单管内杂交诱捕为基础的核酸检测方法 1、技术领域：
本文涉及一种核酸提取及检测方法
2、技术背景：
核酸的提取是进行许多核酸操作分析的基础。目前核酸提取方法很多，如SDS法，CTAB法、离心柱法等，这些方法各有优缺点。这些核酸粗提物中往往含有大量的蛋白质、多糖、单宁和色素等，这些杂质有时很难从核酸中去除。大多数蛋白质可以通过氯仿或苯酚处理后变性，沉淀去除。在DNA提取中的RNA可以利用Rnase去除，但多糖、单宁等物质很难去除。这些杂质浓度高时，常常使核酸提取物呈胶状，更重要的是即使在很低浓度下他们也会干扰后续操作，如抑制PCR中DNA聚合酶的活性，抑制某些核酸修饰酶包括限制性内切酶的活性，阻碍Southern杂交或基因克隆，同时多糖杂质还会影响分光光度计对核酸浓度的测量。
核酸提取的目的是对某一段核酸进行操作，而我们提取的核酸往往是基因组核酸，基因组核酸中绝大部分不是我们需要的，它在核酸操作中起干扰作用。如在PCR操作中容易出现非特异性扩增等。诱捕法提取核酸可以去除非目标核酸，但用于诱捕的探针多非共价的固定在杂交膜上，诱捕后直接进行杂交，难以将诱捕到的核酸作为模板进行PCR扩增。而且这种杂交很容易造成核酸污染。灵敏度远远低于以诱捕到地核酸作模板扩增检测后检测的灵敏度。目前对核酸的操作中是将纯化的核酸转移到别的管中，而本发明杂交诱捕法将杂交诱捕与后续操作结合在一起，如在杂交、PCR、实时荧光PCR等全在同一管内操作，减少了核酸污染的可能。直接利用标记的杂交探针对杂交诱捕到的核酸进行杂交检测，检测速度快、结果准确。
将杂交诱捕后的核酸作为模板进行PCR，PCR引物设计中以诱捕用寡核苷酸作为反向引物，在PCR扩增中，该诱捕链也参与扩增，在Taq酶的作用下，PCR产物沿着该诱捕链方向延伸，形成一条固定在管壁上的双链。将双链变性后用标记的探针与固定在管壁上的单链杂交，再用碱性磷酸酶进行ELISA反应检测。同时对液相产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。该方法将PCR与ELISA有机结合起来，利用了PCR的高效性与ELISA的高特异性。通过双重检测PCR产物，PCR-ELISA的结果判定是通过酶标仪数字输出。结果准确可靠，无人为因素。在核酸诱捕后，也可以利用实时荧光PCR对诱捕到的核酸直接进行检测，快速灵敏准确。
3、发明内容：
本发明将核酸提取与杂交、PCR、实时荧光PCR结合起来，建立了一种在同一PCR管内快速准确灵敏的核酸检测方法。
(1)技术方案：
为实现本发明的目的，本发明分为以下几个步骤：
诱捕PCR管的制备向PCR管中加入新配置包被液，一定温度下温育，洗液洗后、干燥后保存。包被液中含有寡核苷酸、甲基咪唑及EDC。包被液中寡核苷酸的浓度为10-1000nM，10mM EDC的浓度为5-20mM，甲基咪唑浓度为10mM。温育的温度为40-60℃，温育时间为(4-24h)。
核酸的杂交诱捕适量样品中加入DNA抽提液，抽提蛋白后将抽提液加入到包被好的PCR管中，高温下使核酸变性，一定温度下诱捕。DNA抽提液可以为SDS法或CTAB法的抽提液，优化过的诱捕温度为40-60℃。如果对诱捕链直接进行杂交检测，诱捕的同时在诱捕液中加入标记探针。
PCR扩增杂交诱捕到的核酸作为PCR扩增的模板，扩增条件因核酸序列不同而有差异。若要进行固相产物的杂交检测，加入到扩增体系中的固相引物浓度低于液相引物的浓度。固相引物为与包被在诱捕PCR管上序列相同的序列，液相引物为另一条引物。若要进行实时荧光PCR，在反应体系中加入标记探针。
液相产物的凝胶电泳检测取液相产物8ul，80V电压2％琼脂糖凝胶电泳40min，EB染色30min，凝胶成像仪观察结果。
(2)技术效果：
采用本方法对核酸进行检测，从核酸提取到检测全部在一个PCR管中进行。减少了检测步骤，提高了检测速度，降低了核酸污染的可能性，而且结果准确可靠。
(3)实施例：
实施例1：
诱捕到的核酸的杂交检测
1.诱捕PCR管的制备
(1)每PCR孔加新配置包被液100ul，50℃温育5h(4-24h)。
(2)弃包被液，洗液洗3次，浸5min，再洗3次。
(3)无菌双蒸水水洗3次，浸5min，再洗3次。
(4)室温干燥，4℃或更低温度保存。
包被液：100nM 5′氨基化引物，10mM EDC，10mM甲基咪唑(1-Melm)(pH7.0)。EDC：(Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide碳二亚氨)
洗液：100mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，0.1％Tween-20。
2、核酸的杂交诱捕
(1)取适量样品加入5倍体积的DNA抽提液，研磨，95℃水浴5min，加入等体积的酚/氯仿/异物醇抽提一次。
(2)抽提上清夜100ul，加入10ul 10nM的DIG标记探针，加入包被好的诱捕PCR管中，95℃温育2min，置于冰上1min，45℃温育10-60min。
3.杂交链的检测
(1)弃诱捕液，0.5×SSC，0.1％Tween-20，洗4次，每次浸3min。
(2)加100ul DIG-AP(1∶2500，溶于含0.5％BR洗液)。
(6)50℃密封1h，弃液体，洗液洗4次，每次浸3min。
(7)加100ul显色液，室温显色30-60min。
(8)酶标仪405nm读数，读数减去空白，高于1.0为阳性，低于0.2为阴性。
显色液：0.1％PNPP，1M二乙醇胺(PH 9.8)，1mM MgCl2
实施例2：
杂交诱捕PCR-ELISA检测
1、诱捕PCR管的制备(步骤同上)
2、核酸的杂交诱捕
(1)取适量样品加入5倍体积的DNA抽提液，研磨，95℃水浴5min，加入等体积的酚/氯仿/异物醇抽提一次。
(2)抽提上清夜100ul，加入包被好的诱捕PCR管中，95℃温育2min，置于冰上1min，45℃温育10-60min。
(3)洗液洗3次，完成核酸的诱捕。
DNA抽提液：0.8M NaCL，100mM Tris-HCL(PH8.0)，20mM EDTA，1％SDS
3.PCR扩增
扩增条件因序列不同而有差异，为使液相产物和固相产物相平衡，液相引物与固相引物的浓度比为8∶1，固相引物为与包被在诱捕PCR管上序列相同的引物，液相引物为另一条引物
4.液相产物的凝胶电泳检测
取液相产物8ul，80V电压2％琼脂糖凝胶电泳40min，EB染色30min，凝胶成像仪观察结果。
5.固相产物的杂交检测
(1)弃液相产物，新配变性液洗4次，每次浸3min。
(2)洗液洗4次，每次浸3min。
(3)加100ul杂交液，50℃密封温育1h。
(4)弃杂交液，0.5×SSC，0.1％Tween-20，洗4次，每次浸3min。
(5)加100ulDIG-AP(1∶2500，溶于含0.5％BR洗液)。
(6)50℃密封1h，弃液体，洗液洗4次，每次浸3min。
(7)加100ul显色液，室温显色30-60min。
(8)酶标仪405m读数，读数减去空白，高于1.0为阳性，低于0.2为阴性。
变性液：0.2M NaOH，0.1％Tween-20
杂交液：50nM DIG-probe，5×SSC，0.1％Tween-20，0.5％BR
显色液：0.1％PNPP，1M二乙醇胺(PH9.8)，1mM MgCl2
实施例3：
杂交诱捕实时荧光检测
1.诱捕PCR管的制备他(步骤同上)。
2、核酸的杂交诱捕(步骤同上)。
3、实时荧光PCR
在诱捕有核酸的PCR管内作实时荧光PCR，反应体系：10×PCR缓冲液2.5μl，25mmol/LMgCl2 5μl，10mMdATP、dUTP、dGTP、dCTP各0.5μl，20μmol/L引物各0.5μl，20μlmol/L探针1μl，1U/μl UNG酶0.15μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加灭菌双蒸水使总体积为25μl。将加有PCR反应液的PCR管放入ABIPRISM7700 96孔反应板上，打开Sequence Detection 1.71，设置PCR反应条件，第一个循环为50℃，2min，95℃，10min；后40个循环为94℃，15S；68℃，1min。点击运行，进行PCR反应，1小时56分钟反应结束，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果。给出ΔRn(第n循环时的荧光信号增加值)与循环数图象。