一种DNA分子STTM-miR482a及其应用技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种STTM-miR482a及其在抑制植株
microRNA482a功能中的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类长约22nt的内源RNA，是生物体内重要的转录后调控因子
之一，参与调节植物的生长发育以及胁迫响应等过程。成熟的miRNA与AGO1蛋白等组成RNA
诱导的沉默复合体对靶基因进行切割或抑制其翻译，从而发挥调控作用。最近，有研究发现
拟南芥中IPS1基因与miR399之间可以通过碱基互补配对方式结合，IPS1基因在切割位点处
形成了3个碱基的错配环，该错配环使miR399不能对IPS1基因进行切割，同时也避免IPS1基
因被降解。当IPS1过表达时，其与miR399结合，从而导致miR399不能与其靶基因结合，使
miR399失去了原有的调控作用，IPS1被称为内源的靶基因模拟物。后来研究者用人工设计
的48nt的接头将两个内源的靶基因模拟物片段连接在一起形成短串联靶模拟(Short
Tandem Target Mimic-STTM)。STTM可以作为沉默miRNA的工具，应用于miRNA的相关研究。
自从miR482在毛果杨中第一次被发现以来，人们已在多种植物中如拟南芥、烟草、番茄发现
了miR482。在未受病原菌侵染时，植物会利用miR482沉默体内大部分的NBS-LRR基因。NBS-
LRR基因是一个植物体内抗病基因的大家族，当病原物侵染植物时，NBS-LRR识别病原体分
泌的效应蛋白，引起植物的超敏反应，进一步抑制病原物的扩散。抑制番茄中miR482的表
达，可以有效的解除miR482对NBS-LRR基因的沉默作用，提高植物的抗病性。在现有的技术
中，利用STTM技术提高植物抗病性的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于开发一种DNA分子STTM-miR482a，并将其应用于调控
microRNA482a功能。
上述目的为达到，本发明提供了一种DNA分子STTM-miR482a，其核苷酸如SEQ ID
NO.1所示。
本发明还提供了上述DNA分子STTM-miR482a的应用，具体为将表达DNA分子STTM-
miR482a的重组载体用于调控植物中microRNA482a表达、调控植物抗病性，尤其适用于提高
植物的抗晚疫病性；
所述microRNA482a的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。
所述调控的具体方法为：将所述表达DNA分子STTM-miR482a的重组表达载体转化
农杆菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、链霉素及利福平的YEB固体培养基上，挑取单菌落进
行菌液PCR验证。选取阳性工程菌侵染预培养后的番茄子叶，共培养，分化出芽，将抗性芽移
至生根培养基中诱导生根后移栽，实时定量PCR验证即得到可调控microRNA482a表达的转
基因植物。
含有本发明STTM-miR482a DNA分子的转基因植物的抗病性高于其他目的植物。
优选方式下，所述目的植物为双子叶植物番茄。
上述重组表达载体优选含有DNA分子STTM-miR482a的载体。
上述应用中，将DNA分子分子STTM-miR482a插入表达载体中，即得到表达STTM-
miR482a的重组表达载体。
优选方式下，所述表达载体为PBI121载体；上述表达STTM-miR482a的重组表达载
体的具体制备方法为：将所述DNA分子STTM-miR482a插入PBI121载体的SacⅠ和Bam HⅠ之间，
且插入的位置为CaMV35s启动子之后，即得到表达STTM-miR482a的重组表达载体，本发明将
该重组表达载体命名为PBI-STTM-miR482a。
本发明的技术创新在于：
1、本发明获得了过表达STTM-miR482a的转基因番茄植株。
2、本发明DNA分子通过抑制野生型番茄中microRNA482a的表达得到转基因番茄，
与野生型番茄相比，对晚疫病的抗性增强。
3、本发明对培育抗晚疫病的番茄品种，提高番茄产量具有重要意义，以及为其他
植物的抗病性研究提供依据。
附图说明
图1为过表达载体pBI-STTM-miR482a的物理图谱；
图2为转STTM-miR482a番茄中miR482a的表达情况；
图3为转STTM-miR482a番茄离体叶片的抗病性检测；
图4为转STTM-miR482a番茄植株的抗病性检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。实施例中未注明的实验条件及方法，均
为常规方法。
实施例1、转STTM-miR482a番茄的获得及功能鉴定。
一、过表达pBI-STTM-miR482a载体的构建
1、含有STTM-miR482a的载体pUC19-STTM-miR482a
在番茄miR482a成熟体反义互补序列的第12与13个核苷酸之间插入CTA三个核苷
酸，得到Mimic序列，然后在两个相同的该序列(Tandem Mimics)之间加入48nt接头序列
(GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT)，在基因两端分别添加BamH I和
Sac I酶切位点与保护碱基后最终得到如序列表1所示的STTM-miR482a核苷酸序列。STTM-
miR482a核苷酸序列经北京六合华大基因公司合成后连接于pUC19载体上，经过测序，该质
粒上的STTM-miR482a为序列表中序列1(SEQ ID NO.1)，将测序正确的质粒命名为pUC19-
STTM-miR482a。
2、pBI-STTM-miR482a的构建
取步骤1合成的pUC19-STTM-miR482a质粒溶液2ul作为模板，在STTM-miR482a序列
上游和下游分别延长391nt和253nt，以5’端引物P1和3’端引物P2，进行PCR扩增，PCR反应条
件为：先94℃5分钟；再94℃30秒，66℃30秒，72℃1分钟，共35个循环，最后72℃7分钟。反应
结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果显示得到的长度约为750bp的扩
增片段，与预期结果相符。P1和P2引物序列如下：
P1：GCGTTTCGGTGATGACGGTGA
P2：TCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
将上述PCR产物用SacⅠ和BamHⅠ限制性内切酶酶切，酶切体系为：PCR产物10ul、10
×酶切缓冲液1ul、SacⅠ1ul(10U/ul)、BamHⅠ1ul(10U/ul)、加ddH2O补充反应体系至20ul，37
℃酶切7小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收108bp线性化的STTM-miR482a
小片段，溶于30ul ddH2O中。
用限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ对质粒pBI121进行双酶切，酶切体系为：质粒10ul、
10×酶切缓冲液1ul、SacⅠ1ul(10U/u l)、BamHⅠ1ul(10U/ul)、加ddH2O补充反应体系至
20ul，37℃酶切7小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，然后用大连宝生物公司的
DNA凝胶回收试剂盒回收12874bp的pBI121大片段，溶于30ul ddH2O中。
将9u l回收的108bp的STTM-miR482a溶液、3ul回收的12874bp的pBI121大片段、
1ul(350U/ul)T4DNA连接酶、2ul 10×连接缓冲液、加ddH2O补充反应体系至20ul，16℃连接
12小时，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经卡那霉素抗性平板筛选得到阳
性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，结果该重组质粒为将序列表中的序列
1插入pBI121的SacⅠ和BamHⅠ酶切位点间得到的载体，命名为pBI-STTM-miR482a，且pBI-
STTM-miR482a中启动子、基因和终止子的结构正确(见图1)。在该表达载体中采用35s启动
子启动目的片段STTM-miR482a在植物中过表达。
二、转基因番茄的获得
1、农杆菌转化获得转基因番茄
将上述重组表达载体pBI-STTM-miR482a转入农杆菌GV3101中，得到重组菌，提取
该重组菌的质粒送北京六合华大基因公司测序，该质粒为pBI121-STTM-miR482a，将含有该
质粒的重组菌命名为GV3101/pBI121-STTM-miR482a。
将重组菌GV3101/pBI121-STTM-miR482a通过农杆菌侵染的叶盘法转化早粉2号番
茄，得到的愈伤组织置于卡那霉素抗性的培养基上筛选，得到T0代转STTM-miR482a番茄。
2、PCR鉴定
提取T0代STTM-miR482a番茄的基因组DNA，然后用35S启动子的特异性引物P3和
STTM-miR482a的特异性引物P4，进行STTM-miR482a转基因植物的PCR鉴定。P3和P4引物序列
如下：
P3：GACGCACAATCCCACTATCC
P4：ATGGGTGCTAGAATTGGAAAGAGCTCG
特异性引物P3和P4扩增T0代转STTM-miR482a番茄植株，得到197bp的为阳性T0代
转STTM-miR482a番茄植株
三、转STTM-miR482a番茄功能鉴定
1、实时定量检测miR482a的表达量
分别提取阳性T0代转STTM-miR482a番茄1(ST-1)、阳性T0代转STTM-miR482a番茄2
(ST-4)和野生型番茄(WT)幼苗的RNA，反转录得到cDNA。
使用miRNA检测试剂盒(购自北京TransGen生物技术有限公司)，使用miR482a特异
性引物miR482a(UUUCCAAUUCCACCCAUUCCUA)与试剂盒里的通用引物按照试剂盒的方法检测
miR482a的表达量。每个株系6株，实验重复3次，结果取平均值。
结果如图2所示，与WT相比ST-1、ST-4的植株中miR482a的表达量有了不同程度的
下调，说明目的基因(STTM-miR482a)已经成功抑制了miR482a的表达。
2、抗病性检测
将获得的阳性T0代转STTM-miR482a番茄1(ST-1)、阳性T0代转STTM-miR482a番茄2
(ST-4)和野生型番茄(WT)在生根培养基中快繁。长至10cm左右时，打开培养瓶封口膜，炼苗
5-7天，然后将小苗移入人工气候箱。
离体叶片接种：取长势一致，完全展开的健康叶片，用无菌水冲洗干净后置于培养
皿中湿润的无菌滤纸上；取20ul浓度为106个孢子/mL的致病疫霉孢子悬浮液均匀喷洒叶
片，然后用透明保鲜膜覆盖培养皿保湿，20℃黑暗条件培养24h，置于20℃下16/8h光周期的
人工气候箱中培养，，一周后观察发病情况。每个株系取10片叶片，实验重复3次。
活体接种法：整株接种时采用喷雾法，将浓度为1×106个孢子/mL的致病疫霉菌孢
子悬浮液均匀喷洒到植株每一片叶的表面和茎部至滴水为止。喷洒后将植株用透明袋子罩
住保湿，20±2℃黑暗条件下培养24h，置于20℃下16/8h光周期的人工气候箱中培养，，一周
后观察发病情况。每个株系取10株，实验重复3次。
结果如图3所示(从左到右株系分别为WT、ST-1、ST-4)，致病疫霉菌处理番茄离体
叶片一周后，与WT组叶片相比，转基因番茄叶片上病斑数明显较少；如图4所示，致病疫霉菌
处理番茄植株一周后，与WT植株相比，转基因番茄植株的发病情况明显较轻。以上结果说
明，转STTM-miR482a番茄植株对晚疫病具有明显的抗性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其
发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连理工大学
<120> 一种DNA分子STTM-miR482a及其应用
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgggatccta ggaatgggtg ctagaattgg aaagttgttg ttgttatggt ctaatttaaa 60
tatggtctaa agaagaagaa ttaggaatgg gtgctagaat tggaaagagc tcg 113
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
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