一种嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒的制备方法和应用技术领域
本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种以重组人3型腺病毒为载
体，嵌合传染性法氏囊病毒（IBDV）中和表位的重组人3型腺病毒表位疫苗候选株及其制备
方法和应用。
背景技术
传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病毒（IBDV）引起的鸡和火鸡的一种急
性、高度接触性传染病，除直接引起鸡死亡和生产性能下降外，还可导致感染鸡免疫抑制。
反向遗传技术的成功建立，很大程度上推进了IBDV的预防工作。众多学者对于
IBDV的A节段做了相关的研究，发现IBDV的VP2蛋白对病毒的毒力、细胞嗜性有重要作用，
VP3和VP5蛋白也对病毒的复制有一定的影响，VP1对病毒的复制也有一定的影响。研究表
明，IBDV VP2上存在2个线性中和抗原表位，其刺激机体后产生的抗体可以有效的中和IBDV
感染鸡胚。
由于IBDV对很多理化条件都有很强的抵抗力，对乙醚，氯仿，吐温，胰蛋白酶都有
抵抗力，对大多数消毒药也有抵抗力，病毒很容易被携带和保存。
应用疫苗进行免疫接种是防控IBDV的最主要手段。通常是接种育种鸡，这样可以
使刚出壳的雏鸡获得一定水平的母源抗体以抵御早期感染。用于育种鸡免疫的通常采用灭
活疫苗，但是该病毒的灭活后仍然存在一定的危害，且免疫效果没有活苗好。使用弱毒活疫
苗虽然提高了疫苗的保护力，但是其会收到母源抗体的干扰，而且通常还有一定残存的毒
力，存在毒力返强的危险，中等毒力活疫苗可以不受母源抗体干扰而产生较强的免疫应答，
但由于其残存的毒力，通常容易引起法氏囊组织损伤。
人3型腺病毒（HAdV3）疫苗可以作为经肠道黏膜免疫的载体使用，其六邻体的高变
区可以插入氨基酸的外源片段，这样将具有免疫活性的抗原片段展示的人3型腺病毒粒子
表面，随着病毒的复制，含有抗原片段的重组子就会不断复制，并且展示到人3型腺病毒的
表面的抗原片段具有更好的免疫原性。
经检索，未见用重组人3型腺病毒表位疫苗候选株用于传染性法氏囊病预防的报
导。
发明内容
本发明的目的是提供一种嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒的制备方法和应
用，将IBDV的中和抗原表位嵌和到人3型腺病毒（HAdV3）病毒粒子表面，可获得一种预防
IBDV的表位疫苗候选株。
实现本发明目的的技术方案是：
一种嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒，所述人3型腺病毒六邻体的HVR1区插入有
IBDV的中和抗原表位VP2-1，VP2-1的氨基酸序列为CDSSDRPRVYTIT。
其中，所述IBDV的中和抗原表位VP2-1的替换氨基酸序列为HVR1区的NRDNAVTT。
本发明还提供一种人3型腺病毒-IBDV VP2-1的表位疫苗候选株，所述表位疫苗候
选株含有上述的重组人3型腺病毒，该表位疫苗候选株可以诱导产生抗IBDV的免疫反应，利
用该表位疫苗候选株可以制备预防IBDV的表位疫苗。
本发明还提供一种载体，所述载体包含上述的重组人3型腺病毒。
本发明还提供了制备上述嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒，包括如下步骤：
在人3型腺病毒（HAdV3）的六邻体的HVR1区插入IBDV的中和抗原表位VP2-1， VP2-1氨基酸
序列为CDSSDRPRVYTIT，所替换的氨基酸序列为NRDNAVTT。
本发明嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒的应用，用于传染性法氏囊病的预
防。
本发明所提供的嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒，允许IBDV中和抗原表位
个别氨基酸的缺失、替换或添加。但需要保持中和抗原表位的免疫原性；允许被置换的HVR1
区个别氨基酸的缺失、替换或添加，但需要保持腺病毒的稳定性，同时保证外源表位的免疫
活性。
本发明在人3型腺病毒六邻体衣壳上展示IBDV的中和抗原表位，该重组腺病毒可
以产生抗IBDV感染的免疫应答，多次免疫注射能加强免疫。该重组病毒可以预防IBDV感染。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实
施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常
按照常规实验方法进行。
本实施例中的Ad3使用的Hadv3病毒株(全基因Genbank号：DQ099432)。
1：构建重组病毒载体
以HAdv3载体为模板，重叠PCR分别扩增含有IBDV的中和抗原表位的六邻体片段。经过
Cla I，Bam H I双酶切后与经过Cla I，Bam H I酶切后的穿梭质粒PBRLOR连接构建穿梭质
粒，命名为PBRLOR –Ad3-IBDV VP2-1。将构建好的穿梭质粒经过EcoR I，Sal I双酶切与骨
架质粒pBRAd3△E3GFP经过Pac I，AvR II在BJ5183内同源重组，得到重组质粒pAd3-IBDV
VP2-1△E3GFP。所使用的引物见表1，IBDVr为PCR筛选鉴定用特异引物。
表1重叠PCR法扩增外源表位嵌入的HAdv3-IBDV VP2-1六邻体基因使用的引物
将上述重组得到的质粒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP经过AsisI酶切后，转染Ad293细胞，
拯救包装得到重组病毒。大量培养并CsCl密度梯度离心纯化病毒粒子。经过纯化的病毒粒
子达到1×1012 VPs/ml，测定OD260/OD280比值约1.2-1.4，内毒素检测<10EU/ml。重组病毒
pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP在HEp-2细胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、
测序鉴定，表明重组病毒基因组保持稳定，没有基因缺少、重组现象。
：重组病毒的免疫原性实验
制备抗血清，进行血清中和实验，验证重组病毒载体的免疫原性。将纯化的重组病毒
pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP经肌肉注射免疫小鼠，得到的多抗血清进行鸡胚中和实验，检测
重组病毒产生的抗IBDV感染的能力。
免疫3次后，第14天采集小鼠的血清，中和实验见表2，表2为多次免疫小鼠的中和
效价，实验结果数据表明多次免疫后抗IBDV的免疫应答得到加强。
表2 多次免疫后血清中和效价
CDSSDRPRVYTIT
NRDNAVTT