糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法及用途技术领域
本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法
及用途，特别是涉及通过单糖或者双糖的糖醛基和血红蛋白肽链上的氨基酸残基之间的偶
联反应制备出生物相容性好、稳定性高的糖-血红蛋白纳米粒子，以及此糖-血红蛋白纳米
粒子在药物递送和血浆扩容领域的应用。
背景技术
生物医学材料(Biomedical Materials)是用于诊断、治疗、修复或替换人体组织、
器官或增进其功能的一类高技术新材料。医用高分子材料是生物医学材料中发展最早、应
用最广泛、用量最大的材料，它既可以来源于天然产物，又可以人工合成。按照不同的性质，
医用高分子材料可分为非降解型和可降解型两类。前者在生物环境中能长期保持稳定，不
发生降解、交联或物理磨损等，且本身和少量的降解产物不会对机体产生明显的毒副作用，
主要包括聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、芳香聚酯、聚硅氧烷、聚甲醛等，主要用作人体软、硬
组织修复体、人工器官、人造血管、接触镜、膜材、粘接剂和管腔制品等。后者可在生物环境
作用下发生结构破坏和性能蜕变，其降解产物能通过正常的新陈代谢被机体吸收利用或排
出体外，主要包括蛋白质、线性脂肪族聚酯、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚己丙酯
等，主要用于药物释放和送达载体以及非永久性植入装置。
纳米药物递送系统是医用高分子材料发展的一个重要分支，其在提高药物的治疗
指数以及安全性等方面颇具潜力，可以通过改善药物的水溶性或稳定性，增强药物疗效、降
低药物毒性、延长药物处于稳态血药浓度的时间。此外，纳米药物递送系统还可用于肿瘤的
靶向治疗。
血红蛋白来源于动物血液，其产量高，生物相容性好，在生物医用材料领域具有潜
在价值。作为一种蛋白质材料，其具有以下优势：①从肽链结构分析可知，血红蛋白具有极
强的可修饰性，其分子结构中含有多个反应基团，如-NH2，-COOH，-OH，-SH等，可在其内部或
者表面引入多种活性小分子或者大分子，选择性的提高血红蛋白的稳定性、靶向性以及体
内滞留时间。②血红蛋白具有多样性的药物负载方式，其肽链中含有多个带电荷的氨基酸
残基(如赖氨酸、精氨酸、谷氨酸等)，可作为不同药物的结合位点、实现不同方式的药物负
载。同时血红蛋白具有不同于其他蛋白质的立体空间结构，其立体构型中包含有四个疏水
性“口袋”，可实现对疏水性药物(如紫杉醇、长春新碱等)的高包封率负载。③血红蛋白是体
内生物活性肽的“肽库”，分子中存在多种生物活性肽片段，如抗菌肽(α1-23，α107-136，β
126-145)、血啡肽(β31-41)、ACE抑制肽(α34-39，β130-135，β64-69)等。
糖是人体必需的一种营养素，提供人体生命活动必需的能量。在整个人体系统中，
不同部位对于糖的吸收和利用存在一定的差异。由于肿瘤细胞存在异于正常细胞的糖代谢
途径，造成肿瘤细胞对葡萄糖的过度吞噬现象。肝实质细胞表面存在特异性的受体蛋白，能
特异性的识别含有乳糖基或者半乳糖基的分子；而存在于肝非实质细胞、脾脏内皮细胞的
甘露糖受体能识别以甘露糖、岩藻糖以及N-乙酰葡萄糖胺为终端的糖类分子。因此，用糖分
子修饰载体体系，不但能提高其生物相容性，而且可以赋予载体系统不同的靶向性能。
本发明立足于体内递送系统理论，基于血红蛋白和小分子糖，利用化学工程的方
法构建了一种糖-血红蛋白纳米粒子，评价了其作为药物载体系统的可行性。结果表明，这
种糖-血红蛋白纳米粒子具有很好的生物相容性，生物降解性以及体内靶向性，在药物递送
方面具有广泛的应用前景。同时，该体系亦表现出良好的胶体特性，具有一定的胶体渗透
压，且在体毒性低，血浆扩容效果好，能够作为血浆扩容剂使用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有良好生物相容性和可降解
性的糖-血红蛋白纳米粒子。
本发明的第二个目的是提供一种糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种糖-血红蛋白纳米粒子在药物递送方面的用途。
本发明的第四个目的是提供一种糖-血红蛋白纳米粒子作为血浆扩容剂的用途。
本发明的目的主要通过以下技术方案实现：
一种糖-血红蛋白纳米粒子，其特征是通过糖分子上的末端醛基和血红蛋白肽链
上的氨基酸残基之间的偶联反应制备，所述的血红蛋白为来源于哺乳动物血液的血红蛋白
或血红蛋白脱血红素后得到的珠蛋白，所述的糖为核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、
甘露糖或乳糖中的任意一种。
本发明所述的糖-血红蛋白纳米粒子可通过疏水作用和静电作用负载抗肿瘤药物
紫杉醇、阿霉素、长春新碱、甲氨蝶呤、顺铂。
本发明所述的糖-血红蛋白纳米粒子可在糖-血红蛋白纳米粒子中以共价键的方
式引入荧光素，或者利用京尼平交联的方式在其内引入自荧光发色团。
一种糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法，其特征是将摩尔比为10：1～200：1的糖和
血红蛋白溶解于pH＝9～13的缓冲溶液中，37℃搅拌反应30小时，然后加入还原剂终止反
应，体系透析、冷冻干燥，即得。所述的还原剂为硼氢化钠或抗坏血酸。
一种负载亲水性抗肿瘤药物的糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法，其特征是将糖-
血红蛋白纳米粒子分散在pH＝9的缓冲溶液中，加入抗肿瘤药物(阿霉素、顺铂)的水溶液，
室温搅拌过夜，体系透析，冷冻干燥，即得。
一种负载疏水性抗肿瘤药物的糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法，其特征是将糖-
血红蛋白纳米粒子分散在pH＝9的缓冲溶液中，加入少量二甲基亚砜及疏水性抗肿瘤药物
(紫杉醇、甲氨蝶呤、长春新碱)的二甲基亚砜溶液，室温搅拌过夜，体系透析、离心除去不溶
物、冷冻干燥，即得。
一种键合荧光素的糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法，其特征是将糖-血红蛋白纳
米粒子分散在pH＝9的缓冲溶液中，加入异硫氰酸荧光素(FITC)的二甲基亚砜溶液，4℃搅
拌过夜，体系透析、冷冻干燥，即得。
一种京尼平交联的糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法，其特征是将糖-血红蛋白纳
米粒子分散在pH＝9的缓冲溶液中，选择性加入含有游离氨基的氨基酸溶液，然后加入1～
100mM的京尼平溶液，37℃震荡反应24小时，体系透析，冷冻干燥，即得。
一种糖-血红蛋白纳米粒子在药物递送领域的应用。
一种糖-血红蛋白纳米粒子在制备血浆扩容剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的糖-血红蛋白纳米粒子具有如下的优势：
①本发明的糖-血红蛋白纳米粒子通过糖分子的糖醛基和血红蛋白肽链上的氨基
酸残基之间的偶联反应制备，一方面保留了血红蛋白自身的生物特性，具有良好的生物相
容性和生物可降解性；另一方面其表面的糖分子残基可以选择性的被肿瘤细胞识别，通过
改变糖分子的种类可以选择性的调节纳米粒子的肿瘤识别性，特异性识别不同种类的肿瘤
细胞。
②本发明的糖-血红蛋白纳米粒子可以通过疏水作用和静电作用负载紫杉醇、阿
霉素、长春新碱、甲氨蝶呤、顺铂等抗肿瘤药物，实现药物的有效负载和体内递送。
③本发明的糖-血红蛋白纳米粒子表现出良好的胶体性质，具有一定的胶体渗透
压和扩充血容量作用。
④本发明的糖-血红蛋白纳米粒子制备方法简单、反应条件温和，且安全无损，提
供了一种新的体内递送体系类型以及合成方法，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例3葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的原子力显微镜形貌图。
图2为本发明实施例7核糖-珠蛋白纳米粒子的原子力显微镜形貌图。
图3为本发明实施例11乳糖-珠蛋白纳米粒子的原子力显微镜形貌图。
图4为本发明实施例16糖-珠蛋白纳米粒子的体外细胞存活率。
图5为本发明实施例17负载阿霉素的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的体外细胞存活率。
图6为本发明实施例18肝癌细胞和肝细胞对键合荧光素FITC的葡萄糖-珠蛋白纳
米粒子的细胞吞噬速度。
图7为本发明实施例19肝癌细胞对阿霉素和负载阿霉素的葡萄糖-珠蛋白纳米粒
子的吞噬速度。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本发明的内容
而非限制本发明的保护范围：
实施例1葡萄糖-血红蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为100：1的葡萄糖和血红蛋白溶解于pH＝12的缓冲溶液中，37℃搅拌反
应30小时，然后加入硼氢化钠终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到葡萄糖-血红蛋白纳米粒
子。马尔文粒度仪测量：粒径为173.1nm，粒径分布为0.168。
实施例2葡萄糖-血红蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为20：1的葡萄糖和血红蛋白溶解于pH＝13的缓冲溶液中，37℃搅拌反应
30小时，然后加入硼氢化钠终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到葡萄糖-血红蛋白纳米粒
子。马尔文粒度仪测量：粒子粒径为220.2nm，粒径分布为0.264。
实施例3葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为120：1的葡萄糖和珠蛋白溶解于pH＝13的缓冲溶液中，37℃搅拌反应
30小时，然后加入硼氢化钠终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到葡萄糖-珠蛋白纳米粒子。
马尔文粒度仪测量：粒子粒径为309.9nm，粒径分布为0.216。原子力显微镜检测：形状为球
形，粒径范围为90～120nm，见图1。
实施例4甘露糖-血红蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为200：1的甘露糖和血红蛋白溶解于pH＝13的缓冲溶液中，37℃搅拌反
应30小时，然后加入硼氢化钠终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到甘露糖-血红蛋白纳米粒
子。马尔文粒度仪测量：粒子粒径为197.4nm，粒径分布为0.134。
实施例5半乳糖-血红蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为100：1的甘露糖和血红蛋白溶解于pH＝12的缓冲溶液中，37℃搅拌反
应30小时，然后加入硼氢化钠终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到半乳糖-血红蛋白纳米粒
子。马尔文粒度仪测量：粒子粒径为151.7nm，粒径分布为0.101。
实施例6核糖-血红蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为100：1的核糖和血红蛋白溶解于pH＝12的缓冲溶液中，37℃搅拌反应
30小时，然后加入抗坏血酸终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到核糖-血红蛋白纳米粒子。
马尔文粒度仪测量：粒子粒径为175.8nm，粒径分布为0.089。
实施例7核糖-珠蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为120：1的核糖和珠蛋白溶解于pH＝12的缓冲溶液中，37℃搅拌反应30
小时，然后加入硼氢化钠终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到核糖-珠蛋白纳米粒子。马尔
文粒度仪测量：粒子粒径为162.8nm，粒径分布为0.189。原子力显微镜检测：形状为球形，粒
径范围为100～130nm，见图2。
实施例8阿拉伯糖-血红蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为150：1的阿拉伯糖和血红蛋白溶解于pH＝9的缓冲溶液中，37℃搅拌反
应30小时，然后加入抗坏血酸终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到阿拉伯糖-血红蛋白纳米
粒子。马尔文粒度仪测量：粒子粒径为277.2nm，粒径分布为0.186。
实施例9木糖-血红蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为100：1的木糖和血红蛋白溶解于pH＝12的缓冲溶液中，37℃搅拌反应
30小时，然后加入抗坏血酸终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到木糖-血红蛋白纳米粒子。
马尔文粒度仪测量：粒子粒径为244.5nm，粒径分布为0.048。
实施例10乳糖-血红蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为100：1的乳糖和血红蛋白溶解于pH＝11的缓冲溶液中，37℃搅拌反应
30小时，然后加入硼氢化钠终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到乳糖-血红蛋白纳米粒子。
马尔文粒度仪测量：粒子粒径为172.9nm，粒径分布为0.106。
实施例11乳糖-珠蛋白纳米粒子的制备
将摩尔比为120：1的乳糖和珠蛋白溶解于pH＝11的缓冲溶液中，37℃搅拌反应30
小时，然后加入硼氢化钠终止反应，体系透析、冷冻干燥，得到乳糖-珠蛋白纳米粒子。马尔
文粒度仪测量：粒子粒径为182.7nm，粒径分布为0.053。原子力显微镜检测：形状为球形，粒
径范围为80～120nm，见图3。
实施例12负载阿霉素的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的制备
将实施例3制备的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子分散在pH＝9的缓冲溶液中，加入一定
量的阿霉素水溶液，室温搅拌过夜，调节pH11，搅拌2小时，体系透析，冷冻干燥，得到负载阿
霉素的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子。马尔文粒度仪测量：粒子粒径为234.5nm，粒径分布为
0.225，药物负载量为84.93±5.74μg/mg。
实施例13负载紫杉醇的核糖-珠蛋白纳米粒子的制备
将实施例7制备的核糖-珠蛋白纳米粒子20mg分散在4mL pH＝9的缓冲溶液中，加
入2mL二甲基亚砜，室温搅拌3小时，使其充分溶胀，再加入一定量的紫杉醇的二甲基亚砜溶
液，室温搅拌过夜，体系透析、离心除去不溶物、冷冻干燥，得到负载紫杉醇的核糖-珠蛋白
纳米粒子。马尔文粒度仪测量：粒子粒径为256.8nm，粒径分布为0.289，药物负载量为64.93
±6.84μg/mg。
实施例14键合荧光素FITC的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的制备
将实施例3制备的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子分散在pH＝9的缓冲溶液中，按照荧光
素FITC：纳米粒子质量比为0.15：1，加入异硫氰酸荧光素(FITC)的二甲基亚砜溶液，4℃搅
拌过夜，再加入5mol/L的氯化铵溶液至其终浓度为50mmol/L，4℃搅拌2小时，终止反应。体
系透析、冷冻干燥，得到呈黄绿色的键合荧光素FITC的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子。
实施例15京尼平交联的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的制备
将实施例3制备的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子分散在pH＝9的缓冲溶液中，加入1％
(w/w)的京尼平溶液使反应体系中京尼平的浓度为0.2％，37℃震荡反应24小时，得蓝色溶
液，体系透析，冷冻干燥，得到京尼平交联的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子。
实施例16糖-珠蛋白纳米粒子的体外细胞存活率
细胞培养：选择L-O2细胞(人肝细胞)和Hep G2细胞(人肝癌细胞)作为实验细胞，
培养基使用含有10％(体积分数)胎牛血清以及双抗(100单位/mL)的DMEM培养基，37℃，5％
二氧化碳的无菌细胞培养箱培养细胞。
取处于对数生长期的细胞接种于96孔板，细胞培养箱中培养24小时，加入利用无
糖或者4.5g/L葡萄糖的DMEM培养基配置的糖-珠蛋白纳米粒子溶液(实施例3葡萄糖-珠蛋
白纳米粒子、实施例7核糖-珠蛋白纳米粒子、实施例11乳糖-珠蛋白纳米粒子)，每组样品重
复5个孔，细胞培养箱中培养48小时，吸出孔中液体，加入0.1mL MTS检测试剂，培养箱中孵
育1小时，酶标仪检测各孔在490nm波长处的吸光度值，实验结果见图4。
实施例17负载阿霉素的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的体外细胞存活率
取处于对数生长期的细胞接种于96孔板，细胞培养箱中培养24小时，加入阿霉素
溶液和利用含有不同浓度葡萄糖(0，2.5g/L或4.5g/L)的DMEM培养基配置的负载阿霉素的
葡萄糖-珠蛋白纳米粒子溶液(实施例12)，每组样品重复5个孔，细胞培养箱中培养48小时，
吸出孔中液体，加入0.1mL MTS检测试剂，培养箱中孵育1小时，酶标仪检测各孔在490nm波
长处的吸光度值，实验结果见图5。
实施例18肝癌细胞和肝细胞对键合荧光素FITC的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的细胞
吞噬速度
取处于对数生长期的细胞接种于96孔板，细胞培养箱中培养24小时，吸出孔中液
体，加入利用含有不同浓度葡萄糖(0，2.5g/L或4.5g/L)的DMEM培养基配置的键合荧光素
FITC的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子溶液(实施例14)，分别于3、6、20、27小时后吸出孔中液体，
细胞核染色，用高内涵细胞成像分析系统检测各孔细胞内的荧光强度，实验结果见图6。
实施例19肝癌细胞对阿霉素和负载阿霉素的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子的吞噬速度
取处于对数生长期的细胞接种于96孔板，细胞培养箱中培养24小时，吸出孔中液
体，加入浓度为1μg/mL的阿霉素和利用含有不同浓度葡萄糖(0，2.5g/L或4.5g/L)的DMEM培
养基配置的负载阿霉素的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子溶液(实施例12)，分别于3、6、18、24小时
后吸出孔中液体，用高内涵细胞成像分析系统检测各孔细胞内的荧光强度，实验结果见图
7。
实施例20糖-珠蛋白纳米粒子的在体毒性检测
实验选择体重为20±2g的BALB/c雄性裸鼠。将动物分成四组，对照组通过尾静脉
注射0.2mL生理盐水，实验组注射0.2mL浓度为10mg/mL的葡萄糖-珠蛋白纳米粒子(实施例
3)、核糖-珠蛋白纳米粒子(实施例7)、乳糖-珠蛋白纳米粒子(实施例11)的生理盐水溶液。
常规饲养14天，观察对照组和实验组的裸鼠死亡率。
结果显示，观察期内对照组和实验组的裸鼠无死亡现象，小鼠活动、摄食、毛发、大小便
正常；体重呈逐渐增长趋势，对照组和实验组无显著性差异，说明糖-珠蛋白纳米粒子无严
重急性中毒的危险性。
实施例21糖-珠蛋白纳米粒子的理化性能
配制不同浓度的糖-珠蛋白纳米粒子溶液(实施例3、实施例7、实施例11)，观察其
理化性质，结果见表1。
表1不同浓度的糖-血红蛋白纳米粒子的理化性质
实施例22糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品的胶体渗透压
用生理盐水冲洗胶体渗透压仪渗透膜的两侧，1mL一次性注射器吸取浓度为2.5％
的糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品，将其插入样品孔，调零，按提示分步注入样品，直至出现
结果，每份样品测定3次，取平均值，结果见表2。
表2三种糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品的胶体渗透压
实施例23糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品的粘度
将糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品于37℃孵育15min，采用RM300+ST-100同轴旋转
粘度计，选择不同剪切速率测定浓度为2.5％的糖-珠蛋白血浆代用品的粘度，结果见表3。
表3三种糖-珠红蛋白纳米粒子血浆代用品的粘度
实施例24失血性休克模型的制备和血浆代用品的输注
用2％戊巴比妥钠(50mg/kg)对大鼠进行腹腔麻醉，常规手术分离股动脉、股静脉
和颈总动脉并插管，静脉输注1000U/kg肝素钠使全血肝素化。将颈动脉插管与压力传感器
相连记录血压，心电电极按标准肢体导联于动物四肢记录心电和心率，温度传感器插入肛
门约5cm记录直肠温度，股动脉插管联于恒流泵以备放血，股静脉用于全血回输以及输注
糖-血红蛋白纳米粒子血浆代用品，用手术灯给动物保温。匀速放血15min，使平均动脉压
MAP降至45mmHg，通过间断放血使血压维持在45～65mmHg约45min，制作失血性休克模型。
将模型大鼠随机分成对照组、葡萄糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品给药组(实施例
3)、核糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品给药组(实施例7)和乳糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用
品给药组(实施例11)，经股静脉输注生理盐水、葡萄糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品、核糖-
珠蛋白纳米粒子血浆代用品和乳糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品，用量为失血量的1/2，速
度为0.5ml/min，检测MAP、心电图、肛温和失血量，观测动物的存活情况。
模型大鼠失血量占总血量的百分比[总血量按照体重的6％(ml/g)计算]和血压的
结果表明，失血性休克大鼠模型制备成功，且组间不存在显著性差异。
采用糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品对失血性休克大鼠进行救治，可以观测到动
物血容量扩增。例如，给予糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品后某些时间，动物血液中红细胞
压积较对照组明显下降(结果见表4)，血浆粘度较对照组明显下降(结果见表5)。
表4失血性休克大鼠给予糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品不同时间的红细胞压积
表5失血性休克大鼠给予糖-珠蛋白纳米粒子血浆代用品不同时间的血浆粘度