新的微生物多糖结冷胶生产工艺 本发明涉及微生物发酵和食品添加剂生产领域，更具体地，本发明涉及微生物多糖结冷胶的发酵和提取等生产工艺。
三十多年来，微生物多糖获得了极大发展，尤其是1960年开发成功的黄原胶被誉为微生物多糖生产和应用的″杰出产品″。1992年获美国FDA批准应用的结冷胶(Gellan Gum)，是一种高品质的凝胶剂和悬浮剂，在食品添加剂、药用辅料和微生物及植物组织培养基等领域极具应用价值，有望成为继黄原胶之后的第二个微生物多糖″杰出产品″。
至今唯有美国实现了结冷胶的工业生产。中国于1996年批准结冷胶作为食品添加剂应用，但高昂的市场价格限制了它在国内的广泛应用。实现结冷胶的国产化和低成本是解决问题的关键。要达到目标在技术方面需解决的问题包括：
1、结冷胶由产胶微生物在适宜的培养基中经糖代谢合成。培养基组分中，糖类为主的碳源、蛋白质为主的氮源构成发酵原料成本的最大部分。寻找能促进产物合成，又价格低廉地碳、氮源是实现高产量、低成本生产结冷胶必需考虑的。
2、结冷胶发酵液属高粘度反应体系(最高达7000-8000cP)。传统的机械搅拌发酵罐是针对低粘度发酵体系设计的，应用于高粘度体系时有主体混合差、传质效率低而能量消耗高等缺点，使反应体系的养料和氧气供应成为提高发酵效率的限制因素。要达到结冷胶发酵高产高效之目的，对发酵设备有特殊要求。
3、过滤除去发酵液中的菌体碎片和蛋白质，得到澄清结冷胶溶液是提取过程中的难点，该步骤也是影响产品纯度、外观和应用性能的关键所在。导致除杂困难的原因是发酵液粘度高、蛋白含量高及色素的存在。
4、包括黄原胶、结冷胶在内的一些多糖化合物的提取，为使产品达到高品质、可食用的要求，一般需使用大量醇溶剂(乙醇、异丙醇等)，而醇溶剂的损耗和回收能源往往构成生产成本的最大部分，所以找到低溶剂使用量的提取方法很有意义。
因此，本领域迫切需要开发新的生产微生物多糖结冷胶的工艺。该工艺可以降低结冷胶的生产成本和/或提高生产效率。
本发明的第一个目的是提供一种低成本的结冷胶发酵液的生产工艺，其中将廉价的粗淀粉水解糖液作为发酵原料。
本发明的第二个目的是提供一种低成本的从结冷胶发酵液中获得脱酰基、透明结冷胶产品的提取方法。该方法不仅可获得高品质的结冷胶，而且将提取过程中的醇溶剂用量大幅减少。
本发明的第三个目的是提供一种适用于本发明方法的发酵罐，该发酵罐特别适用于高粘度的结冷胶发酵体系。
在本发明的第一方面，提供了一种结冷胶的生产方法，它包括发酵步骤，所述的发酵包括：将结冷胶生产菌接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在适合生长的条件下进行通风、搅拌培养，其中所述的碳源为粗淀粉水解糖液。
较佳地，在发酵中，氮源为酵母膏，并且培养条件是pH值7.0-7.5、温度27-29℃，发酵时间50-60小时。
在本发明的另一实施例中，发酵是在高径比为2-4的发酵罐中搅拌进行。
在本发明的另一实施例中，在发酵步骤之后还包括提取步骤：
(a)对发酵液进行碱处理，以去除结冷胶分子中的部分酰基；
(b)对步骤(a)中经碱处理的发酵液先进行粗滤，再进行微滤；
(c)对步骤(b)中经过滤处理的发酵液进行凝胶化处理，形成凝胶；
(d)对步骤(c)中的凝胶进行压榨除水；
(e)烘干。
在本发明的第二方面，提供了一种提取结冷胶生产方法，它包括步骤：
(a)对含结冷胶的发酵液进行碱处理，以去除结冷胶分子中的部分酰基；
(b)对步骤(a)中经碱处理的发酵液先进行粗滤，再进行微滤；
(c)对步骤(b)中经过滤处理的发酵液进行凝胶化处理，形成凝胶；
(d)对步骤(c)中的凝胶进行压榨除水，形成经压榨的胶片；
(e)对步骤(d)中的胶片进行烘干。
较佳地，所述的粗滤是在80-200目条件下进行，而微滤是在0.2-1.0微米条件下进行。
在本发明的一个实施例中，所述的凝胶化处理是向热滤液中加入终浓度为0.05-0.2％的凝胶化剂，并冷却至室温。
在本发明的另一实施例中，在步骤(d)和(e)之间，还包括步骤：用少量低级醇浸泡压榨所形成的胶片，以脱去残色。
在本发明的第三方面，提供了一种用于本发明方法的发酵罐，所述发酵罐的高径比为2-4，搅拌级数为3-6级，且底层搅拌采用径向流圆盘透平桨，上层搅拌采用轴向流搅拌桨，以及桨直径与罐直径之比为1/2.5-1/2。
在附图中，图1是本发明的发酵罐的剖面图。
图2A和2B分别为圆盘透平桨和轴流搅拌桨的正视图。
图3A和3B分别为圆盘透平桨和轴流搅拌桨的俯视图。
定义
如本文所用，术语“脱酰基的透明结冷胶”指对发酵所得天然结冷胶进行碱处理脱除乙酰基和甘油酰基，并用过滤等手段除去菌体蛋白，及浓缩和烘干后所得的水溶液呈透明状的结冷胶产品。这是用途最广泛的结冷胶商品形式。
如本文所用，术语“凝胶化剂”指加入结冷胶溶液中可引起结冷胶凝胶化的物质。本领域已知的用于凝胶化的各种试剂都可以用于本发明。合适的凝胶化剂的例子包括(但并不限于)：氯化钙、氯化镁、氯化锂等等。凝胶化剂的用量随凝胶化剂种类不同而有所不同，本领域技术人员可通过常规试验或经验而加以确定。
首先，本发明提供一套优化的结冷胶发酵液的生产工艺，其中特别地提供一种廉价的粗淀粉水解糖液作为发酵原料。
目前，结冷胶发酵培养基中碳源一般采用精制的葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等，氮源一般采用酵母膏、蛋白胨、玉米浆、豆饼粉、酪蛋白水解液等。然而，本发明利用粗淀粉水解糖液作碳源，这基于以下考虑：
①与葡萄糖、蔗糖等相比价格低廉许多；
②粗淀粉中富含蛋白质等营养。
可用于本发明的粗淀粉包括玉米粉、马铃薯粉、豆粉和山芋粉等，较佳地为玉米粉。粗淀粉用量(以葡萄糖计)为培养基总重量的2-4％，较佳为3％。由于以粗淀粉水解糖液作碳源，氮源添加量可减少，以酵母膏为例，一般地从0.5％的用量下降到0.2-0.3％。培养基中还包括常用的无机盐。
通常，发酵条件还包括：发酵温度在25-35℃，较佳地为27-29℃；pH范围为6.0-8.0，较佳为7.0-7.5。采用机械通风搅拌发酵罐，培养2-4天，较佳地为50-60小时。
可用于生产结冷胶的生产菌种可以是例如伊乐藻假单胞菌(Pseudomonaselodea)ATCC 53967，也可以是伊乐藻假单胞菌(Pseudomonas elodea)ATCC31461，或其它合适的菌种。
其次，本发明提供一种特制的适用于高粘度结冷胶发酵体系的机械搅拌发酵罐，其特征是内部装有大直径轴向流搅拌桨，罐体采用大高径比设计。
目前，传统机械搅拌发酵罐罐体高径比1.5-1.7，桨直径与罐直径比为1/3左右。在高粘度发酵体系中，流体剪切效率随离搅拌桨距离加大而迅速衰减，所以在罐壁附近和每级搅拌桨之间会出现死区。加大桨直径与罐径比值可克服这一缺点，但由于搅拌功耗随搅拌桨直径呈3次方倍率增加，加大桨直径绝对值则单位体积功耗太大而不可取。所以应将罐径变小，采用大高径比罐体、增加搅拌桨级数的设计。另外，在高粘度发酵中采用轴向流搅拌桨，可迫使流体轴向流动，有助于消除多级搅拌桨叶之间的死区。
因此，本发明的发酵罐具有如下设计特征：
(1)发酵罐高径比值为2-4，较佳地为2.5-3.5。
(2)具有3-6级搅拌桨级数，较佳地为4-5级搅拌桨级数。
(3)底层搅拌仍采用径向流圆盘透平桨，以促进气泡分散，而上层搅拌均采用轴向流搅拌桨；其中，轴向流搅拌桨可采用大叶面螺旋桨。
(4)桨直径与罐直径之比为1/2.5-1/2。
现参见附图1，本发明的一种发酵罐具有2个轴向流搅拌桨(1，2)和一个径向流圆盘透平桨(3)，桨直径与罐直径之比1/2，且高径比为3。
圆盘透平桨和轴流搅拌桨的结构分别示于图2A和2B，以及图3A和3B。
再次，本发明提供一套优化的从结冷胶发酵液中获得脱酰基、透明结冷胶产品的提取技术。该提取技术的特征之一是采用先粗滤后微滤，并可引入少量脱色剂的方法，以获得高澄清度的滤液；特征之二是用凝胶脱水工艺取代传统的低级醇沉淀法分离结冷胶，将提取过程中的醇溶剂用量减至最少。
目前，提取工艺一般依次包括发酵液碱处理、过滤、浓缩和烘干步骤。
用于本发明方法的碱处理条件与现有技术没有区别。目前所用的各种碱处理条件都可用于本发明。碱处理的目的是脱除结冷胶分子中的部分酰基以增强产品的凝胶性能。通常，碱处理条件如下；温度为80-100℃，pH为9-12，处理10-45分钟后将pH调至中性。较佳的条件：温度为85-90℃，pH10-11，时间15-20分钟。
由于发酵液杂质多、颜色深，一步过滤难以得到澄清透明的结冷胶溶液，直接用微滤则负荷太大。因此，本发明设计了特别的过滤工艺，其特征是采用先粗滤后微滤，并在粗滤时引入少量脱色剂的方法，以获得高澄清度的滤液。
粗滤的作用是除去大颗粒菌体碎片并吸附颜色以减轻微滤工序的压力。粗滤通常在80-200目，较佳地100-150目，更佳地约120目条件下进行。对于助滤剂和脱色剂没有特别要求，目前食品领域所用的各种助滤剂和脱色剂都可用于本发明。合适的助滤剂的例子包括(但并不限于)：硅藻土、珍珠岩等，其用量通常为0.5-3％，较佳地为1-2％。脱色剂选用活性炭，其用量通常为0.2-1％，较佳地为0.2-0.5％。
一种较佳的粗滤条件为：120目工业滤布，发酵液中加1-2％助滤剂(硅藻土)，0.2-0.5％脱色剂(活性炭)，趁热经板框压滤；
微滤的作用是截留大分子蛋白等杂质得到清液。通常，微滤在0.2-1.0微米条件下进行。一种较佳的微滤条件为：温度70-80℃，滤膜孔径为0.2-1.0微米。
为避免消耗大量醇溶剂，本发明用凝胶脱水工艺替代醇沉淀脱水工艺从溶液中分离结冷胶。采用凝胶脱水工艺的基础是：
①有阳离子尤其是二价金属离子存在时，脱酰基结冷胶溶液易凝胶；
②较高的阳离子浓度下凝胶具有良好的析水性，尤其在受压时；
③滤液中残存的可溶性蛋白，如用醇沉淀法会随结冷胶一起沉淀，而用凝胶脱水法则易随析出水除去，从而提高结冷胶产品纯度。
本发明的凝胶脱水工艺包括凝胶化处理和凝胶压榨两个过程。
所述凝胶化处理过程为：在热滤液中加入含凝胶化剂(如氯化钙)的溶液，使最终浓度达0.05-0.1％(以氯化钙为例)，强制冷却至室温；
所述的凝胶压榨过程为：将凝胶块装袋，液压机压榨除水。
压榨所得的半干胶片含水60-75％，于50-70℃烘干后粉碎得成品。必要时用少量低级醇(如酒精、异丙醇)浸泡压榨所得胶片，以脱去残色和缩短烘干时间。
本发明的优点在于：
(1)使用粗淀粉水解糖液(替代葡萄糖或蔗糖)作为结冷胶发酵培养基的碳源，使发酵原料成本下降20-40％。
(2)采用大高径比、大桨叶直径与罐径比的发酵罐使发酵液中结冷胶含量提高20％左右。
(3)采取了先粗滤后微滤，并引入少量脱色剂的过滤工艺。这一工艺克服了结冷胶提取中难以获得高澄清度滤液的问题，保证了终产品的纯度。
(4)以凝胶脱水法替代传统的醇沉淀脱水法从溶液中分离结冷胶，使单位产品的醇溶剂损耗量下降80％左右，醇回收能源消耗量下降90％左右，使用于提取的辅料成本下降50％以上，使产品蛋白质含量减少20％左右。
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，除非特别说明，否则所有的百分比都是重量百分比。
实施例1
发酵生产结冷胶多糖
A.种子制备
从营养琼脂斜面上将种子菌(Pseudomonas elodea ATCC 53967)接入肉汤培养基，30℃摇瓶培养24小时，是为一级种子；将上述种子液接入二级种子培养基营养成分同发酵培养基)，30℃培养16小时，然后以5％的量接入发酵培养基
B.发酵工艺
发酵培养基成分及用量见表l。
培养基用自来水配制，并以2N NaOH调节pH至7.5。发酵过程用10％NaOH控制pH7-7.5，温度维持27℃-29℃，发酵时间为58小时。
表1结冷胶发酵培养基组成
成份 用量(％)
玉米水解糖 3.0(以葡萄糖计)
酵母膏 0.2
MgSO4.7H2O 0.01
Na2HPO4 0.05
KH2PO4 0.05
C.发酵设备
采用附图1所示的具有大高径比发酵罐体和大直径、轴向流搅拌桨的特制机械搅拌发酵罐。
D.结果
如下进行发酵液中粗多糖含量测定：将发酵液和两倍于其体积的95％酒精混匀，取沉淀，60℃干燥2小时。结果表明，通过本实施例得到的发酵液中结冷胶粗多糖浓度为1.3g/100ml。成本下降约30％，多糖浓度比对照(常规发酵罐)高约20％。
实施例2
脱酰基、澄清结冷胶的制备
碱处理工艺
A.将500L发酵液加热至90℃；
B.用NaOH调pH至10，保温85℃-90℃，15分钟；
C.用稀盐酸或稀硫酸调pH至6-8；
过滤工艺
D.加入发酵液体积1％的硅藻土，0.2％的活性炭，通过经预涂硅藻土的板框压滤机过滤，压力为0.2-0.3Mpa，待滤液的温度为80-90℃；
E.过滤得的滤液趁热微滤(温度大于70℃)，使用PallSepTM工业微滤器进行；
凝胶工艺
F.不断搅拌下向热滤液中缓慢加入10L 5％的氯化钙溶液，冷却至室温形成凝胶；
凝胶压榨工艺
G.将凝胶块打碎装入滤布制成的袋中，扎口，置于10Mpa液压机下压榨2小时；
H.将含结冷胶量为30％的半干胶片放入2倍重量的酒精中浸泡半小时，脱去残色；
烘干和粉碎
I.60℃烘干3小时，粉碎即为成品。
结果
经测定，通过本实施例得到的结冷胶成品对结冷胶粗多糖的提取得率为55％。单位产品的酒精损耗量比使用传统醇沉淀法下降80％左右，酒精回收的能源消耗下降90％以上。得到的产品具体性能见表2：
表2 脱酰基、透明结冷胶的产品性能
产品外观 类白色粉末(60目)
干燥失重(％) 7.1
灰份(％) 8.0
蛋白含量(％) 1.5
0.5％浓度溶液外观 无色、澄清透明
0.5％浓度溶液粘度(cP) 30
0.5％浓度凝胶强度(g/cm2) 1000
实施例3
脱酰基、澄清结冷胶的制备
碱处理工艺
A.500L发酵液加热至90℃；
B.用KOH调pH至10，保温85℃-90℃，15分钟；
C.用稀盐酸或稀硫酸调pH至6-8；
过滤工艺
D.加入发酵液体积1％的硅藻土，0.2％的活性碳，通过经预涂硅藻土的板框压滤机过滤，压力为0.2-0.3Mpa，待滤液温度80-90℃；
E.过滤得的滤液趁热微滤(温度大于70℃)，使用PallSepTM工业微滤器进行；
凝胶工艺
F.不断搅拌下向热滤液中缓慢加入5L 5％的氯化镁溶液，冷却至室温形成凝胶；
凝胶压榨工艺
G.将凝胶块打碎装入滤布制成的袋中，扎口，置于10Mpa液压机下压榨2小时；
H.将含结冷胶量为30％的半干胶片置于2倍重量的酒精中浸泡半小时，脱去残色；
烘干和粉碎
I.60℃烘干3小时，粉碎即为成品。
通过本实施例得到的结冷胶成品对结冷胶粗多糖的提取得率为54％；单位产品的酒精损耗量比使用传统醇沉淀法下降80％左右，酒精回收的能源消耗下降90％以上。
应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。