用于动脉硬化性疾病的靶向SALUSIN的治疗剂和检测试剂.pdf

本发明提供一种用于动脉硬化性疾病的预防和治疗剂以及用于检测动脉硬化性疾病的方法或试剂。此外，本发明提供包括salusin-α作为活性成分的用于动脉硬化性疾病的治疗剂、包括salusin-β的拮抗剂作为活性成分的用于动脉硬化性疾病的治疗剂、以及用于检测动脉硬化性疾病的方法，上述方法包括化验生物样品中的salusin-α。

1.  一种用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其包括salusin-α作为活性成分。

2.  一种用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其包括salusin-β的拮抗剂作为活性成分。

3.  根据权利要求2所述的用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其中所述salusin-β的拮抗剂是抗salusin-β抗体。

4.  根据权利要求1-3中任意一项所述的用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。

5.  一种用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其包括salusin-α，并包括salusin-β的拮抗剂。

6.  根据权利要求5所述的用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其中所述salusin-β的拮抗剂是抗salusin-β抗体。

7.  根据权利要求5或6所述的用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。

8.  一种用于检测动脉硬化性疾病的方法，其包括化验生物样品中的salusin-α。

9.  根据权利要求8所述的用于检测动脉硬化性疾病的方法，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。

10.  根据权利要求8或9所述的用于检测动脉硬化性疾病的方法，其中所述生物样品选自血清、血浆和尿。

11.  一种用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其包括化验生物样品中的salusin-α。

12.  根据权利要求11所述的用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。

13.  根据权利要求11或12所述的用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其中所述生物样品选自血清、血浆和尿。

14.  一种用于检测动脉硬化性疾病的诊断标志物，其包括salusin-α。

15.  根据权利要求14所述的用于检测动脉硬化性疾病的诊断标志物，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。

16.  一种用于检测动脉硬化性疾病的试剂，其包括抗salusin-α抗体，并使用salusin-α作为检测动脉硬化性疾病的诊断标志物。

17.  根据权利要求16所述的用于检测动脉硬化性疾病的试剂，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。

用于动脉硬化性疾病的靶向Salusin的治疗剂和检测试剂
技术领域
本发明涉及用于动脉硬化性疾病(arteriosclerotic disease)的靶向(target)salusin-α或salusin-β的预防和治疗剂。本发明进一步涉及通过靶向salusin-α来检测动脉硬化性疾病的方法或试剂。
背景技术
根据2005年由厚生劳动省(Ministry of Health，Labor and Welfare)发布的“人口动态统计(Dynamic Statistics of the Population)”，在日本由于癌症造成的死亡人数为326,000，使其成为死亡的主要原因，其次是心脏病(173,000)，其是第二大死亡原因，以及中风(133,000)，其是第三大死亡原因。心脏病和中风的总死亡人数几乎与癌症相当。具体地，缺血性心脏病(其是心脏病的代表性实例)和脑梗塞(其是中风的典型疾病模式)的发展以动脉硬化为基本病理状态。因此，预防动脉硬化的发病和发展对于保持和增强国民的健康是非常重要的。
在动脉硬化的原发病灶中特征性的病理发现是巨噬细胞源性泡沫细胞的聚集，其中胆固醇酯积聚在细胞内。巨噬细胞经多种清道夫受体将修饰的LDL诸如氧化低密度脂蛋白(氧化LDL)结合至细胞内。胆固醇酯是一种重要的氧化LDL胆固醇，其在溶酶体内被降解为游离的胆固醇和脂肪酸。当细胞内游离胆固醇水平达到过度的程度时，其由两种机制调节。第一种机制是通过ATP结合盒转运体(ATP-bindingcassette transporter)A1(ABCA-1)胆固醇外流至细胞外，第二种机制是通过酰基-CoA：胆固醇酰基转移酶-1(ACAT-1)转变为胆固醇酯。当胆固醇酯积聚在细胞质中时，巨噬细胞转变为泡沫细胞，形成动脉硬化的原发病灶。
动脉硬化的原发病灶中的另一特征型病理发现是其中积聚了胆固醇酯的巨噬细胞源性泡沫细胞的聚集。巨噬细胞源性泡沫细胞分泌多种细胞因子，诱导血管平滑肌细胞从动脉的中膜迁移至动脉内膜，或诱导该血管平滑肌细胞在动脉内膜内增殖。已经迁移至动脉内膜的血管平滑肌细胞合成并分泌细胞外基质，使动脉内膜变厚。这种内膜增厚导致血管腔变窄并减少血流。来自血管平滑肌细胞的泡沫细胞还见于中期动脉硬化时和之后。
Salusin是最近通过生物信息学分析鉴别的循环调节物质。有两种称为salusin-α和salusin-β的相关肽类(见非专利文件1)。东京医科齿科大学(Tokyo Medical and Dental University)的Nanasato等人搜索了人cDNA数据库，以筛选编码具有明显的信号序列的分泌性蛋白的基因。将这些基因转染进培养的血管内皮细胞中，然后将培养上清液加入至培养的血管平滑肌细胞中，从而鉴别出诱导细胞内Ca²⁺浓度增加的基因salusin(见非专利文件2)。Salusin-α包括28个氨基酸，salusin-β包括20个氨基酸。它们通过其前体preprosalusin的加工而产生。Preprosalusin由242个氨基酸组成，并且在对TOR2A基因进行选择性剪接使得发生移码时得以生物合成，上述TOR2A基因是TOR1A(DYT1)的相关基因，已有报道TOR1A(DYT1)是早发性扭转性肌张力障碍的致病基因。由于在N-端上有26个氨基酸的信号序列，推断两种salusin从216个氨基酸的Prosalusin的C-端侧生物合成。salusin-α和salusin-β二者的表达分布在人血管壁细胞、内分泌-中枢神经系统等中得以证实。目前，可以通过放射免疫测定来测量人血清和尿中的salusin-α浓度。对于健康受试者，结果分别为23.3±8.1pM和156.8±95.8pM(见非专利文件3)。其主要效应已经在大鼠中得到证实，包括强降血压效应、强降心率效应(β＞α)、促进脑垂体分泌加压素的效应(仅有β)以及促进血管平滑肌细胞和成纤维细胞增殖的效应(β＞α)。
非专利文件1：Shichiri M等人，Nat Med.2003；9：1166-1172。
非专利文件2：Masayoshi Nanasato，Journal of ExperimentalMedicine Vol.210，No.42004.7.24，pp.267-270
非专利文件3：Sato K等人，Peptides.2006；27：2561-2566。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于动脉硬化性疾病的预防和治疗剂。本发明的另一目的是提供用于检测动脉硬化性疾病的方法和试剂。
本发明的发明人已经推知，新的控制血压、心率等的血管活性物质salusin以类似于已知血管活性物质尾加压素(urotensin)II和5-羟色胺的方式作用于巨噬细胞，从而对巨噬细胞的泡沫化产生影响；即，它们在动脉硬化病变(arteriosclerotic lesion)的形成中发挥重要作用。因此，发明人集中于控制巨噬细胞的泡沫化和这种控制所必需的酶ACAT-1的表达调控。发明人还考察了salusin-α和salusin-β的作用。由此，发明人已经发现，salusin在动脉硬化病变的形成中发挥重要的病理生理作用。具体来说，发明人已经发现，salusin-α抑制巨噬细胞的泡沫化，从而抑制动脉硬化病变的形成，salusin-β则促进巨噬细胞的泡沫化，从而促进动脉硬化病变的形成。发明人由此进一步发现，能够抑制salusin-β或salusin-α的作用的化合物可以用于预防或治疗动脉硬化性疾病。此外，发明人已经发现，动脉硬化病变与生物样品中salusin-α的浓度呈负相关，salusin-α可以用作检测动脉硬化性疾病的标志物。由此，发明人完成了本发明。
本发明如下。
[1]一种用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其包括salusin-α或salusin-α的激动剂(agonist)作为活性成分。
[2]一种用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其包括salusin-β的拮抗剂(antagonist)作为活性成分。
[3]根据[2]所述的用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其中所述salusin-β的拮抗剂是抗salusin-β抗体。
[4]根据[1]-[3]中任意一项所述的用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血(encephalorrhagy)、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症(arteriosclerosis obliterans)。
[5]一种用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其包括salusin-α或salusin-α的激动剂和salusin-β的拮抗剂。
[6]根据[5]所述的用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其中所述salusin-β的拮抗剂是抗salusin-β抗体。
[7]根据[5]或[6]所述的用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
[8]一种用于检测动脉硬化性疾病的方法，其包括化验(assay)生物样品中的salusin-α。
[9]根据[8]所述的用于检测动脉硬化性疾病的方法，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
[10]根据[8]或[9]所述的用于检测动脉硬化性疾病的方法，其中所述生物样品选自血清、血浆和尿。
[11]一种用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其包括化验生物样品中的salusin-α。
[12]根据[11]所述的用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
[13]根据[11]或[12]所述的用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其中所述生物样品选自血清、血浆和尿。
[14]一种用于检测动脉硬化性疾病的诊断标志物，其包括salusin-α。
[15]根据[14]所述的用于检测动脉硬化性疾病的诊断标志物，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
[16]一种用于检测动脉硬化性疾病的试剂，其包括抗salusin-α抗体并使用salusin-α作为检测动脉硬化性疾病的诊断标志物。
[17]根据[16]所述的用于检测动脉硬化性疾病的试剂，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
本说明书包括本申请的优先权文件日本专利申请第2007-127131号的说明书和/或附图所公开的部分或全部内容。
附图说明
图1显示了salusin-α和salusin-β及其氨基酸序列之前的关系。
图2A显示了salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞中酰基-CoA：胆固醇酰基转移酶-1(ACAT-1)蛋白质表达的剂量依赖性影响。具体地，图2A显示了salusin的剂量依赖性影响(0nM至0.6nM)。
图2B显示了salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞中ACAT-1蛋白质表达的剂量依赖性影响。具体地，图2B显示了salusin的剂量依赖性影响(0nM至10nM)。
图3显示了在人单核细胞源性巨噬细胞的分化期期间salusin-α和salusin-β对ACAT-1蛋白质表达的时间依赖性影响。
图4显示了ACAT活性测定的原理。
图5显示了salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞的ACAT活性的影响。
图6显示了salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞的ACAT-1mRNA表达的影响。
图7图示了胆固醇酯化测定的原理。在图7中，CE表示胆固醇酯。
图8显示了salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞的泡沫化(胆固醇酯[CE]的积聚)的影响。
图9显示了A型清道夫受体(SR-A)活性的测量原理。
图10显示了salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞的A型清道夫受体(SR-A)活性的影响。图10A显示结合测定(associationassay)的结果，图10B显示降解测定的结果。
图11显示了salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞中ATP结合盒转运体A1(ABCA-1)蛋白质表达的影响。图11A显示salusin-α的结果，图11B显示salusin-β的结果。
图12显示了salusin-α和salusin-β对分化的培养的人单核细胞源性巨噬细胞的ACAT-1蛋白质表达的影响。图12A显示salusin-α的结果，图12B显示salusin-β的结果。
图13所示的照片显示了人冠状动脉的动脉硬化病变中的salusin-β表达。照片B是A的高倍放大图，照片D是C的高倍图像。图13A-D中的标尺分别表示1.0mm、100μm、200μm和200μm。在死于急性冠状动脉综合征(ACS)的患者(72岁男性)的左前降支(left anteriordescending artery)中，除了粥样斑(atheroma)(斑块)部分的平滑肌细胞(图13B中的1)和成纤维细胞(图13B中的2)以外，还证实了在右冠状动脉的脂纹内的巨噬细胞源性泡沫细胞(图13D中的3)和中膜内的成纤维细胞(图13D中的4)中有很强的salusin-β表达。
图14显示了中年男性受试者的血清salusin-α浓度和颈动脉内膜-中膜厚度的最大值(最大IMT，颈动脉硬化的指标)之间的关系。
图15显示了患有缺血性心脏病(稳定性劳力型心绞痛、急性冠状动脉综合征[ACS]和陈旧性心肌梗塞)的患者、高血压患者和健康受试者的血清salusin-α浓度的比较。选择的病例为没有ACS病史的稳定性劳力型心绞痛病例、在ACS发作后6小时内进行检查的ACS病例和在被选择前6个月或更多月份发生ACS发作的陈旧性心肌梗塞病例。
图16显示了急性冠状动脉综合征(ACS)患者的单支血管病变(1-VD)组、两支血管病变(2-VD)组和三支血管病变(3-VD)组中的血清salusin-α浓度。
图17-1所示的照片显示了salusin-β对apoE缺陷小鼠的主动脉中的动脉硬化病变的影响。A-E显示了用油红O染色的主动脉弓中的动脉粥样硬化性病变。F-J显示了近端主动脉横截面的油红O染色。
图17-2显示了salusin-β对apoE缺陷小鼠的主动脉中的动脉硬化病变的效应。在此显示的均值±SEM是使用每组6只小鼠通过测定用油红O染色的主动脉弓的动脉硬化病变的面积得到的。
图17-3显示了经测定每组11只apoE缺陷小鼠获得的血液数据的均值±SEM。
图18-1显示了salusin-α对apoE缺陷小鼠的主动脉中的动脉硬化病变的影响。A-C显示用油红O染色的胸主动脉的动脉硬化病变。D-F显示近端主动脉横截面的油红O染色。
图18-2显示了salusin-α对apoE缺陷小鼠的主动脉中的动脉硬化病变的效应。在此显示的均数±SEM是使用每组5只小鼠通过测定用油红O染色的胸主动脉中的动脉硬化病变的面积得的。
图18-3显示了经测定每组8只apoE缺陷小鼠获得的血液数据的均数±SEM。
图19A显示了apoE缺陷小鼠中的巨噬细胞泡沫化。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数±SEM。
图19B显示了salusin-α和salusin-β对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞中的胆固醇外流的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数±SEM。
图20A显示了salusin-α和salusin-β对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达CD36的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数±SEM。
图20B显示了salusin-α和salusin-β对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达SR-A的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数±SEM。
图20C显示了salusin-α和salusin-β对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达ACAT1的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数±SEM。
图20D显示了salusin-α和salusin-β对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达ABCA1的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数±SEM。
图20E显示了salusin-α和salusin-β对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达ABCG1的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数±SEM。
图20F显示了salusin-α和salusin-β对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达SR-BI的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数±SEM。
具体实施方式
本发明将详细解释如下。
Salusin-α是包括28个氨基酸残基的肽(SEQ ID NO：1)或包括29个氨基酸残基的肽(SEQ ID NO：2)，其在包括28个氨基酸残基的肽的C-端上具有酰胺化甘氨酸。另外，salusin-β是包括20个氨基酸残基的肽(SEQ ID NO：3)。Salusin-α和salusin-β由包括242个氨基酸的preprosalusin(SEQ ID NO：4)加工而产生。使preprosalusin N-端的包括26个氨基酸的信号序列缺失，产生包括216个氨基酸的prosalusin，然后从prosalusin的C-端侧生成salusin-α和salusin-β。图1显示了salusin-α和salusin-β之间的关系(图1A)及其氨基酸序列之间的关系(图1B)。
Salusin-α抑制巨噬细胞的泡沫化，而salusin-β促进巨噬细胞的泡沫化。巨噬细胞的泡沫化是由于巨噬细胞参入(incorporate)氧化LDL而发生的现象，导致血管内皮细胞中的脂质沉积。巨噬细胞的泡沫化由胆固醇酯的细胞内生成和积聚而造成。氧化LDL经巨噬细胞的多个清道夫受体被参入，然后，由源于氧化LDL的胆固醇产生的胆固醇酯发生积聚，从而发生巨噬细胞泡沫化。在巨噬细胞的泡沫化形成泡沫细胞后，形成了动脉硬化性疾病的原发病灶，例如粥样斑形成。
Salusin-α抑制巨噬细胞的泡沫化，从而抑制动脉硬化性疾病的病变形成。因此，salusin-α可以用于预防或治疗动脉硬化性疾病。此外，salusin-α的激动剂也可以类似于salusin-α的方式用于预防或治疗动脉硬化性疾病。在此，salusin-α的激动剂的例子包括所有促进salusin-α的作用的化合物。这类激动剂的例子包括与salusin-α的受体结合、从而发挥类似于salusin-α的作用的化合物以及具有激动剂活性的抗salusin-α受体抗体。
另一方面，salusin-β促进巨噬细胞的泡沫化，从而以促进的方式作用于动脉硬化病变的形成。因此，与salusin-β结合从而抑制salusin-β的作用的salusin-β拮抗剂，抑制salusin-β导致巨噬细胞泡沫化的作用，从而产生了抑制动脉硬化性疾病的病变形成的能力。因此，salusin-β的拮抗剂可以用于预防或治疗动脉硬化性疾病。本发明的这类salusin-β的拮抗剂的例子包括所有与salusin-β或salusin-β的受体结合从而抑制salusin-β的体内作用的化合物，例如中和抗体和受体拮抗剂。
统称为动脉硬化性疾病的疾病特征在于：由于动脉硬化的危险因素造成内膜中膜厚度(IMT)增加，导致动脉的弹性丧失和硬化；胆固醇酯沉积在动脉内(形成粥样斑)，使血管通道变窄(狭窄)或使阻塞(阻断)；动脉壁部分扩张(动脉瘤)；动脉整体扩张(动脉扩张)；或内皮破裂，造成中膜分离(分离)或破裂(出血)，导致遍及组织和器官的循环不足。在本发明中，动脉硬化性疾病的预防或治疗不仅包括预防或治疗这些动脉硬化性疾病，而且还包括预防或治疗急性冠状动脉综合征(ACS；acute coronary syndrome)、缺血性心脏病心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化、闭塞性动脉硬化症以及由这些动脉硬化性疾病引起的疾病。在此，术语“急性冠状动脉综合征”是指由动脉硬化粥样斑(斑块)破裂后形成血栓、接着冠状动脉血流极度减少或阻塞所引起的病理状况。该病理状况的临床实例包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞和心脏猝死。此外，动脉硬化在相对粗的动脉例如主动脉、脑动脉和冠状动脉中发生。动脉硬化的例子包括动脉粥样硬化，其中动脉中膜中胆固醇酯(熔点：40℃)的动脉粥样化积累导致动脉粥样硬化斑块的形成及其厚度的逐渐增加，从而使动脉腔变窄；由于高血压造成的改变而趋于在脑或肾中的小动脉中发生的动脉毛细血管硬化，其与整个血管壁的破裂所引起的堵塞(梗塞)和出血有关；以及动脉中膜中的钙沉积引起的门克伯格氏动脉硬化(Monckeberg’s arteriosclerosis)，其使动脉硬化并导致中膜变脆。此外，本发明还可以主要应用于预防或治疗动脉壁增厚或斑块形成。
salusin-β拮抗剂的实例包括所有抑制salusin-β的作用的化合物，例如具有拮抗活性的抗salusin-β抗体。
Salusin-α可以根据氨基酸序列信息通过化学合成来制备，或者可以通过基因工程技术制备。此外，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列缺失、取代或添加一个或数个氨基酸、并具有salusin-α的活性的氨基酸序列组成的肽，也可以用作本发明的用于动脉硬化性疾病的预防或治疗剂。在此，术语“1个或数个”是指“1-3”个，优选1个或2个，进一步优选1个。
抗salusin-β抗体可以通过已知方法作为多克隆抗体或单克隆抗体而获得，并优选作为单克隆抗体而获得。单克隆抗体的例子包括由杂交瘤产生的单克隆抗体以及由用含有抗体基因的表达载体通过基因工程技术转化的宿主产生的单克隆抗体。产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过如下所述的已知技术而制备。具体地，产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过如下方法制备：使用salusin-β或其肽片段作为致敏性抗原通过已知的免疫方法进行免疫，通过通常的细胞融合法将由此获得的免疫细胞与已知的母细胞融合，然后通过已知的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞。在用salusin-β免疫后，可以将载体蛋白质例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白与其结合，然后使用。可以用作单克隆抗体的重组单克隆抗体通过如下方法产生：从杂交瘤克隆抗体基因，将该基因结合到适当的载体中，将该载体导入至宿主中，然后由此经基因重组技术使抗体产生(例如，参见Vandamme，A.M.等人，Eur.J.Biochem.1990；192：767-775)。这时，编码抗体重链(H链)的DNA和编码轻链(L链)的DNA可以分别地合并到不同的表达载体中，然后可以同时用这些表达载体对宿主细胞进行转化。另外可选地，将编码H链和L链的DNA结合到单个表达载体中，然后可以用该表达载体对宿主细胞进行转化(参见WO 94/11523)。此外，还可以使用转基因动物来产生重组抗体。例如，将抗体基因插入至编码独特地在奶中产生的蛋白(例如，山羊β酪蛋白)的基因中间，从而制备融合基因。将含有其中插入有抗体基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎中，然后将胚胎导入到雌山羊中。所需抗体可以从由已接受该胚胎的山羊所生的转基因山羊、或该转基因山羊的后代所产的奶中获得(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology 1994；12：699-702)。
本发明的抗salusin-β抗体的例子包括被人为改变以降低对人的异种抗原性(heterologous antigenicity)的基因重组抗体，例如嵌合抗体和人源化抗体。这些抗体的例子包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，其均可以使用已知方法产生。嵌合抗体可以通过如下方法获得：制备编码抗体V区的DNA，将该DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将生成物结合到表达载体中，将该载体导入宿主中，然后使其产生。人源化抗体也称作人重构抗体。人源化抗体通过将非人哺乳动物例如鼠的抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区中而制备。这种人源化抗体可以通过已知的方法制备(参见欧洲专利申请公开第EP 125023号和WO 96/02576)。人抗体的部分用于嵌合抗体或人源化抗体的C区。例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4可以用于H链，Cκ和Cλ可以用于L链。此外，为了改善抗体或其生产稳定性，人抗体的C区可以加以修饰。
人抗体可以通过如下方法获得：例如，导入人抗体基因座位(genelocus)，然后将抗原给予能够产生人源性抗体的转基因动物。转基因动物的例子包括小鼠。例如，产生能够产生人抗体的小鼠的方法参见国际专利公开WO02/43478的公开文本。
本发明的抗salusin-β抗体的例子不仅包括完全抗体，而且还包括其功能片段。术语“抗体的功能片段”是指保留了抗体对抗原的一种或多种作用的抗体部分(部分片段)。其具体例子包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、Fv、二硫键Fv、单链Fv(scFv)及其聚合物[D.J.King.，Applicationsand Engineering of Monoclonal Antibodies，1998T.J.International Ltd]。
由此获得的抗体是否具有对salusin-β的拮抗活性可以通过如下方法确定：例如，将抗体与salusin-β结合，然后验证salusin-β的活性是否受到了抑制。
对salusin-α或salusin-β具有拮抗活性的化合物可以用作用于动脉硬化性疾病的预防或治疗剂。
剂量取决于症状、年龄、性别等而变化。通常来说，在口服给药的情况下，对于成人，剂量范围为每天约0.01mg至1000mg，可以一次给药或数次分别给药。在胃肠外给药的情况下，每次给药约0.01mg至1000mg的剂量可以经皮下注射、肌内注射或静脉内注射来给药。而且，给药时间可以是动脉硬化性疾病的临床症状出现之前或之后。
本发明的预防或治疗剂可以多种形式给药。这些形式的给药途径的例子包括片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的口服给药，以及注射制剂、滴剂、栓剂等的胃肠外给药。
含有本发明的对salusin-α或salusin-β具有拮抗活性的化合物的用于动脉硬化性疾病的预防或治疗剂可以根据标准方法配制(Remington′s Pharmaceutical Science，最近版本，Mark PublishingCompany，Easton，U.S.A.)，并且这些化合物可以一起含有药物可接受的载体和药物可接受的添加剂。这些载体和药物添加剂的例子包括水、药物可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和可接受作为药物添加剂的表面活性剂。实际的添加剂是取决于本发明的预防或治疗剂的剂型而从上述例子中单独选择的，或者从上述例子中选择其合适的组合。但是，其实例并不限于此。
此外，本发明的用于动脉硬化性疾病的预防或治疗剂可以含有具有salusin-β拮抗活性的化合物与salusin-α的组合。
本发明进一步包括下列涉及生物样品中的salusin-α的化验的方法：用于检测从其中采集了生物样品的待测受试者是否患有动脉硬化性疾病的方法、用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法以及用于评价患动脉硬化性疾病的风险的方法。具体地，本发明可以优选地用于检测急性冠状动脉综合征。
生物样品的例子包括全血、血清、血浆和尿。这些生物样品中的Salusin-α可以进行定量或定性化验。
另外可选地，生物样品可以直接用于其中salusin-α的化验。然而，由于生物样品中的salusin-α含量低，优选地，从生物样品中浓缩或分离salusin-α用于化验。这种分离或浓缩可以经固相萃取从血清、血浆、尿等中进行。在此，术语“固相萃取”是指如下技术：使用分离/纯化用的固定相(固相或吸附剂)例如化学结合硅胶、多孔聚合物、氧化铝、活性炭等，以选择性的方式从具有复杂组成的样品中专门地萃取特定的目标成分，从而可以去除样品中的污染物。对于固相萃取，可以广泛地使用反相分配色谱用的固定相、离子交换色谱用的固定相等。对于反相色谱用的固定相，可以使用具有例如十八碳烷基甲硅烷基(C18)、辛基(C8)、丁基(C4)、三甲基(C3)、苯基(Ph)、丁基、三十碳烷基(C30)等的基团的填充剂。其中，优选具有十八碳烷基甲硅烷基(C18)或辛基(C8)的填充剂。使用市售的萃取柱(cartridge)用于固相萃取。可以使用注射器型固相萃取柱或盘型固相萃取柱。市售萃取柱的例子包括Sep-Pak(注册商标，Waters)、Autoprep(注册商标，Showa Denko K.K.)、Discovery DSC-18(SUPELCO)和DiscoveryDSC-8(SUPELCO)。用于洗脱salusin-α的溶剂的例子包括乙腈、甲醇和四氢呋喃。在固相萃取之前，将生物样品用三氟乙酸(TFA)进行酸处理，然后离心。可以使用由此获得的上清液。
另外，可以使用反相色谱柱通过HPLC对预处理过的生物样品进行分离和纯化。
Salusin可以通过免疫测定例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、ELISA或荧光测定来进行测定。在测定时，可以使用用放射性同位素例如¹²⁵I；酶诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶；或荧光物质例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗salusin-α抗体。这些免疫学测定可以通过已知的方法进行。例如，将能够与salusin-α结合的第一配体例如抗salusin-α抗体固定化在塑料制微量滴定板孔等的孔中的固相载体上。然后，使生物样品与结合在固相上的能够与salusin-α结合的第一配体例如抗salusin-α抗体发生反应。因此，作为配体-受体结合反应例如抗体-抗体反应的结果，使样品中的salusin-α经结合在固相上的第一配体而结合在固相上。随后，进行洗涤，然后使能够与salusin-α结合的第二配体与结合在固相上的样品中的salusin-α发生反应。具体地，形成能够与salusin-α结合的第一配体的复合体，例如已经结合在固相上的抗salusin-α抗体/salusin-α/第二配体。可以使用抗salusin-α抗体等作为能够与salusin-α结合的第二配体。随后，进行洗涤，然后测定已经结合在固相上的能够与salusin-α结合的第二配体例如第二抗salusin-α抗体。这种测定可以通过在免疫学分析领域中普遍使用的多种方法进行。例如，将能够与salusin-α结合的第二配体用酶、荧光素、生物素、放射性标记等标记以便产生诸如酶标记产物。可以通过测定这种标记来测定已经结合在固相上的能够与salusin-α结合的第二配体。
在测定salusin-α时，不仅可以测定完整的salusin-α，还可以测定salusin-α片段。
从生物样品中分离和纯化salusin-α用的技术的实例描述如下。
(1)将三氟乙酸(0.1％(v/v))加入至血清或血浆(2mL)中，然后以3000rpm离心10分钟。
(2)将得到的上清液导入至Sep-Pak(注册商标)C18萃取柱中。萃取柱预先用99.8％甲醇(5mL)、纯水(5mL)和0.1％TFA(5mL)处理。
(3)用0.1％TFA(1mL)和50％甲醇进行萃取。得到的洗脱液用离心浓缩机以2000rpm浓缩至大约100μL。
(4)将测定缓冲液(250μL)加入至样品中，以测定其中含有的salusin-α。
可以根据Sato K等人，Peptides，2006；27：2561-2566进行用于测定salusin-α的分离和纯化方法和RIA测定法。
对于健康受试者，人血清和尿中的salusin-α浓度分别为23.3±8.1pM和156.8±95.8pM(各值均为均数±SD)。因此，当待测受试者的血清或尿中的salusin浓度显著低于健康受试者时，可以判断出待测受试者患有动脉硬化性疾病或处于患动脉硬化性疾病的明显危险中。Salusin浓度显著低的情况的例子是如下情况：当与上述健康受试者的均数和SD相比较时，salusin浓度小于均数-1×SD，优选均数-2×SD，进一步优选小于均数-3×SD。另外，动脉硬化性疾病越严重，salusin-α的浓度越低。例如，对于急性冠状动脉综合征(ACS)的情况，随着病变的进展程度以单支冠状动脉病变组、两支冠状动脉病变组和3支冠状动脉病变组的顺序增加，待测受试者的生物样品中的salusin-α浓度减少。另外，生物样品中的salusin-α浓度和用作动脉硬化指标的内膜-中膜复合体厚度体(IMT：内膜中膜厚度)之间呈负相关。IMT越厚，salusin-α的浓度越低。因此，salusin-α可以代替IMT来用作动脉硬化性疾病进展的指标。此外，salusin-α能有效地用于急性动脉硬化性疾病的检测。
此外，通过常规检测从待测受试者采集的生物样品的salusin-α，并监测salusin-α的浓度，可以对动脉硬化性疾病的进展进行管理。
Salusin-α可以用作检测/诊断动脉硬化性疾病的标志物。本发明包括salusin-α作为检测动脉硬化性疾病的检测标志物的用途，并进一步包括用于检测/诊断动脉硬化性疾病的包括salusin-α的疾病检测/诊断标志物。
下文参考下列实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限于此。
在下面的实施例中，从人外周血制备单核细胞并培养7天，使其分化为巨噬细胞。这时，同时向其中加入salusin-α(0-10nM)和salusin-β(0-10nM)，并考察salusin的作用。
从人外周血获得的单核细胞的培养通过已知方法进行。分离的单核细胞添加RPMI-1640(15mL)进行培养，然后用血细胞计数室(bloodcell counting chmber)对漂浮的单核细胞进行细胞计数。细胞接种在6-cm皿中，以得到4×10⁶细胞/2mL。单核细胞在37℃下在5％CO₂的存在下保温1小时，使细胞粘附在皿上。培养基替换为含有10％人血清的RPMI-1640，然后培养7天。培养基每3天更换一次。
实施例1：salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞中的ACAT-1蛋白质表达的影响
ACAT-1是一种将细胞内游离胆固醇转化成胆固醇酯的内质网酶。ACAT-1基因对于巨噬细胞的泡沫化非常重要。为了考察salusin-α和salusin-β对ACAT-1表达的影响，通过蛋白质印迹法(Western blotting)考察ACAT-1蛋白质的表达。
将已培养7天的单核细胞源性巨噬细胞用PBS洗涤3次，然后向每个皿中加入10％SDS(十二烷基硫酸钠)(100μL)进行溶解。用细胞刮棒铲起每种细胞提取溶液，然后使用1-mL TERUMO注射器和破碎(剪切)用23-G注射针进行粉碎。生成物以15,000rpm离心3分钟(Himac CF15D2高速微型低温离心机；Hitach，Ltd.)。上清液中的蛋白质浓度通过二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法(Pierce)测定，并用作蛋白质印迹法用的细胞提取溶液。
将本发明实施例中获得的每种培养上清液中的ACAT-1或ABCA-1根据下面所述的方法通过蛋白质印迹法进行测定。
ACAT-1蛋白质检测
对于ACAT-1蛋白质检测，使用通过对兔进行免疫制备的抗人ACAT-1多克隆抗体(DM10，Dr.Chang，Dartmouth Medical School惠赠)[Chang CCY等人，J Biol Chem.1995；270：29532-29540]作为第一抗体(终浓度：0.5μg/mL)，用于在室温下在转移膜上反应1小时。转移膜用PBS-0.1％Tween 20洗涤，然后与第二抗体(抗兔IgG抗体：结合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG驴抗体(GE HealthcareBio-Science))在室温下反应1小时。对于第二抗体，用PBS-0.1％Tween20(5mL)将原液(0.5μL)稀释10,000倍，使用生成物。用PBS-0.1％Tween 20进行洗涤，然后使用Lumi-Light Plus(PerkinElmer LifeSciences)进行ACAT-1蛋白质检测。
ABCA-1蛋白质检测
对于ABCA-1蛋白检测，与抗人ABCA-1抗体的反应在转移膜上在室温下进行1小时。对于第一抗体(抗人ABCA-1兔多克隆抗体(Funakoshi Corporation))，用PBS-0.1％Tween 20(5mL)将原液(5μL)稀释1,000倍，使用稀释液。转移膜用PBS-0.1％Tween 20洗涤。然后，与第二抗体(抗兔IgG抗体：结合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG驴抗体(GE Healthcare Bio-Science))的反应在室温下进行1小时。对于第二抗体，用PBS-0.1％Tween 20(5mL)将原液(0.5μL)稀释10,000倍，使用稀释液。用PBS-0.1％Tween 20进行洗涤，然后使用Lumi-Light Plus(PerkinElmer Life Sciences)进行ABCA-1蛋白质检测。
将人外周血单核细胞(4×10⁶细胞/6-cm皿)在含有10％人血清的RPMI-1640培养基(2mL)中培养7天，以分化成为巨噬细胞。为了考察salusin对ACAT-1蛋白质表达的剂量依赖性影响，在培养开始时将salusin-α或salusin-β以0、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0nM的浓度添加到培养基中。在培养第7天时，将从单核细胞分化的巨噬细胞用PBS洗涤，然后溶解在10％SDS(100μL)中，然后使用ACAT-1特异性抗体进行蛋白质印迹法。结果，发现salusin-α以依赖浓度的方式抑制大约40％ACAT-1蛋白质的表达(图2A)。同时，salusin-β在0-0.6nM的浓度下以依赖浓度的方式促进ACAT-1蛋白质的表达。Salusin-β的作用在0.6nM时达到峰值水平，这时ACAT-1蛋白质表达水平增加至对照的2.1倍。Salusin-β促进ACAT-1蛋白质表达的作用在0.6nM以上的浓度下逐渐衰减(图2B)。
接下来，考察在单核细胞分化为巨噬细胞的分化期间salusin-α或salusin-β对ACAT-1蛋白质表达的时间依赖性影响。将人外周血单核细胞(4×10⁶细胞/6cm皿)培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入0.6nM salusin-α或salusin-β。在接种后1、3、5或7天时用PBS洗涤每个皿。将其中反应已在第1、3、5天终止的皿暂时冷冻在-80℃下，并在第7天时解冻。将由此获得的细胞以及接种后7天时的细胞溶解在10％SDS(100μL)中。作为通过蛋白质印迹法的考察结果，发现在接种后第1、3或5天用salusin-α处理的细胞中的ACAT-1蛋白质表达没有显著地不同于对照细胞。但是，在第7天时表达受到了显著的抑制。发现用salusin-β处理的细胞中的ACAT-1蛋白质表达水平显著地增加到高于对照细胞在第5天或更晚时的表达水平(图3)。
实施例2：salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞中的ACAT活性的影响
对于ACAT活性测定，使用脂质体重组法。该方法涉及使用如下体系：使用包括胆固醇/磷脂酰胆碱的混合胶束将存在于内质网中的ACAT-1蛋白质重组到脂质体中，从而达到可用作ACAT-1底物的胆固醇的饱和浓度水平[Cheng D等人，J Biol Chem.1995；270：685-695.]。在常规使用的微粒体法中，使用内源性地存在于内质网中的胆固醇作为底物。但是，通常地，内质网膜缺乏胆固醇。因此，认为没有达到能够用作ACAT底物的胆固醇的饱和水平，导致低估ACAT的活性。在此，通过向反应体系中添加另一种底物[¹⁴C]油酰基-CoA并测定通过ACAT反应生成的胆固醇[¹⁴C]油酸酯来测定ACAT的活性(图4)。
该实施例中使用的细胞提取溶液说明如下。
将外周血人单核细胞(4×10⁶细胞/2mL)接种在4-6个6-cm皿中，并培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入salusin-α或salusin-β。然后，考察salusin-α或salusin-β对ACAT活性的效应。培养7天后，将细胞用已经冷却至4℃的PBS洗涤两次，向其中加入低渗缓冲液(1mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.4)(2mL/皿)，将生成物放置5分钟。这些操作的目的在于通过渗透压来粉碎细胞膜，洗涤排出的细胞质蛋白质，并浓缩含有ACAT-1的膜蛋白。将皿颠倒，以充分地去除其中的缓冲液。在使用前立即向其中一皿中加入含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(cocktail)(SIGMA)(1/1000体积)的缓冲液A(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.4)(100μL)。用细胞刮棒从其中回收细胞。将缓冲液(100μL)转移到在相同条件下培养的下一皿中，然后进行相同的操作。最后，将4-6个皿合并在一起，以浓缩膜蛋白。将回收的细胞提取溶液(1mL)导入到Teflon匀浆器中，然后进行3组匀化作用(每组20冲程)。在冰上进行均化，组间的暂停时间为大约1分钟。匀化过的细胞提取溶液的蛋白质浓度通过BCA法(Pierce)进行定量测定。将细胞提取溶液与4M KCl(1/3体积)和20％CHAPS(1/9体积)混合(使得KCl的终浓度为1M且CHAPS终浓度为2％)。蛋白质浓度用含有1M KCl和2％CHAPS的缓冲液A调节。生成物在室温下放置10分钟。
混合胶束如下制备。
将氯仿(172.4μL)中的100mg/mL蛋黄L-α-磷脂酰胆碱(SIGMA)和苯(62μL)中的20mg/mL胆固醇(SIGMA)导入至闪烁管中并进行涡旋，然后用氮气干燥。向其中加入10％牛磺胆酸(SIGMA)(100μL)、10×缓冲液A(100μL)和无菌纯净水(800μL)，生成物进行涡旋。在避光的同时，将瓶中的空气用氮气置换，然后超声10分钟，并在冰上冷却5分钟。上述操作重复约10次，从而获得基本上透明的生成物。超声之后，向其中加入无菌纯净水(1mL)，然后充分混合。
通过制备含有1mM[¹⁴C]油酰基CoA(GE Healthcare Bio-Science，CFA634，1.85MBq)(16μL)、34mM冷的油酰基-CoA(SIGMA)(10μL)、0.25M Tris-HCl(pH 7.8)中30mg/mL的BSA(834μL)和无菌纯净水(996μL)的2,000-μL溶液，得到0.25mM[¹⁴C]油酰基-CoA混合物。
薄层色谱法(TLC)如下进行。
通过将胆固醇油酸酯(SIGMA)(20mg)加入到异丙醇(4mL)中，将混合物在60℃的热浴中加热进行溶解，并进一步向其中加入0.91g/mL甘油三油酸酯(SIGMA)(20μL)，从而制备TLC标准物。通过毛细管点样将TLC标准物(60μL)点在TLC铝板(20×20cm)上的硅胶60F₂₅₄(Merck)上。制备己烷/二乙醚/乙酸(90∶10∶1，v/v)作为展开溶剂。
将混合胶束(140μL)加入到蛋白质量恒定的细胞提取溶液(80-100μg)中，将生成物缓慢混合并在冰上静置10分钟。然后，向其中加入[¹⁴C]油酰基-CoA混合物(20μL)，然后在不导致发泡的情况下进行混合。生成物在37℃下保温30分钟以进行反应。之后，向其中加入氯仿/甲醇(2∶1，v/v)(3mL)和无菌纯净水(1mL)，生成物进行涡旋，使反应终止。以2,500rpm离心10分钟(TOMY LC-120低速离心机，转子7015-06)。然后，从中去除上层(水层)，下层(油层)用氮气干燥。将提取出的脂质用异丙醇(60μL)溶解。生成物在标准物点之间点样。将脂质展开，直至展开溶剂到达玻璃室中TLC板的上边缘。将TLC板转移到另一玻璃室内，该室内已经分散有少量的碘用来使TLC标准物的脂质显色。将对应于胆固醇油酸酯的部分用剪刀切下，置于瓶中，然后添加闪烁鸡尾酒(Perkin Elmer)(3mL)进行测定。对于比活性测定，测定[¹⁴C]油酰基-CoA混合物(10μL)的放射活性。将通过ACAT反应生成的胆固醇[¹⁴C]油酸酯的放射活性(cpm)除以反应系统中使用的细胞蛋白质的量(mg)、[¹⁴C]油酰基-CoA的比活性(cpm/pmol)和反应时间(10分钟)，计算ACAT活性水平(pmol/mg细胞蛋白质/min)。
发现Salusin-α或salusin-β引起了ACAT-1蛋白质表达的改变。因此，考察了salusin-α或salusin-β对ACAT酶活性的效应。将人外周血单核细胞(4×10⁶细胞/皿)在含有10％人血清的RPMI-1640培养基(2mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间向培养基中加入0.6nM salusin-α或salusin-β。
通过向细胞提取溶液中加入混合胶束(胆固醇/磷脂酰胆碱)将ACAT-1蛋白质重组到脂质体中。将[¹⁴C]油酰基-CoA加入到所得的样品中，然后在37℃下反应10分钟。测定通过ACAT反应生成的胆固醇[¹⁴C]油酸酯的放射活性，然后计算ACAT活性。结果，发现在用salusin-α处理的细胞中的ACAT活性已经被抑制到对照的50％。同时，发现在用salusin-β处理的细胞中的ACAT活性已经增加到对照的1.8倍水平(图5)。
实施例3：salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞中的ACAT-1mRNA表达的影响
使用TRIzol试剂(LIFE TECHNOLOGIES)进行RNA提取。
将细胞在培养基中培养7天，然后去除培养基。细胞用PBS洗涤3次。从中充分去除PBS，并向其中加入TRIzol(1mL)用于细胞溶解。将细胞提取溶液吸入吸出5次，然后转移到新的Eppendorf管中。然后，将该管在室温下放置5分钟。向其中加入氯仿(200μL)，然后剧烈振摇15秒。该管进一步放置2-3分钟，并以12,000rpm离心15分钟(Himac CF 15D2高速微型低温离心机；Hitach，Ltd.)。将上层转移至新的Eppendorf管中，并向其中加入异丙醇(500μL)，然后上下颠倒地混合。将该管放置10分钟，并以12,000rpm离心10分钟。从生成物中去除上清液。将75％乙醇(180μL)加入至剩余的沉淀中，然后以15,000rpm离心5分钟。从生成物中去除上清液，然后风干。生成物溶解在无菌纯净水(90μL)中，并在65℃下保温10分钟。向其中加入脱氧核糖核酸酶(DNase)I溶液(10μL)，并将生成物在37℃下保温15分钟。向其中加入3M乙酸钠(10μL)和苯酚/氯仿(1∶1，v/v)(100μL)，然后振摇。以15,000rpm离心3分钟。将上清液收集在新的Eppendorf管中。向其中加入氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)(100μL)，并将该管进一步以15,000rpm离心3分钟。收集上清液，并向其中加入乙醇(200μL)。将生成物在-80℃下放置30分钟或更长时间，然后以15,000rpm离心10分钟。去除上清液。将生成物用70％乙醇洗涤并干燥。将得到的产物溶解在无菌蒸馏水(15μL)中。通过测定260nm处的吸光度，得到由此获得的RNA溶液的浓度。将无菌纯净水加入至溶液中，以达到预定的浓度。
接下来，通过实时RT-PCR法来分析ACAT-1mRNA的RNA表达。
使用以下各个人mRNA序列，通过Primer Express 1.0版(PEBiosystems)确定引物序列。
β-肌动蛋白
正向引物：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT(SEQ ID NO：5)
反向引物：5’-GGGCCGGACTCGTCATAC(SEQ ID NO：6)
ACAT-1
正向引物：5’-TTCGGAATATCATCAAACAGGAGCC(SEQ ID NO：7)
反向引物：5’-CACACCTGGCAAGATGGAGTT(SEQ ID NO：8)
将用salusin-α或salusin-β处理的外周血人单核细胞(4×10⁶细胞/6cm皿)在含10％人血清的RPMI-1640培养基(2mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。从用salusin-α或salusin-β处理的细胞和未经处理的细胞中提取总RNA。对每种总RNA(1μg)进行逆转录反应以进行cDNA合成。
进行实时PCR，以便对使用qPCR MasterMix SYBR GreenI(Eurogentec)通过GeneAmp 5700序列检测系统(Applied BiosystemsJapan)获得的cDNA进行定量。
接下来，通过下述方法进行逆转录反应。
将随机引物(TaKaRa，80nM)(0.5μL)和无菌纯净水(10.5μL)加入到各总RNA溶液(1μg/μL)(1μL)中，然后在70℃下加热10分钟。向其中加入核糖核酸酶(RNase)抑制剂(0.75μL)、5×First StrandBuffer(Invitrogen)(4μL)、0.1M二硫苏糖醇(2μL)、2.5mM dNTP(TaKaRa)(4μL)和SuperScript II(200U/μL；Invitrogen)(1μL)，然后在37℃下反应1小时。在95℃下变性5分钟后，将生成物在冰上冷却，并向其中加入无菌纯净水(40μL)。
通过下述方法进行实时RT-PCR。
将qPCR MasterMix SYBR GreenI(12.5μL)、引物溶液(正向+反向：每种5μM)(2.5μL)和无菌纯净水(8μL)加入到通过逆转录反应获得的cDNA溶液(2μL)中，然后进行反应。
PCR循环包括一个循环的95℃/10分钟，以及40个循环的94℃/20秒、55℃/20秒和72℃/30秒。
发现Salusin-α和salusin-β引起ACAT-1蛋白质表达和ACAT活性的改变。因此，进一步考察salusin-α和salusin-β对ACAT-1mRNA表达的影响。将人外周血单核细胞(4×10⁶细胞/皿)在含10％人血清的RPMI-1640培养基(2mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入0.6nM salusin-α或salusin-β，以考察salusin-α或salusin-β对ACAT-1mRNA表达的影响。在培养第7天时，从细胞中提取总RNA。通过实时RT-PCR考察salusin-α和salusin-β对ACAT-1mRNA的影响。因此，发现salusin-α将ACAT-1mRNA的表达水平抑制至对照的80％的水平，发现salusin-β将ACAT-1mRNA的表达水平增加至对照的1.6倍(图6)。
实施例4：salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞泡沫化(胆固醇酯的积聚)的影响
采用胆固醇酯化测定作为巨噬细胞泡沫化的测定方法[GoldsteinJL等人，Methods Enzymol.1983；98：241-260]。巨噬细胞使乙酰化LDL(AcLDL)经清道夫受体而结合到细胞中，从而引起溶酶体降解。将在溶酶体中产生的游离胆固醇转移至ACAT，并因ACAT反应而转化成胆固醇酯。如果向培养基中加入[³H]油酸酯，则[³H]油酸酯被结合到细胞中，并被酰基CoA合成酶转变为[³H]油酰基-CoA。ACAT使用AcLDL来源的游离胆固醇和如上所述获得的[³H]油酰基-CoA作为底物，产生胆固醇[³H]油酸酯。细胞中积聚的胆固醇[³H]油酸酯的放射活性可以用作胆固醇酯积聚的敏感指标(图7)。
人血浆LDL通过下述方法纯化。
通过顺序浮选超速离心从人血浆纯化LDL(d＝1.019-1.063)[Schumaker VN等人，Methds Enzymol.1986；128：155-170]。将人血浆(350mL)分配到6个离心管中，使用RP-42转子在4℃下以100,000x g(36,000rpm)超速离心20小时。从生成物中去除含有乳糜颗粒和极低密度脂蛋白(VLDL)的混浊上层，使用抽吸器回收下层(黄色层)。获得的已经去除乳糜颗粒和VLDL的血浆成分的体积用量瓶测量。其比重用浮动比重计(floating hydrometer)测定。向其中加入固体KBr，直至达到“d＝1.063”的条件。假设“V”代表获得的已经去除乳糜颗粒和VLDL的血浆成分的体积，“D”代表其比重，则可以通过下式来大致计算达到1.063g/mL的比重所必须加入的KBr的量。
KBr(g)＝V(1.063-D)/0.68323
将已被调节达到“d＝1.063”的含LDL的血浆成分的一半体积分配到6个离心管中。将密度溶液(d＝1.063)导入其中至每个离心管的边缘的水平。使用RP-42转子在4℃下以100,000x g(36,000rpm)超速离心20小时。然后，用巴斯德吸管回收上层(黄色层)(粗LDL)。上述成分的剩余一半体积用相同的方式分配，然后进行超速离心。然后，回收上层(黄色层)(粗制LDL)。将上述两项操作获得的各个部分粗LDL混合在一起。将生成物分配到6个离心管中。将密度溶液(d＝1.063)导入其中至每个离心管边缘的水平。使用RP-42转子在4℃下以100,000x g(36,000rpm)超速离心20小时。然后，回收上层(黄色层)(纯化LDL)。将LDL加入至透析膜，然后使用EDTA-盐水(4L)在室内在低温下透析。重复3次12小时的透析。将生成物用ULTRAFILTRATION CELL MODEL 8200(AMICON)浓缩，使得蛋白质浓度为约2mg/mL，然后使用滤器无菌过滤。通过BCA法(Pierce)测定蛋白质浓度。LDL用于制备下述的AcLDL。
AcLDL以下述方式制备。
将等体积的LDL(蛋白质：30mg)(如果为2.0mg蛋白质/mL则15mL)和饱和乙酸钠混合在一起。将混合物在冰上冷却，并用搅拌棒搅拌，期间逐滴加入乙酸酐(150μL)(5μL/LDL mg蛋白质)(每滴5μL)[Miyazaki A等人，J Biol Chem.1994；269：5264-5269.]。这时，向其中逐滴加入5N NaOH，用pH计监测pH，使得pH可以维持在6.5以上。将生成物在冰上放置1小时，然后使用EDTA-盐水(4L)在室内在低温下透析。重复3次12小时的透析。将生成物用ULTRAFILTRATION CELL MODEL 8200(AMICON)浓缩。通过BCA法(Pierce)测定蛋白质浓度。由此获得实验用的AcLDL。
用于下述操作的试剂如下。
[9，10(n)-³H]油酸(185MBq，在1mL甲苯中，GE Healthcare Bio-Science)(油酸摩尔浓度：0.625mM)
3mM油酸-牛血清白蛋白(SIGMA)：白蛋白浓度为100mg/mL(1.5mM)，1mol试剂结合2-mol油酸。
制备3mM[³H]油酸混合物
将[9，10(n)-³H]油酸(50μL)(9.25MBq)导入至玻璃烧杯中，并用氮气干燥。将3mM油酸-牛血清白蛋白(SIGMA)(5mL)倒入玻璃烧杯，然后用搅拌棒搅拌5小时，然后用2-μm滤器无菌过滤。
将人外周血单核细胞(4×10⁶细胞/6cm皿)在含10％人血清的RPMI-1640培养基(2mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入0.6nM salusin-α或salusin-β。考察salusin-α和salusin-β对细胞内胆固醇酯积聚(胆固醇酯化)的影响。在第7天，更换培养基。向细胞中加入5μg/mL AcLDL、3mM[³H]油酸混合物(67μL)(终浓度：0.1mM)和0.6nM salusin-α或salusin-β。进一步向其中加入适当量的培养基，以得到2mL的总量，然后再培养18小时。细胞用PBS洗涤3次。向每个皿中加入己烷/异丙醇(3∶2，v/v)(1mL)。每个皿在室温下放置1小时。将己烷/异丙醇回收到脂质提取管中。此外，向每个皿中加入1mL己烷/异丙醇，以洗涤细胞和皿壁，然后回收到同一脂质提取管中。脂质提取后，向每个皿中加入1N NaOH(1mL)，以进行蛋白质提取。将脂质提取管涡旋，并在室温下放置30分钟，然后用氮气干燥。将提取的细胞脂质进行涡旋，并加入60μL异丙醇溶解。将其总量广泛地在标准物点之间点样。通过TLC进行展开，使得展开溶剂(己烷/二乙醚/乙酸(90∶10∶1，v/v))到达TLC板的上边缘。将TLC板置于玻璃室中，用碘使脂质显色。将对应于胆固醇油酸酯的部分用剪刀切下，并将该部分置于闪烁瓶中，然后加入闪烁鸡尾酒(PerkinElmer)(3mL)进行测定。回收之前加入至每个皿中的1N NaOH，并通过BCA法(Pierce)对细胞蛋白质进行定量测定。测定3mM[³H]油酸混合物的比活性(dpm/nmol)。将细胞中产生的胆固醇[³H]油酸酯的放射活性(dpm)除以[³H]油酸的比活性(dpm/nmol)和细胞蛋白质的量(mg)，从而计算胆固醇的酯化(nmol/mg细胞蛋白质)。
ACAT-1是促进巨噬细胞泡沫化的重要因子。上述实验揭示了salusin-α和salusin-β以相反的方式影响着ACAT-1的表达和ACAT的活性。因此，考察salusin-α和salusin-β对巨噬细胞泡沫化的影响。
将人外周血单核细胞(4×10⁶细胞/6cm皿)培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，考察在培养期间同时加入的0.6nM salusin-α和salusin-β对巨噬细胞泡沫化的影响。在培养第7天，向细胞中加入5μg/mLAcLDL、0.1mM[³H]油酸混合物和0.6nM salusin-α或salusin-β。细胞进一步培养24小时，然后测定细胞中积聚的胆固醇[³H]油酸酯。当对照细胞载有AcLDL时，观察到积聚的胆固醇[³H]油酸酯为5.6nmol/mg细胞蛋白质。该结果是载有AcLDL的细胞(未负载对照细胞)所获得结果的6.3倍。在用salusin-α处理的细胞中由AcLDL引起的胆固醇[³H]油酸酯的积聚程度降低至与对照细胞(负载对照)的50％对应的水平。在用salusin-β处理的细胞中积聚程度增加至对照细胞的1.6倍的水平(图8)。
实施例5：考察乙酰化LDL(AcLDL)的细胞参入量-测定A型清道夫受体(SR-A)的活性
清道夫受体是在巨噬细胞上表达的脂蛋白受体。其识别修饰的LDL例如氧化LDL或AcLDL，引起胞吞作用。已经参入至细胞内的该受体的配体在溶酶体中降解。这种清道夫受体在巨噬细胞形成泡沫细胞中发挥着非常重要的作用。清道夫受体的已知例子包括A型清道夫受体(SR-A)、CD36、凝集素样氧化LDL受体-1(LOX-1)和CD68[Greaves DR等人，J Lipid Res.2005；46：11-20.]。氧化LDL可以与四种类型的上述清道夫受体结合。然而，与AcLDL结合的清道夫受体只有SR-A。在该实验中，使用修饰LDL的代表性实例AcLDL作为配体，测定作为能够识别AcLDL的专用清道夫受体的SR-A的活性(图9)。
将外周血人单核细胞(4×10⁶细胞/6cm皿)在含10％人血清的RPMI-1640培养基(2mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入0.6nM salusin-α或salusin-β，以考察salusin-α和salusin-β对[¹²⁵I]AcLDL的胞吞活性(SR-A活性)的影响。在第7天，更换培养基。将适当量培养基加入[¹²⁵I]AcLDL(5-10μg/mL)和0.6nMsalusin-α或salusin-β中，以得到2mL的总量。细胞进一步培养18小时。
将细胞用含有3％BSA的PBS洗涤一次，然后用PBS洗涤两次。向其中加入0.1N NaOH(1mL)，生成物在室温下放置30分钟。将细胞回收到聚苯乙烯管(12×75mm，Fisher Scientific Company)中，进一步用0.1N NaOH(1mL)洗涤，并再次回收。细胞提取溶液的总量使用γ计数仪测定。其一部分的蛋白质浓度通过BCA法(Pierce)测定。通过将细胞提取溶液的放射活性(cpm)除以[¹²⁵I]AcLDL的比活性(cpm/μg)和每皿的细胞蛋白质量(mg)，计算[¹²⁵I]AcLDL的细胞结合(μg/mg细胞蛋白质)[Miyazaki A等人，J Biol Chem.1994；269：5264-5269]。
降解测定通过下述方法进行。
经清道夫受体被巨噬细胞参入的[¹²⁵I]AcLDL在溶酶体中被降解。[¹²⁵I]AcLDL的蛋白质部分——[¹²⁵I]apo B-100被蛋白质降解酶破碎以形成肽，从而被分泌至细胞外，然后其可以在三氯乙酸可溶部分中发现。同时，在培养基中没有被巨噬细胞参入的[¹²⁵I]AcLDL不溶于三氯乙酸，因此可以通过离心以沉淀物的形式得以分离。
从每种培养上清液中收集一部分(750μL)到聚苯乙烯管(12×75mm，Fisher Scientific Company)中。向其中加入40％三氯乙酸(250μL)和0.7M AgNO₃(200μL)，并将混合物涡旋，然后以2,500rpm离心10分钟(TOMY，LC-120低速离心机，转子7015-06)。通过凝胶过滤去除大部分在以碘标记AcLDL的步骤中未与蛋白质反应的游离¹²⁵I。但是，发现其一部分仍然有剩余。在该步骤中，剩余部分的¹²⁵I可以通过加入AgNO₃而以Ag[¹²⁵I]的形式沉淀出来。因此，培养上清液中不溶于三氯乙酸的部分含有未被细胞参入的[¹²⁵I]AcLDL和来源于游离¹²⁵I的Ag[¹²⁵I]。另外，已被细胞加工的来自[¹²⁵I]AcLDL的肽专一地在可溶于三氯乙酸的部分中检测出。离心之后，将上清液(600μL)收集到不同的管中，并用γ计数仪测定。基于测定结果，对每个皿计算培养上清液中可溶于三氯乙酸的部分的总放射活性(cpm)。通过将总放射活性除以[¹²⁵I]AcLDL的比活性(cpm/μg AcLDL蛋白质)和每皿的细胞蛋白质量(mg)，得到[¹²⁵I]AcLD L的降解率(μg/mg细胞蛋白质)。
作为上述实验的结果，其揭示了salusin-α和salusin-β控制着巨噬细胞的泡沫化。因此，考察受salusin控制的SR-A活性是否会影响上述现象。细胞内参入的AcLDL的蛋白质部分(apo B-100)被溶酶体中的蛋白质降解酶降解成肽，从而被分泌至细胞外。在结合测定中，测定存在于细胞表面或细胞内部的¹²⁵I的放射活性。在降解测定中，测定已在溶酶体中被破碎成肽、并被分泌至细胞外的[¹²⁵I]AcLDL(apo B-100肽片段)的放射活性。基于两种测定，确定SR-A的活性。
将人外周血单核细胞(4×10⁶细胞/6cm皿)培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入0.6nM salusin-α或salusin-β。然后，考察salusin-α和salusin-β对[¹²⁵I]AcLD的参入和降解的影响。在此，在培养第7天时，向细胞中加入5-10μg/mL[¹²⁵I]AcLDL和0.6nMsalusin-α或salusin-β，并将细胞进一步培养18小时。然后，进行结合测定和降解测定。结果，在任一测定中，与对照细胞相比，都观察不到由salusin-α和salusin-β引起的显著变化。(图10A和10B，图10A显示结合测定结果，图10B显示降解测定结果。)因此，已经揭示出，salusin-α和salusin-β影响AcLDL参入细胞后的胆固醇代谢，但不影响SR-A的活性。
实施例6：salusin-α和salusin-β对人单核细胞源性巨噬细胞中的ATP结合盒转运体A1(ABCA-1)蛋白质表达的影响
控制巨噬细胞泡沫化现象的一种机制是经ABCA-1向细胞外分泌游离胆固醇的机制(胆固醇外流)。考察salusin对ABCA-1蛋白质表达的影响。将外周血人单核细胞(4×10⁶细胞/6cm皿)培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入salusin-α或salusin-β(0、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0nM)。然后，考察salusin-α和salusin-β对ABCA-1蛋白质表达的影响。在前述使用ABCA-1特异性抗体进行蛋白质印迹法的情况下，发现salusin-α和salusin-β均没有引起ABCA-1蛋白质表达的显著变化。(图11A和11B：图11A显示salusin-α的结果，图11B显示salusin-β的结果。)
实施例7：salusin-α和salusin-β对分化后的培养的人单核细胞源性巨噬细胞中的ACAT-1蛋白质表达的影响
在实施例1-6中每一个实验中，在培养的人单核细胞分化为巨噬细胞的分化期加入salusin-α和salusin-β，使用培养第7天获得的细胞来考察salusin-α和salusin-β的影响。在该实施例中，考察salusin-α和salusin-β是否对分化后获得的巨噬细胞中的ACAT-1蛋白质表达具有类似的影响。将外周血人单核细胞(4×10⁶细胞/6cm皿)培养7天，以分化成巨噬细胞。在第7天时，向其中加入salusin-α和salusin-β(0、0.4、0.6或1.0nM)，巨噬细胞进一步培养3天。作为通过蛋白质印迹法对ACAT-1进行考察的结果，1.0nM salusin-α将ACAT-1蛋白质的表达水平降低至与对照的60％对应的水平。同时，0.6nMb salusin-β将上述表达水平增加至对照的2.2倍水平(图12A和12B，图12A显示salusin-α的结果，图12B显示salusin-β的结果。)。基于这些结果已经揭示出，即使在单核细胞分化成巨噬细胞之后，salusin-α或salusin-β对ACAT-1表达的控制仍然得以保持。
以下是在上述实施例中通过考察新的血管活性物质(即salusin-α和salusin-β)对培养的人单核细胞源性巨噬细胞的泡沫化(细胞内胆固醇酯积聚)以及与该泡沫化有关的基因表达的影响获得的主要结果。
(1)salusin-α抑制由AcLDL引起的巨噬细胞泡沫化，salusin-β则促进由AcLDL引起的巨噬细胞泡沫化。
(2)salusin-α抑制细胞内胆固醇酯化酶ACAT-1的表达，salusin-β则促进该酶的表达。
(3)SR-A能够识别并细胞内参入AcLDL的活性不受salusin-α或salusin-β的影响。
(4)在细胞内胆固醇转运中发挥重要作用的ABCA-1的表达不受salusin-α或salusin-β的影响。
基于上述结果已经揭示，培养的人单核细胞源性巨噬细胞的泡沫化以相反的方式受salusin-α和salusin-β的控制，而且控制该泡沫化的机制涉及到salusin-α和salusin-β以相反的方式控制ACAT-1的表达。
另外，已有报道称salusin-β对促进血管平滑肌细胞或成纤维细胞增殖的正面效果不受用salusin-α预处理的抑制，因此，可以获得salusin-α和salusin-β的累加效应[Shichiri M等人，Nat Med.2003；9：1166-1172]。该报道提出，salusin-α和salusin-β可能经由不同的受体作用于这些细胞。另外，Wang等人已报道称，在其中已经表达有小鼠mas样G蛋白偶联受体A1(mMrgA1)的HEK293T细胞中，salusin-β被认为是配体[Wang Z等人，Eur J Pharmacol.2006；539：145-150]。同时，salusin-α不作为mMrgA1的受体，表明salusin-α和salusin-β由不同的受体识别[Wang Z等人，Eur J Pharmacol.2006；539：145-150]。在该研究中，获得的结果表明salusin-α和salusin-β以相反的方式作用于巨噬细胞的泡沫化和ACAT-1表达。因此，可以假设salusin-α和salusin-β经由巨噬细胞中表达的不同受体发挥作用。
实施例8：salusin-α和salusin-β在人冠状动脉的动脉硬化病变中的表达
从死于急性冠状动脉综合征(ACS)的患者(72岁男性)制备冠状动脉病理切片，并用已纯化的免疫化学组织染色用抗salusin-α和-β抗体极性染色。不仅在冠状动脉的斑块部分中的平滑肌细胞和成纤维细胞中，而且在脂纹中的巨噬细胞源性泡沫细胞中，都观察到强的salusin-β表达(图13A-13D)。Salusin-α和salusin-β被认为由共用前体(Preprosalusin)的共同部分产生。但是，在其中有强salusin-β表达的冠状动脉的动脉硬化病变中基本上观察不到salusin-α的表达。在其他3名患者(一名40岁男性、一名76岁女性和一名86岁女性)中也证实了类似的发现。作为上述考察的结果，已经阐明，强的salusin-β表达和降低的salusin-α表达均深入地参与了人冠状动脉硬化的进展。
实施例9：使用salusin-α作为标志物检测动脉硬化
考察64名中老年男性(40-86岁)的血清salusin-α浓度和动脉硬化之间的关系。对于动脉硬化评价，使用可以简单、非侵入的方式进行的颈动脉超声波心动描记法(模式B)。测定每一侧颈动脉内膜-中膜厚度(IMT)的最大水平(最大IMT)。在健康人中最大IMT为1mm或更小。已经证明，最大IMT大于1mm是急性冠状动脉综合征(ACS)、中风等的危险因素。通过Sato K等人，Peptides.2006；27：2561-2566中所述的放射免疫测定法来测定血清salusin-α的浓度。血清salusin-α浓度与颈动脉最大IMT之间呈显著的负相关(r＝0.29，P＜0.02；图14)。这表明，血清salusin-α的浓度越低，动脉硬化的进程越靠后期。
实施例10：使用salusin-α作为标志物检测急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病和动脉硬化
从以下病例中收集血清标本：由37名稳定性劳力型心绞痛患者(26名男性病例和11名女性病例)、60名急性冠状动脉综合征患者(发作后6小时内)(41名男性病例和19名女性病例)以及76名陈旧性心肌梗塞患者(自急性冠状动脉综合征发作后已经过了6个月或更长时间)(61名男性病例和15名女性病例)组成的缺血性心脏病病例(共计173名病例)；以及由40名原发性高血压患者(28名男性病例和12名女性病例)和55名健康志愿者(35名男性病例和20名女性病例)组成的对照病例。根据Sato K等人，Peptides.2006；27：2561-2566的描述通过放射免疫测定法来测定Salusin-α浓度。所有急性冠状动脉综合征病例均接受急诊冠状动脉成像。基于发现具有动脉硬化病变的冠状动脉分支(右冠状动脉+左前降支+左回旋支＝总计3个分支)的数目来评价冠状动脉病变的严重性。另外，所有高血压病例和23名健康志愿者均接受颈动脉超声波心动描记法。具有清晰边界的IMT为1.1mm或更大的病变被指定为斑块病变。斑块分数(plaque score)确定为所有斑块病变(右侧和左侧)的厚度的总和。斑块分数1.1-5指定成对应于轻度动脉硬化。斑块分数5-10指定成对应于中度动脉硬化，斑块分数10以上指定成对应于重度动脉硬化。
对于缺血性心脏病患者，血清salusin-α浓度为4.9±0.6pM。该数值显著低于健康志愿者(21.7±1.5pM)(均值±SEM，下同)和高血压患者(15.4±1.1pM)(p＜0.0001)。在缺血性心脏病患者中，劳力型心绞痛患者的血清salusin-α浓度是稳定的(6.4±0.9pM)，急性冠状动脉综合征患者为3.6±0.6pM，陈旧性心肌梗塞患者为5.2±1.2pM(图15)。作为60名急性冠状动脉综合征患者的急诊冠状动脉成像的结果，其中23例发现有单支血管病变，17例发现有两支血管病变，20例发现有3支血管病变。单支血管病变患者的salusin-α浓度为5.2±1.0pM，两支血管病变患者的salusin-α浓度为3.1±1.4pM，3支血管病变患者的salusin-α浓度为2.3±0.9pM。3支血管病变患者的结果要显著低于单支血管病变的患者(p＜0.05，图16)。
对于40名高血压患者和23名健康志愿者，颈动脉最大IMT和salusin-α浓度之间呈负相关。另外，斑块分数随着严重性增加而逐渐减小。因此，认为salusin-α浓度下降参与了动脉硬化的进展。
就上述而言，假设salusin-α浓度下降反映了动脉硬化、特别是缺血性心脏病的存在。对于急性冠状动脉综合征，所得到salusin-α的浓度比任何其他缺血性心脏病病例中得到的浓度更低。另外，发现salusin-α的浓度随着冠状动脉病变的严重性增加而进一步下降。这表明具有抗动脉硬化作用的salusin-α可以非常有效地用作指示急性冠状动脉综合征的发作或严重性的标志物。
实施例11：salusin-α和salusin-β的连续给药对动脉硬化的影响
使用apoE缺陷小鼠作为动脉硬化动物模型，考察salusin-α和salusin-β的连续给药对动脉硬化的影响。在此，还考察了salusin-α或salusin-β的抗血清作用。除了考察动脉硬化病变以外，研究还集中于对于动脉硬化原发病灶的形成非常重要的巨噬细胞泡沫化，并且还测定了氧化LDL引起的胆固醇酯积聚。对于能够识别氧化LDL的清道夫受体(CD36和SR-A)、细胞内胆固醇酯化酶(酰基-CoA)(胆固醇酰基转移酶1(ACAT1))以及参与过量细胞内游离胆固醇的细胞外转运(胆固醇外流)的机制的ATP结合盒转运体A1(ABCA1)、ABCG1和SR-BI，进行了表达分析。
上述动物实验根据Showa University(日本)制定的实验实践指南进行。该研究用的所有apoE缺陷小鼠均购自Jackson Laboratory(BarHarbor，ME，U.S.A.)。
将13周龄雄性apoE缺陷小鼠(72只小鼠)分成以下6组：(i)生理盐水(对照)；(ii)salusin-α(0.6nmol/kg/h)；(iii)salusin-β(0.6nmol/kg/h)；(iv)salusin-α(0.6nmol/kg/h)+抗salusin-α血清(1.4μg/kg/h)；(v)salusin-β(0.6nmol/kg/h)+抗salusin-β血清(1.4μg/kg/h)；和(vi)抗salusin-β血清(1.4μg/kg/h)。使用微量渗透泵对小鼠连续皮下给药4-8周。微量渗透泵和其中所含的溶液每周更换。
对摄取正常饮食的小鼠进行实验。测定以下参数。
1.主动脉的动脉硬化病变的分析
将每条采集的主动脉沿纵向切开，然后进行油红O染色，用于考察每个具有脂质色素沉着的动脉粥样硬化病变的表面积。使用AdobePhotoshop(Adobe System Inc.，San Jose，CA，U.S.A.)鉴别动脉硬化病变，然后使用NIH Scion Image(Scion Corp.，Frederick，MD，U.S.A.)进行各处病变的表面积的定量分析。另外，制备主动脉附近(紧接着主动脉瓣下方)的切片，然后进行油红O染色，用于对动脉硬化病变进行详细分析。
2.巨噬细胞的分析
(1)考察细胞内胆固醇酯积聚
在腹膜内给予巯基乙酸盐后的第4天，收集渗出的巨噬细胞，并用含10％胎牛血清的RPMI1640溶液培养。向培养溶液中加入氧化LDL(10μg/mL)和[³H]油酸(0.1mM)。13小时后，测定细胞内积聚的胆固醇[³H]油酸的放射活性，以对巨噬细胞的泡沫化进行评价。
(2)考察胆固醇外流
将以上述方式收集的巨噬细胞在如上制备的含有用[³H]胆固醇(74kBq/mL)标记的氧化LDL(10μg/ml)的培养溶液中保温24小时，并用PBS洗涤两次。之后，将巨噬细胞在其中已添加有HDL(15μg/mL)的含0.1％BSA的RPMI1640溶液中保温16小时。培养溶液以15,000rpm离心10分钟，以从中去除残渣。细胞用PBS洗涤两次，然后溶解在1N NaOH(0.3mL)中。测定培养溶液和细胞提取溶液中的[³H]胆固醇放射活性：胆固醇外流率(％)＝培养溶液中的[³H]胆固醇放射活性/培养溶液中的[³H]胆固醇放射活性+细胞提取溶液中的[³H]胆固醇放射活性×100
(3)考察与泡沫化有关的基因的表达
如(1)中的实验那样收集巨噬细胞，通过蛋白质印迹法分析参与巨噬细胞泡沫化的基因(即清道夫受体CD36和能够识别氧化LDL的SR-A、细胞内胆固醇酯化酶ACAT1以及参与胆固醇外流的ABCA1、ABCG1和SR-BI)的蛋白质表达。对于巨噬细胞功能的内标，还考察了β-肌动蛋白的表达。为了对条带浓度进行定量，使用Analyzer(ATTOCorporation，Tokyo)。
作为上述考察的结果，获得了以下结果。
1.主动脉的动脉硬化病变
给药后4周，与用生理盐水处理的对照小鼠(图17-1A)相比，在用salusin-β处理的apoE缺陷小鼠中在从主动脉根至头臂动脉分岔的广泛区域中观察到用油红O染成红色的主动脉弓的动脉硬化病变(图17-1C，箭头)。关于对各组(由6只小鼠组成)测定的动脉硬化病变表面积的平均值，发现salusin-β处理组的平均值已经增加至对照组的约2.5倍(P＜0.005，图17-2)。在近端主动脉切片中，与对照组(图17-1F)相比，在salusin-β处理组中观察到用油红O染成红色的粥样斑的形成和血管壁的增厚(图17-1H，箭头)。在除salusin-β之外还用抗salusin-β血清处理的小鼠中，与单用salusin-β处理的小鼠相比，主动脉的动脉硬化病变(图17-1D)、粥样斑和血管壁的增厚(图17-1I)得到改善。在单用抗salusin-β血清处理的小鼠中，观察到与对照小鼠类似的动脉硬化病变(图17-1E和J)。
给药后8周，在用生理盐水处理的对照小鼠中，主动脉弓中的动脉硬化病变的大小显著增加(图18-1A，箭头)。但是，作为给予salusin-α的结果，动脉硬化表面积减小至给予salusin-α前的一半以下(图18-1B和18-2)。另外，作为给予salusin-α的结果，观察不到明显的斑块形成(图18-1B和E)。在抗salusin-α血清的存在下，salusin-α对动脉硬化病变的抑制效应消失(图18-1C和F和18-2)。
2.巨噬细胞的分析
给药后4周，在给予salusin-α的情况下，由氧化LDL(细胞内胆固醇酯积聚)引起的腹膜内收集的渗出巨噬细胞的泡沫化减少到对照的大约1/4的水平(P＜0.05，图19A)。在给予salusin-β的情况下，巨噬细胞的泡沫化增加至对照的约2倍的水平(P＜0.01，图19A)。但是，在抗salusin-β血清的存在下，其被抑制到对照的水平(P＜0.01，图19A)。在salusin-α的存在下HDL引起的胆固醇外流增加到对照的约2倍的水平(P＜0.01，图19B)。
图20显示了在同一时期参与巨噬细胞泡沫化的基因的蛋白质表达水平。Salusin-α不影响能够识别氧化LDL的清道夫受体(CD36，SR-A)的表达(图20A和B)。但是，salusin-α将ACAT1的表达减少到初始水平的大约一半的水平(P＜0.05，图20C)，并将参与胆固醇外流的ABCA1、ABCG1和SR-BI的表达增加到初始水平的1.5-2倍的水平(P＜0.05，图20D、E和F)。同时，salusin-β将CD36、SR-A和ACAT1的表达增加到对照水平的大约1.5-2.8倍的水平(P＜0.05，图20A、B和C)。上述salusin-β的作用完全被抗salusin β血清所取消(图20A、B和C)。
工业应用性
如实施例中所述，salusin-α抑制巨噬细胞的泡沫化，从而抑制动脉硬化病变的形成。因此，salusin-α可以用作动脉硬化性疾病的预防性治疗剂。同时，salusin-β促进巨噬细胞的泡沫化，从而促进动脉硬化病变的形成。因此，动脉硬化性疾病可以通过抑制salusin-β的作用来预防和治疗。抗salusin-β抗体抑制salusin-β的作用，因此其可以用作动脉硬化性疾病的预防性治疗剂。此外，生物样品例如血清、尿等中的salusin-α浓度与动脉硬化病变的形成有关。因此，生物样品中的salusin-α可以用作用于动脉硬化性疾病的检测或风险评价的标志物。
抑制salusin-α或salusin-β的作用的拮抗性化合物可以用于预防/治疗动脉硬化性疾病。另外，salusin-α可以用作检测动脉硬化性疾病用的标志物。如上所述，本发明可以应用于医药领域。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此全部全文并入作为引证。
序列表
<110>株式会社蛋白质表达
<110>学校法人昭和大学
<110>国立大学法人东京医科齿科大学
<120>用于动脉硬化性疾病的靶向Salusin的治疗剂和检测试剂
<130>PH-3550-PCT
<160>8
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>28
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Ser Gly Ala Leu Pro Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Pro Ala Leu Arg
1               5                   10                  15
Ala Gln Arg Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gly Ala Lys
            20                  25
<210>2
<211>29
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Ser Gly Ala Leu Pro Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Pro Ala Leu Arg
1               5                   10                  15
Ala Gln Arg Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gly Ala Lys Gly
            20                  25
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Ala Ile Phe Ile Phe Ile Arg Trp Leu Leu Lys Leu Gly His His Gly
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Arg Ala Pro Pro
            20
<210>4
<211>242
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Met Ala Ala Ala Thr Arg Gly Cys Arg Pro Trp Gly Ser Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Leu Gly Leu Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Trp Asp Leu Ala Ser
            20                  25                  30
Leu Arg Cys Thr Leu Gly Ala Phe Cys Glu Cys Asp Phe Arg Pro Asp
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Leu Glu Cys Asp Leu Ala Gln His Leu Ala Gly Gln His
    50                  55                  60
Leu Ala Lys Ala Leu Val Val Lys Ala Leu Lys Ala Phe Val Arg Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ala Pro Thr Lys Pro Leu Val Leu Ser Leu His Gly Trp Thr Gly
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ser Tyr Val Ser Ser Leu Leu Ala His Tyr Leu Phe Gln
            100                 105                 110
Gly Gly Leu Arg Ser Pro Arg Val His His Phe Ser Pro Val Leu His
        115                 120                 125
Phe Pro His Pro Ser His Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Asp Leu Lys Ser
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Trp Val Gln Gly Asn Leu Thr Ala Cys Gly Arg Ser Leu Phe Leu Phe
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Asp Glu Met Asp Lys Met Pro Pro Gly Leu Met Glu Val Leu Arg Pro
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Phe Leu Gly Ser Ser Trp Val Val Tyr Gly Thr Asn Tyr Arg Lys Ala
            180                 185                 190
Ile Phe Ile Phe Ile Arg Trp Leu Leu Lys Leu Gly His His Gly Arg
        195                 200                 205
Ala Pro Pro Arg Arg Ser Gly Ala Leu Pro Pro Ala Pro Ala Ala Pro
    210                 215                 220
Arg Pro Ala Leu Arg Ala Gln Arg Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gly Ala
225                 230                 235                 240
Lys Gly
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>5
cctggcaccc agcacaat    18
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<213>人工
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<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>8
cacacctggc aagatggagt t    21