一种恶臭假单胞菌菌株及其应用技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种恶臭假单胞菌菌株及其应用。
背景技术
化学农药具有适用范围广、防治对象多、生产成本低、防治效果好以及经济效益高
等优点，其广泛适用极大地促进了现代农业的发展，提高了农业生产的劳动效率和机械化
程度。但是不可避免地，大量使用农药杀伤昆虫天敌和有益微生物、使有害生物产生抗性、
造成人、畜中毒、易对植物产生药害等问题，进入环境中的化学农药，一部分可通过阳光照
射、土壤中微生物等的作用，而逐步降解失效；另一部分最终会通过“食物链”的作用，进入
人体，对人造成长期危害。各类化学农药目前已广泛进入全球空气及大气沉降物、水体、土
壤、底泥级生物体等自然环境中，成为环境中无所不在的污染物，因此探索对农药残留进行
有效降解的方法成为研究人员长期努力的一个重要研究方向。而在该领域研究中，近年来
广泛兴起的使用微生物对农药残留进行生物降解成为热点领域，通过微生物作用将农药大
分子分解成小分子化合物，并使其丧失活性。由于微生物个体小、繁殖迅速、比表面大等特
点。它们较之其它生物更易适应环境，并可通过自然突变产生新菌种，产生新的酶系统，具
有新的代谢功能，从而可参与对人工新合成化合物的降解与转化作用，因此微生物对降解
农药残留具有巨大潜力。假单胞菌科的1属。专性需氧的革兰氏染色阴性无芽胞、无荚膜杆
菌，呈杆状或略弯。菌体大小(0.5～1)×(1.5～4)微米。具端鞭毛，能运动。大多数菌的适温
为30℃。DNA中的G+C克分子含量为58～70％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种恶臭假单胞菌菌株及其应用，旨在解决降解降解代森
锰锌农药残留的问题，提供一种高效降解降解代森锰锌农药残留的微生物菌种,该菌能高
效降解代森锰锌农药残留，该菌可以用于水体、土壤及表面残留的代森锰锌的生物降解。
本发明是这样实现的，一种恶臭假单胞菌菌株，所述阴沟肠杆菌菌株保藏编号为：
CGMCC No.12820。
本发明的另一目的在于提供一种恶臭假单胞菌菌株的培养方法，所述培养方法包
括：将所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌丝体接种到直径60毫米平皿培养基
上，在28-30℃，平皿培养基上生长3-5天；
解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml培养液
中，于28-30℃，240rmp/min转速条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培
养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂；
优选的，所述平皿LB培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，
蒸馏水1000ml，pH7.5；
优选的，所述液体LB培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水
1000ml，pH7.5。
本发明的另一目的在于提供一种所述恶臭假单胞菌菌株降解水体、土壤及烟叶表
面的甲霜灵农药残留的应用。
优选的，在经过培养的培养液100ml中，加入最终浓度5-10mg/L的代森锰锌农药，
于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
本发明提供的恶臭假单胞菌菌株，是烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解卵
菌杀菌剂---代森锰锌的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。该恶臭假单胞菌
(Pseudomonas putida)是一株具有极高活力，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，实
验表明该菌能够在LB培养基中利用代森锰锌作为唯一碳源和能源而生长，并使代森锰锌降
解；在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌48h能够将混入培养基中5mg/L的代森锰锌
降解90％以上，并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果，充分说明该菌可以用于水体
及表面残留的代森锰锌的生物降解，具有农药残留生物降解的工业化应用前景，也可以作
为研究恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)对代森锰锌农药残留降解机制的模式菌株。
附图说明
图1是本发明实施例提供的恶臭假单胞菌菌株分离方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明
进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于
限定本发明。
本发明实施例的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株，该菌株命名为恶臭假
单胞菌(Pseudomonas putida)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简
称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏日期是2016年8月8
日保藏编号为：CGMCC No.12820。
所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株为杆状，0.3μm～0.8μm×1.0μm
～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动。在LB培养基上培养24h后可形成
1.2mm菌落，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。为化能异养型，能够利用植物
根分泌的大部分养分迅速定殖于植物的根部，是最有潜力的促进植物生长的根围细菌之
一。
所述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株的培养过程为:将所述的恶臭假单
胞菌(Pseudomonas putida)菌丝体接种到直径60毫米平皿培养基上，在28-30℃，平皿培养
基上生长3-5天；解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml
培养液中，于28-30℃，240rmp/min转速条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解
酶的培养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂；
所述的平皿LB培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏
水1000ml，pH7.5；
所述的液体LB培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，
pH7.5。
在经过培养的培养液100ml中，加入最终浓度5-10mg/L的代森锰锌农药，于30℃，
转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
如图1所示，本发明提供的恶臭假单胞菌菌株，是烟草根部土壤中分离得到的一株
高效降解卵菌杀菌剂---代森锰锌的恶臭假单胞菌菌株。恶臭假单胞菌菌株的分离方法如
下：
S101：培养基配制：菌种保藏培养基(固体，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，
琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL；菌种活化培养基(固体，1L):胰蛋白胨
10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL；液体培养基(液
体，IL):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL。以上培养
基均在高压锅中121℃灭菌25分钟。
S102：菌种活化:挑去降解菌的菌丝，接种于加有菌种保藏培养基的60ml培养皿
中，于28℃，培养4天，然后用手术刀刮取培养基表面菌丝，接菌入液体培养基中，于30℃，
240转/分钟转速条件下振荡培养4-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1菌体的培养:用接种针挑取恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的菌丝
接种到上述菌种活化培养基平皿中，在温度为28℃培养箱中培养4天，菌株为杆状，0.3μm～
0.8μm×1.0μm～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动。用手术刀刮取菌体，
接种到装有500ml经121℃、0.1MPa下高压灭菌20min的培养液的锥形瓶中。再置于30℃，转
速240rmp/min，摇床震荡培养4天，获得菌丝及菌液混合菌剂。
实施例2补充碳源固态培养基中代森锰锌残留的降解:在菌种活化培养基灭菌降
温到40℃时，混入经过紫外灭菌30分钟的代森锰锌农药，浓度为5mg/L，充分混匀后，倒入直
径60ml的培养皿中，每培养皿3mL培养基，该培养基呈粉红色。将实施例1中培养好的菌丝沿
菌落边缘用6mm没直径的打孔器打成小片。待混有代森锰锌农药的培养基冷凝后，接入菌丝
小片，菌丝向下紧贴培养基表面。置于30℃培养箱中培养10天，培养基中的粉红色已褪去，
代森锰锌农药的分子结构被降解，培养基呈奶油色半透明状。
实施例3:降解菌菌剂对高浓度代森锰锌农药残留的降解
(1)在经过权利要求3培养的培养液100ml中，加入5mg/L的代森锰锌农药，于30℃，
转速240rmp/min，摇床震荡培养，以未经接种的培养液中加入相等浓度的代森锰锌农药作
为对照组；
(2)每隔12h取样一次，取3ml样品置于5OmL塑料离心管中，加入乙睛1OmL，在振荡
器上振荡30min，3000rmp/min下离心，取出上清液，重复3次，合并上清液，提取培养液中的
代森锰锌农药残留后，在固相萃取装置中经佛罗里硅土固相萃取柱(规格:500mg3ml)净化，
旋转蒸发仪浓缩(40℃以下)，-20℃下冷冻干燥，再用少量乙睛溶解提取到的农药残留，对
其进行气相色谱分析。
其降解率:降解率(％)＝(A-B)/A×100。
其中A为对照组代森锰锌农药残留值(48小时后残留值为4.7mg/L)，B为经降解菌
剂降解后的代森锰锌农药残留值(48小时后残留值为0.5mg/L)。
以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)为菌种，以杀菌剂为补充碳源，降解代森
锰锌。取3ml样品置于5OmL塑料离心管中，加入乙睛1OmL，在振荡器上振荡30min，3000rmp/
min下离心，取出上清液，重复3次，合并上清液，提取培养液中的代森锰锌农药残留后，在固
相萃取装置中经佛罗里硅土固相萃取柱(规格:500mg3ml)净化，旋转蒸发仪浓缩(40℃以
下)，-20℃下冷冻干燥，再用少量乙睛溶解提取到的农药残留，对其进行气相色谱分析。计
算降解率:降解率(％)＝(A-B)/A×100，其中A为对照组代森锰锌农药残留值(48小时后残
留值为4.7mg/L)，B为经降解菌剂降解后的代森锰锌农药残留值(48小时后残留值为0.5mg/
L)。在该培养条件下，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)在低浓度代下对代森锰锌农药
残留的降解率48小时内可达90％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精
神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。