一个NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用技术领域
本发明属于基因工程领域，公开了小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中一个
NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum)的整个生育期受到多种病虫的危害，其中由小麦白粉
病菌(Blurmeria graminis f.sp.tritici，Bgt)侵染引起的小麦白粉病是小麦最严重的真
菌病害之一。由于小麦白粉病菌生理小种多、毒力变异快，一旦产生新的毒性小种或小种种
群发生变化，会导致小麦白粉病的大爆发，给农业生产带来灾难性后果。广谱、持久抗病基
因的发掘和利用对白粉病防治具有重要意义。
簇毛麦(Haynaldia villosa，2n＝2x＝14，VV)携带的抗白粉病基因Pm21对小麦白
粉病具有广谱、高抗特性，该基因定位于6V染色体短臂上。南京农业大学细胞遗传研究所利
用四倍体圆锥小麦与二倍体簇毛麦杂交，再与普通小麦回交多代后，选育出了普通小麦-簇
毛麦6VS/6AL易位系，将含有Pm21基因的6VS导入普通小麦。普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位
系自1994年进入国内育种利用以来，在白粉病常发区进行了多年种植，对白粉病表现出了
广谱、高抗特性，以之为亲本已经选育出一批高抗白粉病的小麦新品种，南农9918即选育出
的其中一个品种，Pm21在育种中得到广泛应用。分析Pm21介导的广谱抗性机理和克隆其候
选基因对于利用基因工程手段培育具有白粉病广谱抗性的小麦品种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一个NLR类基因NLR1-V的表达载
体和应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
NLR类基因NLR1-V来自普通小麦(Triticum asetivum L.)南农9918，其核苷酸序
列为SEQ ID NO.1。
该NLR类基因NLR1-V的蛋白质为NLR1-V，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
含有所述的NLR类基因NLR1-V的重组表达载体pBI220:NLR1-V。
所述的NLR类基因NLR1-V的重组表达载体优选以pBI220为出发载体，将NLR1-V基
因插入pBI220的BamHI和StuI酶切位点间所得。
所述的NLR类基因NLR1-V的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。
有益效果：
本发明从小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染色体臂上克隆获得小麦中
克隆得到了一个NLR类基因NLR1-V及其所编码的蛋白质NLR1-V，将其插入表达载体pBI220，
得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病
的抗性。NLR1-V的超量表达载体用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够
获得具备白粉病抗性的小麦种质。
附图说明
图1 NLR1-V在抗白粉病南农9918中受白粉菌诱导表达
图2 pBI220:NLR1-V超量表达载体图谱
图3 与白粉菌互作的表达GUS基因的表皮细胞
A图:白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后未形成吸器；B图:白粉菌侵入GUS表达的表
皮细胞后形成吸器；其中，co:分生孢子；pp:侵入钉；ha:吸器；hy:菌丝
图4 利用瞬间表达研究NLR1-V基因对吸器形成的影响和抗白粉病效应
具体实施方式
实施例1小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中一个NLR类基因NLR1-V的克隆
小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918是南京农业大学细胞遗传所育成的含有广
谱抗白粉病基因Pm21的小麦品种(公知公用，陈佩度，张守忠，王秀娥，王苏玲，周波，冯祎
高，刘大钧.抗白粉病高产小麦新品种南农9918.南京农业大学学报,2002,25(4):1438-
1444)。前期已经在南农9918的6VS上开发了多个6VS的转化序列，进一步利用小片段插入易
位系NAU418将Pm21限定在6EST258和CINAU15之间，并且在Pm21所在染色体区间还有
6EST243和6EST238两个标记(公知公用，Radiation-induced translocations with
reduced Haynaldia villosa chromatin at the Pm21locus for powdery mildew
resistance in wheat.Molecular breeding,2013,31:477–484)。
将6EST258、CINAU15、6EST243、6EST238序列与水稻(http://
rice.plantbiology.msu.edu)、大麦(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/
viroblast.php)、短柄草(http://plants.ensembl.org/Brachypodium_distachyon/Info/
Index)的序列数据库进行Blastn比对分析，分别提取出水稻、大麦、短柄草中位于6EST258
和CINAU15所在染色体区间的序列。根据其中一个大麦的序列设计引物，在南农9918受白粉
菌诱导的cDNA样品中进行扩增，获得NLR1-V全长序列。cDNA样品准备及扩增流程如下：
具体流程如下：(1)将抗白粉病小麦南农9918的种子播于培养皿中发芽，露白后移
栽到盆钵，一叶期把从感白粉病小麦材料上搜集的白粉菌孢子接种到苗上进行诱导，并于
接种不同时间段取样(0h,1h,6h,12h,24h)，分别提取RNA(用Invitrogen公司的Trizol试剂
提取)，并且反转录成cDNA样品(用Takara公司的AMV反转录酶反转)。(2)以南农9918经白粉
菌诱导24小麦的cDNA为模板，以NLR1-V基因引物P1(ATTGAGATGTCTGCACCGGTCGT,SEQ ID
NO.3)和P2(CTCTCTTCGTTACATAATGTAGTGCC,SEQ ID NO.4)为引物进行RT-PCR，获得NLR1-V
基因的cDNA全长片段。对该基因片段进行测序和比对，发现该基因为一个NLR类基因，命名
为NLR1-V。对NLR1-V进行生物信息学分析，发现ORF(开放阅读框)2730bp，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.1所示，编码909个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2NLR类基因NLR1-V在小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中受白粉菌诱
导表达
以小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918受白粉菌诱导不同时间段的cDNA样品为
模板，以根据NLR1-V设计的引物P3(ACGGGCTTATTCCAAGTCCT,SEQ ID NO.5)和P4
(ACGCTTCTGAAGGCAGACTC，SEQ ID NO.6)为引物进行Q-PCR分析。PCR程序为：PCR反应在实时
荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uL PCR反应体系中含2×
SYBR Green PCR Master Mix 10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为：
95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线
的测定。检测基因表达水平用MyiQ系统软件进行分析。结果表明：在南农9918中，NLR1-V在
小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918受白粉菌诱导上调表达，12h小时表达水平最高，24h
后表达水平开始下降(图1)。
实施例3NLR1-V基因瞬间表达载体的构建
以经白粉菌诱导的南农9918中克隆的NLR1-V基因cDNA为模板，使用引物对NLR1-
V-BamHI-F(GGAGAGAACACGGGGGATCCATGTCTGCACCGGTCGTCAG，SEQ ID NO.7)和NLR1-V-StuI-
R(AACGTCGTATGGGTAAGGCCTTTAAAGTAAAACTGGGACCACATTCATAG，SEQ ID NO.8)进行PCR扩增，
回收扩增片段。用BamHI和StuI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到BamHI和StuI双
酶切后的载体pBI220(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-
glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher
plants.EMBO J.1987,6:3901-3907.)，将NLR1-V置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此
将目标基因NLR1-V克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:NLR1-V(图1)。经测序
验证，表明载体构建成功。
实施例4利用瞬间表达方法将NLR1-V基因转入小麦叶片
瞬间表达方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法(Schweizer,Pokorny et
al.A Transient Assay System for the Functional Assessment of Defense-Related
Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654.)。本研究
利用瞬间表达方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒和基因轰击到
小麦叶片的表皮细胞，然后统计轰击NLR1-V细胞的白粉菌吸器指数与未轰击NLR1-V细胞的
白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。
载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：
制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf管中，加入1ml 70％酒精，涡旋3-
5min后静置15min，使钨粉完全沉淀。12000rpm离心1min后弃上清。加入1ml ddH2O水，涡旋
混匀后，离心弃上清(重复三次)。最后加入500μl 50％甘油涡旋混匀，以备用。
包裹子弹：吸取5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA
(总量应为1μg)。边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl 2.5M CaCl2，然后加入20μl 0.1M亚
精氨(现配先用)，涡旋3min。静置1min后离心2s，弃上清。加入140μl 70％酒精，充分涡旋，
离心2s，弃上清。然后加入140μl 100％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μl
100％酒精，充分涡旋，以备使用。
实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pAHC25(Christensen A H,Quail
P H.Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable
and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic
Research,1996,5:213-218.)的质粒DNA与钨粉包裹；当实施NLR1-V与GUS基因共转化时，将
含有NLR1-V基因表达载体pBI220:NLR1-V的质粒DNA与含有GUS基因表达载体pAHC25的质粒
DNA按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹钨粉。当GUS基因与NLR1-V基因进行共转化时，Marker
基因GUS转入的细胞也是NLR1-V转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经染色整个细胞呈现蓝
色，所以本研究以蓝色细胞作为NLR1-V的表达细胞。
基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每
张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDS1000/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为
28inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，
18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：
0.1mol/L Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(pH7.0)，含10mmol/L EDTA，5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰
化钾，0.1mg/ml X-Gluc，0.1％Triton X-100，20％甲醇)真空渗透10min,37℃染色12h，然
后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉
菌孢子染色。
实施例5NLR1-V抗病功能的分析
白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸器不
能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，吸器会被GUS
染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认(图3)。在GUS基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互
作的GUS表达细胞中，吸器形成的细胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(Schweizer,
Pokorny et al.A Transient Assay System for the Functional Assessment of
Defense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:
647-654.)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用“吸器指数”作为抗病强弱的衡量
指标。
当单转化GUS基因时，感病小麦扬麦158的吸器指数为41.33％(统计了675个互作
细胞)，当GUS基因与NLR1-V共转化感病小麦扬麦158后，统计了GUS基因表达(即NLR1-V表
达)且有白粉菌互作的细胞的吸器指数，结果表明当NLR1-V转入后，扬麦158的吸器指数从
41.33％降到19.23％(统计了603个细胞)(图4)。该结果说明，NLR1-V能显著降低吸器指数，
对白粉菌具有抗病作用。
<110> 南京农业大学
<120> 一个NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用
<160> 8
<210> 1
<211> 2730
<212> DNA
<213> 普通小麦（Triticum asetivum L.）南农9918
<220>
<223> NLR1-V
<400> 1
atgtctgcac cggtcgtcag cgccaccatg ggggcgatga accccctcat cggcaagctc 60
gccgcactga ttggtgacga gtacaagaaa ctcacagggg tgaggagaca ggcctccttc 120
ctcaaggatg agcttagcgc catgaaagct ctccttgaga agcttgagct catggatgaa 180
ctggatccct tggccaagaa ctggagggat tatgtccggg agatgtccta cgacatggag 240
aattgcattg atgacttcat gcgagacctt ggaggtgccg atgcaaagac gggctttatc 300
aagaagacgg ctaaacgtct caagacgttg cggaagcgtc atcgtattgc tgatcggatg 360
gaagagctca aggggcttgc tttgcaagca aatgaacgac gcatgaggta caagattgat 420
gattgcgcca attctaccaa tcgtgtcgtt cccatcgata ctcggatgtt ggcaatctac 480
aagcaggcaa cggggcttgt tggtattgat ggcccaaaga aagagcttgt aagttggttg 540
acagatactc aggaaaaact caaggtggtg gctattgttg gatttggagg ccttggtaaa 600
actacacttg ccaaacaagt atatgatacg attggagggc aattcagctg taaaatattt 660
ttctctgttt ctcaaagacc tgatatgtca agcctccttc gtggtctcca atcggagctt 720
aatatggaag aggagttaac tcagcctcac gaggtgcaac acatcattgg ccgtcttaga 780
gaatatctca cacataagag gtaccttatt gttgttgatg acttgtggta tcaatcaaca 840
tggaatatca tgagttgtat ctttccagaa gtcgggaatg gaagtagagt aatagtaact 900
acacgagtgg aggatgtggc tatttgggca tgtcgtgatg accatgagtg tgtttataga 960
atggaacccc tcaaagaaca agactcaaga atgctgttct gtaatagagt atttggttcc 1020
ggatatgcct gtccactgcc gttaaaaaaa gtttcagatg aaattttgaa gaagtgtgga 1080
gggttgccac ttgcaattat cactatagct agtctattag caagtcgtca agcaagatca 1140
gacgagtggg agagcataag aaattgtttg ggcgctaagc ttgccataaa ttccaccttg 1200
gaagagatga ggagtatact gaaccttagc tacatgcatc ttcctcttca tctccgtcca 1260
tgtctcctgt actttggcat gtatccagaa gacaaaatta tcaggaggcg tgacatggtt 1320
ctacagtggg tagccgaagg ctttgtcaat aattctcatg gatctaatct agaggatgtt 1380
gcagagagtt atttcaatga gcttatcaat agaagtctaa ttcagcctgg agaatccata 1440
gatggaaaga ttgagtctta caaagtacac gatatgatgc ttgatttgat cctcagcaag 1500
tgtgcagaaa ataattttat aagtgtggca tataattgtg aagacgtggc aagaatgcat 1560
ggccgcgaat acaaggtccg tagattgtcc ttgacttcaa gtgctaacga tgcaacatca 1620
gaaaacattc atactagcat gcaacaaatt cgctcatttt catgctttgg agagcctaaa 1680
tacacacctc ctcttttgct atttaaatac cttcgggtgc tagtgtttat atcctcagac 1740
gcgtttggtc cgatagtgga ccttactgct attggtcaat tgtttcagct aaggtatgtc 1800
aaggtttctg cttcatacgg aatagatttt cctaccgaat ttcgcaagct tgttcatttg 1860
gagacgctgg aagtatctgg tttttcacca agcatcccgt cagatattgt ttgcttgcca 1920
cggttatctc gtctgatcct tccgtgtctt acacgtcttc ctcaagggat tgccaacata 1980
aaatcattgc gtgcattgca ctgtatggag cacatctcgc tagaggatat taatggcctt 2040
ggcgagctga ccagtctgag ggagctgagg ctttacacta aaatggtggc gggtgaagtt 2100
gatgctttgg tatccctaat tggaaagctc catgacctaa aatacctcgc ggtctctgtt 2160
gagtcttcta aacatcattg cgacccgttg tactcattat caaaccctcc tctccatatc 2220
gaggaacttg atctgtacgg gtggacactg aagagagttc ccacatggat tggtgacctc 2280
catttccttc ggatcctgga tttgtgtgtc tacaacttgt tgaacgacga ggttcatgtt 2340
gtgggaaatc ttccctgcct cgtccatctg cgtctaaggg tgttcgctga aggcggggcc 2400
gtaatctgca cgggcttatt ccaagtcctg aaagtccttc gtctcttctc tcatgatgtg 2460
gaagacatgc agtttcagat agggctaatg cccagcctgc gacagctcac tctagaagta 2520
aataatggct ggggtggtgc tgtgcctcga ggcatggagc acctattggc cctcgatcac 2580
atctctgtat ttgccagacg cggcgtcaat caccgtgatg tcgagtctgc cttcagaagc 2640
gtcttcgatg tgcacccaag acaaccttcc ttagaaataa tacctgatgt tcccctcagt 2700
tctatgaatg tggtcccagt tttactttaa 2730
<210> 2
<211> 909
<212> PRT
<213> 普通小麦（Triticum asetivum L.）南农9918
<220>
<223> 蛋白NLR1-V
<400> 2
Met Ser Ala Pro Val Val Ser Ala Thr Met Gly Ala Met Asn Pro Leu
1 5 10 15
Ile Gly Lys Leu Ala Ala Leu Ile Gly Asp Glu Tyr Lys Lys Leu Thr
20 25 30
Gly Val Arg Arg Gln Ala Ser Phe Leu Lys Asp Glu Leu Ser Ala Met
35 40 45
Lys Ala Leu Leu Glu Lys Leu Glu Leu Met Asp Glu Leu Asp Pro Leu
50 55 60
Ala Lys Asn Trp Arg Asp Tyr Val Arg Glu Met Ser Tyr Asp Met Glu
65 70 75 80
Asn Cys Ile Asp Asp Phe Met Arg Asp Leu Gly Gly Ala Asp Ala Lys
85 90 95
Thr Gly Phe Ile Lys Lys Thr Ala Lys Arg Leu Lys Thr Leu Arg Lys
100 105 110
Arg His Arg Ile Ala Asp Arg Met Glu Glu Leu Lys Gly Leu Ala Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Glu Arg Arg Met Arg Tyr Lys Ile Asp Asp Cys Ala Asn
130 135 140
Ser Thr Asn Arg Val Val Pro Ile Asp Thr Arg Met Leu Ala Ile Tyr
145 150 155 160
Lys Gln Ala Thr Gly Leu Val Gly Ile Asp Gly Pro Lys Lys Glu Leu
165 170 175
Val Ser Trp Leu Thr Asp Thr Gln Glu Lys Leu Lys Val Val Ala Ile
180 185 190
Val Gly Phe Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Gln Val Tyr
195 200 205
Asp Thr Ile Gly Gly Gln Phe Ser Cys Lys Ile Phe Phe Ser Val Ser
210 215 220
Gln Arg Pro Asp Met Ser Ser Leu Leu Arg Gly Leu Gln Ser Glu Leu
225 230 235 240
Asn Met Glu Glu Glu Leu Thr Gln Pro His Glu Val Gln His Ile Ile
245 250 255
Gly Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Thr His Lys Arg Tyr Leu Ile Val Val
260 265 270
Asp Asp Leu Trp Tyr Gln Ser Thr Trp Asn Ile Met Ser Cys Ile Phe
275 280 285
Pro Glu Val Gly Asn Gly Ser Arg Val Ile Val Thr Thr Arg Val Glu
290 295 300
Asp Val Ala Ile Trp Ala Cys Arg Asp Asp His Glu Cys Val Tyr Arg
305 310 315 320
Met Glu Pro Leu Lys Glu Gln Asp Ser Arg Met Leu Phe Cys Asn Arg
325 330 335
Val Phe Gly Ser Gly Tyr Ala Cys Pro Leu Pro Leu Lys Lys Val Ser
340 345 350
Asp Glu Ile Leu Lys Lys Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Ile Ile Thr
355 360 365
Ile Ala Ser Leu Leu Ala Ser Arg Gln Ala Arg Ser Asp Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Ile Arg Asn Cys Leu Gly Ala Lys Leu Ala Ile Asn Ser Thr Leu
385 390 395 400
Glu Glu Met Arg Ser Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Met His Leu Pro Leu
405 410 415
His Leu Arg Pro Cys Leu Leu Tyr Phe Gly Met Tyr Pro Glu Asp Lys
420 425 430
Ile Ile Arg Arg Arg Asp Met Val Leu Gln Trp Val Ala Glu Gly Phe
435 440 445
Val Asn Asn Ser His Gly Ser Asn Leu Glu Asp Val Ala Glu Ser Tyr
450 455 460
Phe Asn Glu Leu Ile Asn Arg Ser Leu Ile Gln Pro Gly Glu Ser Ile
465 470 475 480
Asp Gly Lys Ile Glu Ser Tyr Lys Val His Asp Met Met Leu Asp Leu
485 490 495
Ile Leu Ser Lys Cys Ala Glu Asn Asn Phe Ile Ser Val Ala Tyr Asn
500 505 510
Cys Glu Asp Val Ala Arg Met His Gly Arg Glu Tyr Lys Val Arg Arg
515 520 525
Leu Ser Leu Thr Ser Ser Ala Asn Asp Ala Thr Ser Glu Asn Ile His
530 535 540
Thr Ser Met Gln Gln Ile Arg Ser Phe Ser Cys Phe Gly Glu Pro Lys
545 550 555 560
Tyr Thr Pro Pro Leu Leu Leu Phe Lys Tyr Leu Arg Val Leu Val Phe
565 570 575
Ile Ser Ser Asp Ala Phe Gly Pro Ile Val Asp Leu Thr Ala Ile Gly
580 585 590
Gln Leu Phe Gln Leu Arg Tyr Val Lys Val Ser Ala Ser Tyr Gly Ile
595 600 605
Asp Phe Pro Thr Glu Phe Arg Lys Leu Val His Leu Glu Thr Leu Glu
610 615 620
Val Ser Gly Phe Ser Pro Ser Ile Pro Ser Asp Ile Val Cys Leu Pro
625 630 635 640
Arg Leu Ser Arg Leu Ile Leu Pro Cys Leu Thr Arg Leu Pro Gln Gly
645 650 655
Ile Ala Asn Ile Lys Ser Leu Arg Ala Leu His Cys Met Glu His Ile
660 665 670
Ser Leu Glu Asp Ile Asn Gly Leu Gly Glu Leu Thr Ser Leu Arg Glu
675 680 685
Leu Arg Leu Tyr Thr Lys Met Val Ala Gly Glu Val Asp Ala Leu Val
690 695 700
Ser Leu Ile Gly Lys Leu His Asp Leu Lys Tyr Leu Ala Val Ser Val
705 710 715 720
Glu Ser Ser Lys His His Cys Asp Pro Leu Tyr Ser Leu Ser Asn Pro
725 730 735
Pro Leu His Ile Glu Glu Leu Asp Leu Tyr Gly Trp Thr Leu Lys Arg
740 745 750
Val Pro Thr Trp Ile Gly Asp Leu His Phe Leu Arg Ile Leu Asp Leu
755 760 765
Cys Val Tyr Asn Leu Leu Asn Asp Glu Val His Val Val Gly Asn Leu
770 775 780
Pro Cys Leu Val His Leu Arg Leu Arg Val Phe Ala Glu Gly Gly Ala
785 790 795 800
Val Ile Cys Thr Gly Leu Phe Gln Val Leu Lys Val Leu Arg Leu Phe
805 810 815
Ser His Asp Val Glu Asp Met Gln Phe Gln Ile Gly Leu Met Pro Ser
820 825 830
Leu Arg Gln Leu Thr Leu Glu Val Asn Asn Gly Trp Gly Gly Ala Val
835 840 845
Pro Arg Gly Met Glu His Leu Leu Ala Leu Asp His Ile Ser Val Phe
850 855 860
Ala Arg Arg Gly Val Asn His Arg Asp Val Glu Ser Ala Phe Arg Ser
865 870 875 880
Val Phe Asp Val His Pro Arg Gln Pro Ser Leu Glu Ile Ile Pro Asp
885 890 895
Val Pro Leu Ser Ser Met Asn Val Val Pro Val Leu Leu
900 905
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P1
<400> 3
attgagatgt ctgcaccggt cgt 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P2
<400> 4
ctctcttcgt tacataatgt agtgcc 26
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P3
<400> 5
acgggcttat tccaagtcct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P4
<400> 6
acgcttctga aggcagactc 20
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物NLR1-V-BamHI-F
<400> 7
ggagagaaca cgggggatcc atgtctgcac cggtcgtcag 40
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物NLR1-V-StuI-R
<400> 8
aacgtcgtat gggtaaggcc tttaaagtaa aactgggacc acattcatag 50