G4U2(3′)CCC CCC CCC CCC TCC CCC CCC TTT TAG TGA TGG CAT GGA CTG TGG TC
表3.各万能引物PCR反应中的引物浓度(μM)反应序 号 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 8A1U1 8A2U1 0.005 0.01 0.005 0.1 U1 1 1 0 100 100 8G1U1 8G2U1 0.010.005 0.1 U1 20 100 50 8G3U2 8G4U2 0.02 0.05 0.1 U2 1 10 100
反应条件：上述前导引物和万能引物在反应液中的浓度如表3所示。PCR：95℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 60秒，共25个循环。
万能引物PCR结果：上述F1-F10以由人组织总RNA得到的互补DNA为模板进行扩增均获得了阳性结果，阳性片段长度分别为F1--F4 292bp，F5--F7 377bp，F8--F10 427bp。
实施例3.
在多重PCR中的应用。
在一个PCR反应管中同时加入二对前导引物8A1U1(5′)/8A2U1(3′)和8G1U1(5′)/8G2U1(5′)，浓度均为0.01uM。并加入万能引物8U1浓度为5uM，其他反应条件同实施例2，结果得到二个扩增条带，分别为292和377bp。
核苷酸序列
人肌动球蛋白基因序列
1 accgcgtccg ccccgcgagc acagagcctc gcctttgccg atccgccgcc cgtccacacc
61 cgccgccagc tcaccatgga tgatgatatc gccgcgctcg tcgtcgacaa cggctccggc
121 atgtgcaagg ccggcttcgc gggcgacgat gccccccggg ccgtcttccc ctccatcgtg
181 gggcgcccca ggcaccaggg cgtgatggtg ggcatgggtc agaaggattc ctatgtgggc
241 gacgaggccc agagcaagag aggcatcctc accctgaagt accccatcga gcacggcatc
301 gtcaccaact gggacgacat ggagaaaatc tggcaccaca ccttctacaa tgagctgcgt
361 gtgcctcccg aggagcaccc cgtgctgctg accgaggccc ccctgaaccc caaggccaac
421 cgcgagaaga tgacccagat catgtttgag accttcaaca ccccagccat gtacgttgct
481 atccaggctg tgctatccct gtacgcctct ggccgtacca ctggcatcgt gatggactcc
541 ggtgacgggg tcacccacac tgtgcccatc tacgaggggt atgccctccc ccatgccatc
601 ctgcgtctgg acctggctgg ccgggacctg actgactacc tcatgaagat cctcaccgag
661 cgcggctaca gcttcaccac cacggccgag cgggaaatcg tgcgtgacat taaggagaag
721 ctgtgctacg tcgccctgga cttcgagcaa gagatggcca cggctgcttc cagctcctcc
781 ctggagaaga gctacgagct gcctgacggc caggtcatca ccattggcaa tgagcggttc
841 cgctgccctg aggcactctt ccagccttcc ttcctgggca tggagtcctg tggcatccac
901 gaaactacct tcaactccat catgaagtgt gacgtggaca tccgcaaaga cctgtacgcc
961 aacacagtgc tgtctggcgg caccaccatg taccctggca ttgccgacag gatgcagaag
1021 gagatcactg ccctggcacc cagcacaatg aagatcaaga tcattgctcc tcctgagcgc
1081 aagtactccg tgtggatcgg cggctccatc ctggcctcgc tgtccacctt ccagcagatg
1141 tggatcagca agcaggagta tgacgagtcc ggcccctcca tcgtccaccg caaatgcttc
1201 taggcggact atgacttagt tgcgttacac cctttcttga caaaacctaa cttgcgcaga
1261 aaacaagatg agattggcat ggctttattt gttttttttg ttttgttttg gttttttttt
1321 tttttttggc ttgactcagg atttaaaaac tggaacggtg aaggtgacag cagtcggttg
1381 gagcgagcat cccccaaagt tcacaatgtg gccgaggact ttgattgcac attgttgttt
1441 ttttaatagt cattccaaat atgagatgca ttgttacagg aagtcccttg ccatcctaaa
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人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)基因序列
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