一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细
神经元标记中的应用。
背景技术
人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础，神经网络的
正常连接，使得机体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常
往往导致神经疾病的出现，尚无有效手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病
机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究
而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。
西门利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)属于披膜病毒科甲病毒属，其基因组为单
股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成4个结构蛋白(C、P62、6K
和E1)和4个非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。塞姆利基森林病毒具有广泛的
宿主范围，包括：人、鼠、猴等，能够感染神经系统，一方面不利于人类的健康和农业生产，
另一方面，这种感染特性可以使得其成为介导外源基因到宿主体内的载体，另外，西门利克
森林病毒感染脑神经系统的特性使其成为具备解析神经环路的能力。但是因为存在一系列工
艺和技术改造方面的问题，所以目前其还没有应用到细胞精细形态的描绘、灵长类神经环路
的标记等方面。而本发明通过一系列的条件优化、系统的改造和升级，获得了一种高效且稳
定的具有单次感染特性的表达绿色荧光蛋白的SFV系统，明确了其在非人灵长类神经环路应
用方面的效果，为开展脑科学研究提供了良好的工具系统。
随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，
为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获
得了一种高效且稳定的具有单次感染特性的表达绿色荧光蛋白的SFV系统。将在神经细胞和
非神经细胞精细形态的描绘、灵长类和非灵长类解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物
(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分
析等方面具有广泛的应用价值和前景。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种西门利克森林病毒复制子，该复制子为含有荧光蛋白基因
和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。该复制子可用于西门利克森林病毒类病毒颗粒的
制备。
本发明还有一个目的在于提供了一种西门利克森林病毒复制子的应用，包括利用该复制
子制备西门利克森林病毒类病毒颗粒，或利用制备出的病毒样颗粒在稀疏或精细标记神经元
中的应用，同时，该复制子还可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经
环路的解析、灵长类神经细胞的标记、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗
体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方
面具有广泛的应用价值。
为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于在体稀疏精细标记神经元的西门利克森林病毒复制子，该复制子为含有荧光蛋
白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。
优选的，使用BamHI+XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)
Mol.Ther.7,202-209.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片
段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并
抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSFV-replicon-EGFP，其序列为SEQ ID NO:8所示。
一种用于在体稀疏精细标记神经元的西门利克森林病毒复制子的应用，包括：
1.西门利克森林病毒复制子制备表达绿色荧光蛋白的单次感染性的西门利克森林病毒类病
毒颗粒，包括制备出的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒或未激活的西门利克森林病毒类
病毒颗粒。
2.西门利克森林病毒复制子制备出的病毒样颗粒在制备稀疏或精细标记神经元中药物的应
用，所述的病毒样颗粒在鼠脑中的有效感染数目为1-50个，优选感染数目为1-15个。
所述应用特别适用于鼠脑神经细胞中的稀疏或精细标记。
本发明提供的一种在体稀疏精细标记神经元的西门利克森林病毒复制子的制备方法也
适合于与西门利克森林病毒同科的病毒的构建，例如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan
equine encephalitis virus,VEEV)和辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)。西门利克森林病毒复制子
或其制备出的病毒样颗粒不仅可用于在体稀疏精细标记神经元，还可用于非人灵长类神经细
胞的快速标记，蛋白表达、基因治疗、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位
分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致
病机制的分析。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1.本发明提供了一种高效、便捷的表达外源蛋白的类西门利克森林病毒的颗粒，该平台制
备的病毒具有可视化的特点，便于开展相关的研究。
2.本发明对于开展在体稀疏且精细标记神经元具有重要价值，同时对于其他应用性研究(如
蛋白表达、基因治疗、非人灵长类神经细胞的标记、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分
析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装和致病机制等)具有重要的现实
意义和广泛的应用价值。
3.本发明对于开展在fMOST进行全脑成像方面具有重要价值。
4.本发明制备的类病毒颗粒能够在数天的时间内快速标记鼠神经细胞。
5.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神
经环路的结构具有重要意义。SFV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标
记的潜力。本发明不仅能够用于非灵长类动物，而且还能用于灵长类动物的脑科学研究。
附图说明
图1为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒的构建和制备示意图。
A：一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子的构建示意图；
B：一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒的制备示意图。
图2为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒表达荧光示意图。
A：未转染RNA的细胞；
B：共转染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21细胞表达绿色荧光蛋白。
图3为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒单次感染细胞。
A：未激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；
B：未激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后收集的上清感染BHK21细胞，没有荧光蛋白的表
达，即没有病毒产生；
C：激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；
D：激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后收集的上清感染BHK21细胞，没有荧光蛋白的表达，
即没有病毒产生。
图4为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒生长曲线。
A：未激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；
B：不同时间收集的未激活的类病毒颗粒的滴度分析；
A：激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；
B：不同时间收集激活的类病毒颗粒的滴度分析。
图5为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在鼠脑内不同时间的标记情况。
A：未激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后3、6、12和24小时的表达情况；
B：激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后3、6、12和24小时的表达情况。
图6为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在鼠脑内稀疏标记神经元的情况。
A：不同剂量的未激活类病毒颗粒注射到鼠脑后稀疏标记神经元；
B：不同剂量的激活类病毒颗粒注射到鼠脑后稀疏标记神经元。
图7为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在鼠脑内标记神经元的精细形态。
A：未激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后标记神经元的精细形态；
B：激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后标记神经元的精细形态。
图8为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在标记鼠脑后在fMOST成像系统
中的应用。
A：未激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后能够达到fMOST成像的要求，可以清晰的显示神经元
的形态；
B：激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后能够达到fMOST成像的要求，可以清晰的显示神经元的
形态。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
实施例1：
一种西门利克森林病毒复制子，通过下述步骤制备得到：
①以pEGFP-N2(Invitrogen公司)为模板扩增EGFP基因，其序列为SEQ ID NO:1，使用
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物扩增片段SEQ ID NO:1；以pSFV-replicon(Lundstrom,K et
al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)为模板扩增capsid的N端102bp(即C34)，其序列为SEQ ID
NO:4，使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物扩增片段SEQ ID NO:4；按常规方式检测回
收扩增出的DNA片段。C34和EGFP之间通过F2A连接，其序列为SEQ ID NO:7，其序列包含
在引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:2中。
PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μM Forward
Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNA Polymerase：0.5
μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，
72℃10min，16℃10min，30个循环；
使用BamHI和XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)，
然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到SFV复制子质粒
Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质
粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSFV-replicon-EGFP，其序列为SEQ ID NO:8所示。
实施例2：
一种西门利克森林病毒复制子在制备表达绿色荧光蛋白的单次感染性的西门利克森林
病毒类病毒颗粒中的应用：
用NruI分别酶切pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper(Berglund,P et al.,(1993)
Biotechnology 11,916-920.)，使用MEGAscript SP6Transcription Kit分别体外转录酶切后的
pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO2培养
箱中培养，通过倒置荧光显微镜观察细胞状态和荧光表达，在感染后的不同时间收集病毒上
清。
图2中A：没有转染RNA的BHK21细胞，作为实验的对照；
图2中B：共转染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21细胞，1天后即
可产生绿色的荧光信号，表明依赖于西门利克森林病毒复制子能高效快速表达外源蛋白。
收集的病毒上清的一部分分装后，-80保存备用(即为未激活的西门利克森林病毒类病
毒颗粒)用于以下实验；
另一部分，使用终浓度为500μg/ml的α-chymotrypsin(Sigma)在37度处理收集的上清
30min，然后加入终浓度为250μg/ml aprotinin(Sigma)，-80度保存备用(激活的西门利克森
林病毒类病毒颗粒)。检测不同时间点收集病毒的滴度，选择滴度最高的病毒用于以下实验。
实施例3：
西门利克森林病毒复制子制备出的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有单次感染性：
分别分析激活和未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒的单次感染的特性，一方面，取
10μl未激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞，在感染后1天观察绿色荧光的表达情况，并收
集培养基上清。取收集的培养基上清100μl感染BHK21细胞，感染后不同时间观察荧光的
表达情况；另一方面，取1μl类病毒颗粒感染BHK21细胞，在感染后1天观察绿色荧光的
表达情况，并收集培养基上清。取收集的培养基上清100μl感染BHK21细胞，感染后不同
时间观察荧光的表达情况。
图3中A：携带EGFP基因的未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后
表达绿色荧光蛋白，表明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值，但是
表达绿色荧光蛋白的细胞数目较少。
图3中B：将图3中A的感染BHK21细胞后收集的上清再次感染新制备的BHK21细胞，
不同时间观察,无荧光信号，表明该病毒样颗粒具有单次感染细胞的特点。
图3中C：携带EGFP基因的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后表
达绿色荧光蛋白，表明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值，表达绿
色荧光蛋白的细胞数目很多。
图3中D：将图3中C的感染BHK21细胞后收集的上清再次感染新制备的BHK21细胞，
不同时间观察，无荧光信号，表明该病毒样颗粒具有单次感染细胞的特点。
实施例4：
西门利克森林病毒复制子制备出的西门利克森林病毒类病毒颗粒生长曲线分析：
分别取不同时间点收集的未激活和激活的类病毒颗粒10μl感染BHK21细胞(进行10
倍比的西施)，在感染后2天观察绿色荧光的表达情况，并计数荧光细胞的数量，计算病毒
的滴度。
图4中A：携带EGFP基因的未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后
表达绿色荧光蛋白。不同时间收集的病毒均能感染BHK21细胞，并表达绿色荧光蛋白，表
明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值。
图4中B：携带EGFP基因的未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒在BHK21细胞中的
生长曲线。在将pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA共转染BHK21细胞后1天，病毒
滴度即达到5×102FFU/ml，而后逐渐升高，转染后3天，滴度到达3.5×104FFU/ml。该数据
对于选择最佳的时间收集携带EGFP的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有重要意义。
图4中C：携带EGFP基因的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后表
达绿色荧光蛋白。不同时间收集的病毒均能感染BHK21细胞，并表达绿色荧光蛋白，表明
本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值。
图4中D：携带EGFP基因的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒在BHK21细胞中的生
长曲线。在将pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA共转染BHK21细胞后1天，病毒滴
度即达到7×106FFU/ml，而后逐渐升高，转染后3天，滴度到达1.8×108FFU/ml。该数据对
于选择最佳的时间收集携带EGFP的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有重要意义。
实施例5：
携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒快速标记鼠脑神经元(不同时间标记神
经元的情况)：
取2μl未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(病毒滴度是3.5×104FFU/ml)定位注射
到鼠(2月龄)丘脑腹后内侧核，感染后3、6、12和24小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)
生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛
液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液
中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观
察。未激活的类病毒颗粒注射到丘脑腹后内侧核6h后即可观察到明显的荧光信号，表明未
激活的类病毒颗粒能够在鼠脑内感染神经元并能表达表达绿色荧光蛋白，随着时间的延长
(12和24h)，荧光的表达数量增加(图5中A)。
取0.1μl激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(病毒滴度是1.8×108FFU/ml)定位注射
到鼠(2月龄)丘脑腹后内侧核，感染后3、6、12和24小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)
生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛
液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液
中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观
察。激活的类病毒颗粒注射到丘脑腹后内侧核6h后即可观察到明显的荧光信号，表明激活
的类病毒颗粒能够在鼠脑内感染神经元并能表达表达绿色荧光蛋白，随着时间的延长(12
和24h)，荧光的表达数量增加(图5中B)。
实施例6：
携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在鼠脑内稀疏标记神经元的精细形态：
取0.1、0.5和1μl未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(病毒滴度是3.5×104FFU/ml)
定位注射到鼠(2月龄)丘脑腹后内侧核，感染后24小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)
生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛
液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液
中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1小时后切片；取脑片后使用荧光显微
镜观察。未激活的类病毒颗粒注射到丘脑腹后内侧核24小时后即可见明显的荧光信号，表
明未激活的类病毒颗粒能够在鼠脑内感染神经元并能表达表达绿色荧光蛋白。随着注射剂量
的减少，标记的神经元的数目逐渐减少，呈现出稀疏标记的状态(图6中A)，能够标记神
经元的精细形态(图7中A)。
取0.3μl经过1:20000稀释的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(稀释前病毒滴度是
1.8×108FFU/ml)定位注射到鼠(2月龄)丘脑腹后内侧核，感染后24小时后麻醉动物，分
别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％
(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％
(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1小时后切片；取脑片
后使用荧光显微镜观察。激活的类病毒颗粒注射到丘脑腹后内侧核24小时后可见明显的荧
光信号，表明激活的类病毒颗粒能够在鼠脑内感染神经元并能表达表达绿色荧光蛋白。病毒
标记的状态为稀疏标记(图6中B)，能够标记神经元的精细形态(图7中B)。
1月龄～12月龄的鼠脑，无论是激活还是未激活的病毒颗粒，只要鼠脑中有效感染的病
毒粒为1-50个，均能产生上述相同的精细标记的效果。
实施例7：
携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在标记鼠脑后满足fMOST成像要求：
取0.5μl未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(病毒滴度是3.5×104FFU/ml)定位注射到
鼠(2月龄)皮层，感染后48小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后
用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织
先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天。取脑组织使
用fMOST仪器观察荧光蛋白的情况。荧光的亮度能够满足fMOST的成像要求(图8中A)。
取0.3μl经过1:20000稀释的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(稀释前病毒滴度是
1.8×108FFU/ml)定位注射到鼠皮层，感染后48小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐
水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，
然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天。
取脑组织使用fMOST仪器观察荧光蛋白的情况。荧光的亮度能够满足fMOST的成像要求(图
8中B)。
最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并
且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有
许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均
应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所
<120> 一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用
<130> 一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccttctcaag ctggcgggag acgtcgagtc caaccctggg ccaatggtga gcaagggcg 59
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatcgacta gtgaactcga gttacttgta cagctcgtcc atgcc 45
<210> 4
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaattaca tccctacgca aacgttttac ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc 60
cgtccctggc cgttgcaggc cactccggtg gctcccgtcg tc 102
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg 120
acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc 180
aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga 240
tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga 300
gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg 360
aaaggctcgt atgctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag 420
agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc 480
ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc 540
aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca 600
gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg 660
cgtatccaac ctacgccaca aactgggccg acgagcaggt gttacaggcc aggaacatag 720
gactgtgtgc agcatccttg actgagggaa gactcggcaa actgtccatt ctccgcaaga 780
agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt tctcggtagg atctacattg tacactgaga 840
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cctttacctg taggtgcgat accatcgtat catgtgaagg gtacgtagtt aagaaaatca 960
ctatgtgccc cggcctgtac ggtaaaacgg tagggtacgc cgtgacgtat cacgcggagg 1020
gattcctagt gtgcaagacc acagacactg tcaaaggaga aagagtctca ttccctgtat 1080
gcacctacgt cccctcaacc atctgtgatc aaatgactgg catactagcg accgacgtca 1140
caccggagga cgcacagaag ttgttagtgg gattgaatca gaggatagtt gtgaacggaa 1200
gaacacagcg aaacactaac acgatgaaga actatctgct tccgattgtg gccgtcgcat 1260
ttagcaagtg ggcgagggaa tacaaggcag accttgatga tgaaaaacct ctgggtgtcc 1320
gagagaggtc acttacttgc tgctgcttgt gggcatttaa aacgaggaag atgcacacca 1380
tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgttcg 1440
tcatcccgag cctatggtct acaggcctcg caatcccagt cagatcacgc attaagatgc 1500
ttttggccaa gaagaccaag cgagagttaa tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg 1560
atgctgaaca agaggagaag gagaggttgg aggccgagct gactagagaa gccttaccac 1620
ccctcgtccc catcgcgccg gcggagacgg gagtcgtcga cgtcgacgtt gaagaactag 1680
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agccgaacga cgtactacta ggaaattacg tagttctgtc cccgcagacc gtgctcaaga 1800
gctccaagtt ggcccccgtg caccctctag cagagcaggt gaaaataata acacataacg 1860
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cggccattcc ggtccctgag tttcaggctt tgagcgagag cgccactatg gtgtacaacg 1980
aaagggagtt cgtcaacagg aaactatacc atattgccgt tcacggaccc tcgctgaaca 2040
ccgacgagga gaactacgag aaagtcagag ctgaaagaac tgacgccgag tacgtgttcg 2100
acgtagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgtc gggtttggtg ttggtgggag 2160
agctaaccaa ccccccgttc catgaattcg cctacgaagg gctgaagatc aggccgtcgg 2220
caccatataa gactacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc aagtctgcta 2280
ttattaagag cctcgtgacc aaacacgatc tggtcaccag cggcaagaag gagaactgcc 2340
aggaaatagt caacgacgtg aagaagcacc gcggactgga catccaggca aaaacagtgg 2400
actccatcct gctaaacggg tgtcgtcgtg ccgtggacat cctatatgtg gacgaggctt 2460
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tggtgttatg cggagacccc aagcaatgcg gattcttcaa tatgatgcag cttaaggtga 2580
acttcaacca caacatctgc actgaagtat gtcataaaag tatatccaga cgttgcacgc 2640
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agaaggtgaa tgaaaatccc ttgtatgccc ctgcgtcgga gcacgtgaat gtactgctga 2940
cgcgcactga ggataggctg gtgtggaaaa cgctggccgg cgatccctgg attaaggtcc 3000
tatcaaacat tccacagggt aactttacgg ccacattgga agaatggcaa gaagaacacg 3060
acaaaataat gaaggtgatt gaaggaccgg ctgcgcctgt ggacgcgttc cagaacaaag 3120
cgaacgtgtg ttgggcgaaa agcctggtgc ctgtcctgga cactgccgga atcagattga 3180
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tggtggcctt gaatgaaatt tgcaccaagt actatggagt tgacctggac agtggcctgt 3300
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tttctgtgct ggacaatgta attcctatca accgcaggct gccgcacgcc ctggtggctg 3540
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cctctacgct acaccagatg aataccaagc tgagtgccgt gtatgccgga gaagccatgc 4080
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