一种反转录PCR方法检测SARS冠状病毒诊断试剂盒 【技术领域】
本发明涉及SARS冠状病毒的诊断，具体地说是一种反转录PCR方法检测SARS冠状病毒诊断试剂盒。
背景技术
严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrom，SARS)，或称非典型肺炎(Atypical Pneumonia)；2002年11月份前后始发生于广东地区，随后迅速蔓延到世界各地，造成2003年春全球爆发性流行性疾病；其发病之快，危害之深，影响面之广是本世纪以来最严重的一次；为此，世界卫生组织(WHO)在今年3月12日发出全球性预警，并联合全球10个国家和地区的11个顶尖实验室，组成的合作研究网络(文献1.WHO WHOissues a global alert about cases of atypical pneumonia.March 12，2003.文献2.WHO China joins WHO collaborative network.March 28，2003)，随后，非典型肺炎的病原体被鉴定为一种新的冠状病毒(文献2.WHOChina joins WHO collaborative network.March 28，2003)，几个实验室相继在New England Journal of Medicine，Lancet和Science等多份国际知名杂志上公布对该病原体的鉴别和鉴定(文献3.Poutanen SM，LowDE，Henry B，Finkelstein S，Rose D，Green K，Tellier R，Draker R，Adachi D，Ayers M，Chan AK，Skowronski DM，Salit I，Simor AE，SlutskyAS，Doyle PW，Krajden M，Petric M，Brunham RC，and McGeer AJ.Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada.N EnglJ Med.Low-1_low-11(at www.nejm.org on March 31，2003).文献4.Christian Drosten，Stephan Gunther，Wolfgang Preiser etc.Identification of a Novel Coronavirus in patients with Severe AcuteRespiratory Syndrome.NEJM，publ ished at www.nejm.org on April 10，2003.文献5.Thomas G.Ksiazek，Dean Erdman，Cynthia Goldsmith etc.A Novel Coronavirus Associated with Severe Acute RespiratorySyndrome.NEJM，Published at www.nejm.org on April 10，2003.文献6.J.S.M Peiris，S.T.Lai，L.L.M Poon etc，Coronavirus as apossible cause of Severe Acute Respuratory Syndrome.Lancet，Published online April 8，2003.文献7.Paul A.Rota，M.Steven Oberste，Stepan S.Monroe etc，Characterization of a Novel CoronavirusAssociated with Severe Acute respiratory Syndrome.Science.www.scienceexpress.org，1 May 2003.文献8.Susan M.Poutanen，DonaldE.Low，Bonnie Henry etc，Identification of Severe Acute RespiratorySyndrome in Canada.NEJM，published at www.nejm.org on March 31，2003.文献9.Holmes K.V SARS-associated coronavirus NEJM 2003 May 15，348(20)：1948-51.)。2003年4月6日，WHO在上述科研成果的基础上，宣布非典型非炎的病原体为一种以前未知的冠状病毒(Coronavirus)，并命名为SARS冠状病毒(SARS Coronavirus，SARS-CoV)，其特症是正义，单链RNA病毒(文献10.WHO Coronavirus never before seen in Humans is thecause of SARS April 16，2003.)。随着生物前沿技术，即基因组和功能基因组技术的快速发展，截止于5月底，全球科学家以争分夺秒的速度，快速地公布了11株SARS冠状病毒的基因组序列，并提交到基因库中(Genebank)(文献11.British Columbia Cancer Agency’s GenomeSciences Centre，SARS Coronavirus Genome.文献12.The preliminaryanalysis of SARS coronaviruses 6enome.CMBI，April 26，2003.文献13.Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell etc，TheGenome Sequence of the SARS-Asscociated Coronavirus，Science，www.sciencexpress.org 1 May 2003.文献14.Qin E’De Zhu Qingyu，WangJian，Li Wei etc.，A complete sequence and comparative analysis ofa Sars-associated Virus(Isolate BJ01)Chinese Science Bulletin 2003Vol.48，No.10，941-948.文献15.中国医学生物信息网非典型非炎专题网页-SARS基因组分页。文献16.Yijun Ruanm，Chia Lin Wei，Ling AiEe etc，Comparative Full-length genome sequence analysis of 14 SARScoronavirus isolates and common mutantions associated with putativeorigins of infection Lancet，published online May 9，2003)。正是由于SARS基因组的快速公布，就为非典病毒的早期基因诊断打下了很好的基础。在获得SARS病毒的核苷酸序列前提下，国际上许多科研单位据此设计了成套的特异性引物，SARS的诊断也已由细胞培养的方法转到了以RT-PCR为主流的快速检测方法上，已形成多种RT-PCR方法来检测SARS病毒。其中德国Bernhard-Nocht热带病研究所的巢式PCR和荧光定量PCR中所采用的引物其特异性已得到证实，成功地开发出一种快速地检测方法并受到WHO的推荐(文献17.WHO SARS virus isolated，new diagnostic testproducing reliable results，March 22，2003.文献18.WHO SARS RT-PCRprimers.)。我国政府和广大的科技人员经过日日夜夜的努力，也已开发出具有快速的检测方法，这也标志着我国科技水平已发展到世界先进水平，与西方国家基本取得同步的科研成果。然而，上述的检测方法都存在着一个严重的缺陷，此方法仅适用非典发病期的患者，普遍存在着灵敏度不高的弊病；通常要用巢式双重PCR来提高检测的灵敏度；由于操作繁琐，重现性和准确性不高，据实检人员报道，准确率只有40-60％；人们希望通过重新评估所公布的非典冠状病毒得基因组序列，借助自行设计的微流控芯片技术，开发出一种高度灵敏的检测方法，能对可疑病人和隔离的人群进行有效地筛选，达到早期诊断携带非典病毒的人群。这将对提前治疗和提前排除提供有效的手段具有非常关键和现实的意义。
由于SARS病毒是RNA病毒，所以需要RT-PCR；国内大多报道的是巢式PCR试剂盒。
现有文献(文献17.WHO SARS virus isolated，new diagnostic testproducing reliable results，March 22，2003.文献18.WHO SARS RT-PCRprimers.文献19.WHO SARS virus close to conclusive identification，new tests for rapid diagnosis ready soon March 27，2003.文献21.Vabret A，Mouthon F，Mourez T，Gouarin S，Petitjean J，and FreymuthF.Direct diagnosis of human respiratory coronaviruses 229E and OC43 by the polymerase chain reaction.J Virol Methods.2001，97：59-66.文献22.朱汝南，等。用逆转录—聚合酶链反应鉴别呼吸道合胞病毒亚型。中华儿科杂志，1998，36：1-3。文献23.王艳，马文丽，宋艳斌，等。反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒。第一军医大学学报，2003，23(5)：421-423.文献24.杨洁，王战会，陈金军，侯金林。SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立。第一军医大学学报，2003，23(5)：424-427.)所述的检测内容只是针对呼吸道致热病毒单一的病原体检测方法，无论是通过抗原抗体原理分析检测的抗体法，还是通过基因分析的聚合酶链反应(PCR)的早期诊断法都是如此。就PCR检测法而言，常规PCR法都是将病原体的基因经PCR反应后将产物经电泳分离得到目的产物进行确认的，PCR反应体系和电泳检测是分开的，较难进行定量，检测灵敏度较低；其次，操作亦不方便；另一种PCR检测法是实时定量PCR(real-timequantitative PCR)，该方法PCR反应和定量检测基本上是同时进行的，是目前最为先进的PCR方法。尽管该法具有灵敏度高、定量等优点，但是，它对非特异性的PCR反应无法进行识别，因为它没有对扩增产物进行分离的过程，因此，它会产生假阳性结果。文献(17～24)阐述了反病毒和SARS病毒检测中所采用的逆转录PCR和巢式PCR方法，最终运用的分析方法是普通凝胶电泳，所以存在检测灵敏度低且不能对产物进行定量等问题。
即使是定量PCR的方法，仍然无法告诉，非特异性扩增的实况；所以，各法的灵敏性和准确性均有相当大的程度的局限性。
目前国内外用于非典病毒诊断有如下三种方法：
1)抗体检验法：
a.如免疫酶联法，可以靠检验出患者血清中的病毒抗体(显色反应)来判断患者体内是否有病毒；但是这需要病人出现体征后21天方可检出；北京华大基因已经研制成功；无需特殊技术和设备；
b.荧光免疫检验显微镜和一个有经验的检验技术员；需出现体征10天后才有效，一般医院均不具备这样的条件；
上述两种抗体检验法属于中后期确诊；但是由于非典的发病进程急速；这些方法对于非典的早期控制没有效。
2)化学分子试验(基因扩增，PCR法；基因芯片法)：
PCR法可以检测出在各种样本(唾液，痰液、簌口水、血液，粪便、呼吸道分泌物，组织切片等等)中的SARS病毒的遗传物质。一个简易的包括引物的阳性和阴性对照的PCR检测盒技术两周前已经发展起来；已经在许多国家广泛使用，可以在2-4小时内检测出是否有SARS病毒，快速而准确。尽管本周内国内厦门大学和北京军科院已有两家试验成功，但是灵敏度较差，主要因为阳性结果可能已经显示足够的特异性，但是一次阴性试验结果并不能完全排除患者是否以前就没有出现非典病毒。所以，WHO仍然呼吁开发高灵敏度的方法。同时要求每一次检测都包括适当的阳性和阴性对照。
国外已有Affymatrix公司开发出基因芯片法，国内北京本元正阳基因技术股份有限公司也开发出全基因组芯片检测系统。
3)细胞培养
从非典患者所采集的样本(如呼吸道分泌物，血液或者粪便)中的病毒可以通过感染细胞培养并产生出病毒来进行检验；但是该法需要高培养条件(至少P3级实验室)，一般医院无此条件。
所以，基因扩增的方法是相对最简便快捷的早期诊断方法。
但是，通过基因组的比较，北京的基因的5’端的兼并基因和突变部位较多；广东的非典病毒基因同海外的非典病毒具有同源性，变异很小；由于，前期BNI的RT-PCR是基于德国的基因组测序结果来进行设计引物和探针的，由于时间的关系，不同的区域使用的基因序列也有所差别，目前已有6种试用的引物。
例如其中几个已在试验的检测方法引物设计：1)BNIoutS/BNout：正义：ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC；反义：CAT AAC CAG TCG GTA CAGCTA C，片断长度：195bp；2)BNIinS/BNIAs：正义：GAA GCT ATT CGT CACGTT CG；反义：CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G，片断长度：110bp；3)SAR1s/SARlas：正义：CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA；反义：TAT AGT GAGCCG CCA CAC ATG，片断长度：150bp；扩增物序列(BNI-1，Bernhard-NochtInstitute，Hamburg，Germany)
TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATA
TGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGG
CTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGT
GTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAG
TTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC(扩增产物长度301b)；
美国：IN-2，IN-4：正义引物：5’GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA 3’；反义引物5’TAACACACAAACACCAT CATCA 3’；扩增产物长度：452bp；
香港(中国)HKU：正义引物：5’TACACA CTCAGCGTTG 3’；反义引物：5’CACGAACGTGACGAAT 3’扩增长度：182bps；
由此可见，各个RT-PCR的设计所选用的引物是各不相同的，同时比较的序列也不相同；所以很难说那个更有效，而且，到目前为止，尚无临床统计数据公布；如果仅从效率上说，是没有意义的，也没有可比性，这也是为什么，WHO呼吁开发更准确的PCR检测方法的原因。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种高准确性和灵敏性、稳定易操作的反转录PCR方法检测SARS冠状病毒诊断试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
通过对现有11条SARS病毒的基因组序列分析，选择SARS-COV的基因序列具有高特异性，非同源性的开发阅读框1b(Orf1b)部分进行设计引物，使检测范围扩大到15000-19000的段落；为了比较检测方法的灵敏性和特异性，以北京华大基因公布的序列(基因组序列名称BJ01，AC注册号AY278488)为分析对象，同时对其他公布在基因库中的序列(AY274119，AY278741，AY278491，AY278554，AY282752，AY283794，AY283795，AY283796，AY283797，AY283798)进行比对分析，得出下例正反义引物，9对正反义巢式引物如下：
1)BIT001引物对
正义引物：5’-AGAGCCATGCCTAACATGCT-3’
反义引物：5’-AAGCGTAAAACTCATCCACG-3’
GI#：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：15221-15593
测试类型：RT-PCR
2)BIT002引物对
正义引物：5’-GTCAAGCTGTTACAGCCAAT-’
反义引物：5’-AAGCGTAAAACTCATCCACG-3’
GI：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：15441-15593
测试类型：RT-PCR
3)BIT003引物对
正义引物：TAGGATTGCCTACGCAGACT
反义引物：CCACATTGCGACGTGGTATT
GI：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：17724-18161
测试类型：RT-PCR
4)BIT004引物对
正义引物：TAGGATTGCCTACGCAGACT
反义引物：TAGGGTAACCATTGACTTGG
GI：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：17724-18161
测试类型：RT-PCR
5)BIT005引物对
正义引物：AATACCACGTCGCAATGTGG
反义引物：TAGGGTAACCATTGACTTGG
GI：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：17920-18161
测试类型：RT-PCR
6)BIT006引物对
正义引物：AATACCACGTCGCAATGTGG
反义引物：GTGTCAACATAACCAGTCGG
GI：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：17920-18330
测试类型：RT-PCR
7)BIT007引物对
正义引物：CTGGTCTTCATCCTACAC
反义引物：TCGGTACAGCTACTAAGT
GI：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：17997-18314
测试类型：RT-PCR
8)BIT008引物对
正义引物：AGGACATGACCTACCGTA
反义引物：TAACACCTGTAGAAAATC
GI：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：18090-18296
测试类型：RT-PCR
9)BIT009引物对
正义引物：CCAAGTCAATGGTTACCCTA
反义引物：GTGTCAACATAACCAGTCGG
GI：30275666；病毒名称：SARS-Cov BJ01；
瞄准的基因序列：18142-18330
测试类型：RT-PCR
反转录PCR方法检测SARS冠状病毒诊断试剂盒，包括缓冲液体系，以非典病毒的RNA中Orf1b反转录成相应的cDNA片断为模板(即BJ01非典病毒的外显子31-38经PCR扩充所得的cDNA片断，作为阳性模板；)；所采用的引物为上述9对引物对之一或其组合。
PCR扩充产物所获得的cDNA通过基因载体，克隆到质粒上作为试剂盒的阳性模板；所述的引物可采用荧光标记物标记，形成引物的荧光标记物应用于常规和定量的PCR反应的试剂盒中。
为了能够更好地对非典病毒基因进行准确、高效地早期检测，本发明设计了一种适于SARS病毒反转录PCR试剂盒应用的多通道组合式微流控芯片，利用微流控芯片上的PCR实现现时RT-PCR联运检测。
微流控芯片，由管道、盛液池等组成，在盛液池间的进样管道上设有反应池；
可高度集成和高通量的PCR微流控芯片由可耐100度左右温度的光透性好的材料组成，例如：有机材料，如聚碳酸酯(PC)塑料等，以及无机材料，如石英、玻璃等；其结构中包括有多个盛液池、微通道和毫米级的反应管道或反应孔(池)组成。其中芯片一侧壁的厚度为1毫米～200微米；在进样管道上的反应池与盛液池间可设有提取区；管道及反应池深度为10～50微米，宽度或直径为50微米～5毫米；在管道的末端打有2～4毫米直径的孔；其结构如图8所示。
较佳的适于SARS病毒检测的RT-PCR微流控芯片检测条件为：Taq酶的用量为2.5-5.0U/50μL，最佳引物和模板配料比为＞108∶101，引物浓度范围为2.0-5μM。
本发明具有如下优点：
1.灵敏性高。本发明借助自行设计的微流控芯片联机现时PCR仪，可以使得非典病毒的RT-PCR反应在微流控芯片上进行，可以达到分子水平的检测；常规PCR无法检出的RNA，本法依然能够检出；一个阳性对照模板，结合微流控芯片PCR技术摸索了较好的试剂盒，9对获得特异性SARS基因序列扩增产物，适于非典病毒的早期诊断；又因采用了高灵敏的激光诱导荧光检测技术，所以其灵敏度比常规PCR技术大大提高；非典病毒可以在极低的浓度下检测到，检测限度可达10-2拷贝/100微升。
2.准确性高。本发明通过跨越SARS-Cov开放阅读框1b(Orf1b)，设计多位点扩增，利用微流控毛细管电泳的高灵敏性和平行多通道扫描，准确率高；利用所设计的9对引物，在自行设计的微流控芯片基因扩增仪上对五种病毒(SARS-Cov样品；流感病毒；副流感病毒；合胞病毒；腺病毒)进行一次性多重扩增，其扩增反应在扩增反应芯片扩增器中进行，然后在线进行扩增产物的标记和芯片电泳分离，同时以已知量的DNA作内标，可将产物进行定量分析(也可以经荧光标记，直接用于定量PCR检测)，既保持了实时定量PCR的定量优点，同时克服了其假阳性的缺点，较少出现假阴性，阳性检出率高。
3.稳定易操作。本发明设计的模板为基于非典病毒的RNA中Orf1b反转录成相应的cDNA片断，因此模板比RNA阳性模板稳定(阳性对照不需RNA模板)；并且PCR扩充产物所获得的cDNA可以通过基因载体，克隆到质粒上作为试剂盒的阳性模板，进一步提高试剂盒的稳定性；所设计的引物无需荧光标记，即可在微流控芯片上检测出；具有新颖性，多样性和全面性的特点；同时，比全基因组方法省时，而价廉。
4.特异性好。本发明是在基因组序列分析指导下设计的新的高效引物；对具有独特遗传特性的国产状病毒具有专一性；适于具有我国独特遗传特性的SARS病毒的准确PCR医疗、卫生、检疫的特异性检测。
5.检测速度快。本发明在操作上采用在线技术，如现时定量PCR一样克服了常规PCR那种多步骤、离线、易污染的分析方法，操作方便；其反应体积在5微升以下，大大减少了试剂用量，同时提高了扩增反应时的反应器的体表面积，使扩增效率提高，可缩短扩增反应的时间，使扩增与检测时间缩短至25分钟内完成，达到快速检测目的。采用多通道组合式微流芯片的RT-PCR，可集成和实现高通量，即可在同一块芯片上实现多人份多病原体的同时检测；微流控芯片上反转录现时PCR联运检测，能够对非典病毒的基因进行准确、高效地早期检测。本发明适用于呼吸道五种致热性病毒病原体的联合基因鉴别达到非典病毒的早期排查；这五种致热性病毒包括呼吸道非典型性肺炎(SARS)病毒、呼吸道流感病毒、呼吸道副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒；它们的发病特点有许多相似性，如传染性、引起肺炎严重者导致患者死亡等，给人们的生命财产造成重大损失；均为病毒感染症状有许多相似性，如发热、导致肺炎等；临床血液学检查均为白细胞总数下降，严重者所造成的肺部感染的X胸片相类同，以此难以作出鉴别诊断；特别是在病源学不清的情况下，易造成大流行，造成重大的损失，SARS在中国的流行就是其中最近的一例。
6.成本低。试剂盒省略巢式法，一步即可获得最佳结果；引物无需荧光标记；如果是标记的引物，也可以适用于常规定量PCR仪检测；反应产物的电泳分离检测可在一块微流控芯片上进行或用常规定量PCR离线检测；PCR扩充后产物无需荧光探针附加检测，进一步降低成本。
【附图说明】
图1为非典病毒的基因组蛋白表达相关图；
图2为非典病毒RT-PCR原理图；
图3为阳性对照扩增产物使用Marker前的电泳检测谱图；
图4为阳性对照扩增产物使用Marker后的电泳检测谱图；
图5为实例一阳性模板PCR扩增产物侧序结果图；
图6为本发明阴性对照组电泳谱图；
图7为PCR产物DNA片段检测灵敏度比较图；
图8为本发明微流控芯片示意图；其中1为盛液池，2为热循环区，3为反应池，4为检测点。
【具体实施方式】
首先，自2003年3月份以后，非典病毒被鉴定为宿主依赖性冠状病毒，含有29736左右的正义单股RNA(ssRNA)，该病毒通过胞吞方式进入正常细胞，然后经过细胞膜融合释放成熟mRNA进入胞液；其次，从报道的非典病毒基因组分析初步结果来看，整个ssRNA的第一个20kb的所有功能只是复制成SARS病毒的一个聚合酶(参见图1所示)，由此而知，SARS冠状病毒和同家族的其他冠状病毒一样，是一类单链的正义RNA病毒(single-stranded，(+)sense RNA Virus)；以，在进行基因扩增反应时需要加入反转录反应一步，先制备非典病毒基因序列中片断所对应的cDNA，后遵从常规PCR的操作规程；基本原理见图2所示；
本发明涉及通过对现有11条SARS基因组的分析和比较各SARS基因组序列后，基于ORF1a和ORF1b两个开放阅读框序列中的编码序列，设计了相应的引物，再以引物所在的位置选取包含PCR扩充产物序列在内的基因片断进行克隆，做成DNA阳性模板。
PCR芯片的构建：以玻璃PCR芯片为例：将构思好的芯片图如图8所示，利用CAD软件在计算机上进行设计后，用5000dpi以上的打印机制成掩模，按标准的电子蚀刻工艺在符合分析化学用途的玻璃上蚀刻出所设计的图案，其管道、反应器、提取区管道、反应腔等其深度一般在10微米至50微米之间，宽度或直径一般在50微米至5毫米之间；蚀刻好的玻璃用超声波打孔器在管道的末端打上2毫米至4毫米直径的孔，然后与另一块厚度为1毫米至200微米的同质玻璃经过严格的多步骤清洗过程后，将蚀刻有通道的玻璃面与另一准备好的玻璃片对接好，放入程序控温炉中，并在对接好的玻璃片上压适当的重物；然后，采用程序控温的方法在经过约48小时的升温和降温程序，将二块玻璃通过热键合封接到一起；最后，根据玻璃表面的粗糙度进行打磨和抛光，从而得到所需要的芯片。
实施例1.试剂盒1
1)材料：阳性标本来自国家军事医学科学院，样本为基因工程改造后的带有非典病毒RNA的Vero-6病毒细胞株；-80C保存备用。对照品为正常人唾液和其他病毒。
2)RNA样品的制备：RNA样品的制备参见NEJM(文献13.Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell etc，The Genome Sequenceof the SARS-Asscociated Coronavirus，Science，www.sciencexpress.org1 May 2003)，即向含有非典细胞的体液中加入等体积的N-乙酰基半胱氨酸缓冲液(0.9％NaCl融合的溶液，浓度为10g/l N-乙酰基半胱氨酸缓冲液)；缓慢摇动30分钟；取600μL该溶液，常规桌面离心机离心(10,000g)3分钟，加入140μL的上清液到560μL的AVL缓冲液中(Qiagen病毒RNA试剂盒)，重新溶解细胞颗粒到560μL的AVL缓冲液中，在加入140μL的水；按照Qiaqen RNA试剂盒的指导进行后续RNA制备操作。
3)合成BIT009引物对。
4)阳性DNA模板的制备：
①反转录反应
反转录反应体系(所有试剂来自Takara RNA LA PCR kit)
Mgcl2(25mM) 4μl
10X RNA PCR Buffer 2μl
Rnase free H2O 7.5μl
DNTP Mixture 2μl
RNase Inhibitor 0.5μl
AMV reverse transcriptase XL 1μl
SARS RNA 2μl
Olio dT adaptor Primer 1μl
按以下条件进行反转录反应
30℃ 10分钟
50℃ 30分钟
99℃ 5分钟
5℃ 5分钟
②PCR反应
取反转录反应产物2μl，加入下列成分：
10X LA PCR Buffer II 5μl
Mgcl2(25mM) 5μl
灭菌蒸馏水 36.5μl
引物(根据多伦多发表的sars序列：GI：30248028)
正义引物：CCACTAGAGGAGCTACTGTG
反义引物：GTCTGACAATCCTTTCAGGG
扩充产物瞄准序列：Tor 15112-18506
扩增产物长度：3395bp
引物量 1μL
Takala LA Taq 0.5μl
按以下条件进行PCR反应
94℃ 5分钟，
94℃ 30秒——55℃ 30秒——72℃ 4分钟 30个循环
72℃ 7分钟；
③制备感受态细胞
a.取40μl大肠杆菌(DH5a)转接于4ml LB培养基，37℃，250RPM，3小时；
b.冰浴10分钟，4℃，8000RPM，1分钟；
c.加入1×TSS溶液200μl，冰上混匀，分装，冰浴50分钟；
d.-20℃ 3小时
e.-70℃保存
④转化
a.连接：反应产物50μl，经1％琼脂糖凝胶电泳，对照Takala DL 15000DNA Marker进行分离鉴定，将PCR产物回收；Omega公司E.Z.N.A GelExtraction Kit(200)D2501-02进行纯化，制成80μl溶液；取其中4μl，加入：灭菌去离子水3μl，Promega pGEM T-easy载体1μl，45℃水浴5分钟，冰浴，加T4 DNA连接酶1μl，10X DNA ligation buffer 1μl，室温静置3小时；
b.取5μl连接产物加入含感受态细胞的200μl溶液中，混匀后转至无菌试管，冰浴30分钟；
c.迅速放42℃水浴中90秒；
d.迅速放置冰浴槽1分钟，加入800μl LB液体培养基，37℃预温5分钟，随后放置37℃摇床中，200RPM温育45分钟；
e.取200μl转化菌，涂布于含有氨苄青霉素(100μl/100ml LB培养基)、X-gal(200μl/100ml LB培养基)、IPTG(20μl/100ml LB 培养基)的LB固体培养基板上，37℃恒温箱中温育16小时；
f.4℃放置8小时，挑取白色单菌落，放入4ml含有氨苄青霉素(1μl/ml)的LB液体培养试管中，37℃摇床中，250 RPM，12小时；
⑤鉴定
菌液放于1.5ml离心管中，8000RPM离心一分钟；用Omega E.Z.N.APlasmid Miniprep Kit 1回收质粒DNA，溶解于150μl去离子水中；取质粒DNA10μl，加去离子水7μl，NEB 10×Buffer(New England Biolab)2μl，1mg/ml牛血清白蛋白(New England Biolab)0.5μl，SacI(New England Biolab)0.5μl，37℃温育4小时；1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
⑥RT-PCR实验规程：采用一步法进行RT-PCR反应
RT-PCR反应液：
(1)10×One Step RNA PCR Buffer 5μl
(2)MgCl2(25mM) 10μl
(3)dNTP mixture(10mM each) 5μl
(4)RNase Inhibi tor(40U/μl) 1μl
(5)AMV-RTase XL(5U/μl) 1μl
(6)AMV-Optimi zed Taq(5U/μl) 0.5μl
(7)RNase Free H20 up to 50μl
(8)(20μM each) 1μl
(9)样品RNA* 1μl
上述试剂和原料(1-7)来自Takara SARS Virus RNA Detection Kit，购自宝生物大连生物工程有限公司。Code D303，Lot BK101；引物9(自行设计)，和上述自行制备的阳性模板，进行反转录PCR反应。
●阳性对照时加入control DNA，不加样品RNA；
●阴性对照反应不加非典样品RNA和control DNA，但是加入副流感病毒RNA(由大连医科大学微生物系提供。
RT-PCR反应条件：
50℃ 15分钟 逆转录反应
94℃ 2分钟 RTase失活
反应结束后，取PCR反应液进行电泳，确认PCR扩增产物。如样品RNA检测出189bp目的片段，则判定为阳性结果。
典型反应实例：
PCR仪器：TECHNE model：FTGENE5D SERIAL No.：110657-4，产地：英国
反应体系：Mxd9-1/2AMV taq-105cDNA PCR反应
分析仪器：自制芯片电泳仪、自制玻璃芯片
PCR反应液为：
缓冲液和试剂来自Takara
10×One Step RNA PCR Buffer 5μl
MgCl2(25mM) 10μl
dNTP mixture(10mM each) 5μl
AMV-Optimized Taq(5U/μl) 0.5μl
第9对引物(20μM each) 1μl
SARS cDNA fragment(105)* 1μl
RNase Free H20 up to 50μl
PCR反应条件：
94℃ 5分钟 预变性
72℃ 5分钟 延伸
⑦试剂盒的阳性对照实验和阴性对照实验及产物分析
反应结束后，将PCR反应液稀释10倍，取5-10μl PCR产物，用自制的玻璃芯片，在芯片电泳仪上进行分析，确认PCR扩增产物，检测出了189bp目的片段，则判定为阳性结果。
阴性对照：副流感病毒与第9对引物的RT-PCR结果；副流感病毒来自于大连医科大学微生物系。
⑧第9对引物扩增产物测序
扩充产物送交Takara(Dalian)Biotechnology Co.，Ltd.扩增产物的序列参见(图9)；
Blast比对结果如下：
Blast Score＝375bits(189)，Expect＝e-101
Identities＝189/189(100％)
Strand＝Plus/Minus符，合预计的序列(BJ01，位置18142-18330)。
Blast比对结果如下：
PCR扩充产物序列：Query 1-189
对比序列：GI：30027614，SARS Coronavirus BJ01
Score＝364bits(189)，Expect＝4e-98
Identities＝189/189(100％)
Strand＝Plus/Plus
Query：1 ttataccactcatgtataaaggcttgccctggaatgtagtgcgtattaagatagtacaaa 60
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Sbjct：18142 ttataccactcatgtataaaggcttgccctggaatgtagtgcgtattaagatagtacaaa 18201
Query：61 tgctcagtgatacactgaaaggattgtcagacagagtcgtgttcgtcctttgggcgcatg 120
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Sbjct：18202 tgctcagtgatacactgaaaggattgtcagacagagtcgtgttcgtcctttgggcgcatg 18261
Query：121 gctttgagcttacatcaatgaagtactttgtcaagattggacctgaaagaacgtgttgtc 180
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Sbjct：18262 gctttgagcttacatcaatgaagtactttgtcaagattggacctgaaagaacgtgttgtc 18321
Query：181 tgtgtgaca 189
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Sbjct：18322 tgtgtgaca 18330
本发明微流控芯片RT-PCR显示出很高的灵敏性，常规PCR无法检测到的极微量的非典病毒利用所设计的特异性引物均可检测到(参见图7)。
(芯片PCR产物标记为：Polymer Chip PCR条带)阴性对照：非流感病毒，合孢病毒，腺病毒的RNA提取物经上述试剂盒的RT-PCR扩增，均得到谱图如图6所示；由此看出，所设计的引物对于SARS-Cov具有很高的特异性。由此可以看来，阴性对照均无PCR产物；说明该试剂盒中的引物和阳性模板对非典病毒基因序列具有极高的专属性。
同时，与常规Agrose凝胶电泳(溴乙啶染色)比较，也显示出芯片PCR的优越的灵敏性(参见图7)。
该微流控芯片试剂盒的反应的灵敏性表现在，非典病毒阳性模板在100个拷贝的RNA分子/100ul的浓度便可检出。
实施例2.试剂盒2
引物使用BIT001号引物对，试剂盒其它部分同实例一。
实施例3.试剂盒3
引物使用BIT002号引物对，试剂盒其它部分同实例一。
实施例4.试剂盒4
引物使用BIT003号引物对，试剂盒其它部分同实例一。
实施例5.试剂盒5
引物使用BIT004号引物对，试剂盒其它部分同实例一。
实施例6.试剂盒6
引物使用BIT005号引物对，试剂盒其它部分同实例一。
实施例7.试剂盒7
引物使用BIT006号引物对，试剂盒其它部分同实例一。
实施例8.试剂盒8
引物使用BIT007号引物对，试剂盒其它部分同实例一。
实施例9.试剂盒9
引物使用BIT008号引物对，试剂盒其它部分同实例一。