一种丝氨酸蛋白酶抑制剂重组分子、其制备方法及应用技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组分子，一种丝氨酸蛋白酶抑制剂重
组分子、其制备方法及应用。
背景技术
Xa因子(fXa)是一种丝氨酸蛋白酶，在内源性凝血途径和外源性凝血途径的交汇
处发挥作用，激活凝血素变为凝血酶。凝血酶依次激活血小板并将可溶的血浆纤维蛋白原
转化为不溶的血栓纤维蛋白基质。然而，在钙离子存在的情况下Xa因子在凝血瀑布中的功
能需要在复杂的辅助因子、Va因子和磷酸酯膜等的帮助下发挥。Xa因子在血液凝固中的核
心作用表明Xa因子抑制剂可能具有抗凝剂的治疗功效。
从软蜱虫(非洲钝缘蜱)提取物中分离纯化得到一种小分子丝氨酸蛋白酶抑制剂
TAP，这个多肽是一种针对Xa因子的缓慢、紧密结合的抑制剂。此氨基酸序列(60个残基)与
Kunitz型抑制剂具有有限的同源性。然而，与此类其它抑制剂不同，TAP仅抑制Xa因子。TAP
的专一性及分子大小表明它具有作为抗凝剂的治疗价值。
“Mao SS,Huang J,Welebob C,et al.Identification and characterization
of variants of tick anticoagμlant peptide with increased inhibitory potency
toward human factor Xa.Biochemistry 1995,18,34(15):5098-5103.“中的Mao等将TAP
的第一位酪氨酸残基替换为色氨酸，把第十位天冬氨酸替换为精氨酸，产生rTAP(Y1W/
D10R)的双重突变体，结果rTAP(Y1W/D10R)双重突变体的抗Xa的活性增加了37倍。“水蛭素
衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达。上海医科大学学报，1996，23(3)：181-184”中
罗春贞等在合成水蛭素基因时将RGD编码顺序融合在水蛭基因中，构建了水蛭素衍生物并
在大肠杆菌中实现表达，表达产物证明有抗血液凝固活性。
可见，天然Xa因子抑制剂如蜱虫和线虫抗凝肽最初分别从非洲钝缘蜱(TAP)和犬
钩虫(AcAP，NAP)中分离而来，它们对血小板聚集的均有抑制作用，但并没有双重功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丝氨酸蛋白酶抑制剂重组分子、其制备方法及应用，
所述丝氨酸蛋白酶抑制剂重组分子即可以抗Xa又可以抗血小板凝聚，具有双功能活性，将
具有广泛的应用前景。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂重组分子，其特征在于，所述重
组分子的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
所述氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1：
YNRLCIKPRDWIDECDTPRGDMPGPGGCDSFWICPEDHTGADYYSSYRDCFNACI；
SEQ ID NO.2：
YNRLCIKPRDWIDECKRIPRGDMPGPYPGGCDSFWICPEDHTGADYYSSYRDCFNACI；
SEQ ID NO.3：
YNRLCIKPRDWIDECDATPRGDMPGPGGCDSFWICPEDHTGADYYSSYRDCFNACI；
SEQ ID NO.4：
YNRLCIKPRDWIDECYPGPFTPRGDMPGPYPGPGGCDSFWICPEDHTGADYYSSYRDCFNACI。
优选地，所述重组分子的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种DNA片段，其包含编码如第一方面所述多肽的核苷酸序
列。
第三方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体含有至少一个拷贝的如第二
方面所述的DNA片段。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有如第三方面所述的表达
载体。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂重组分子的制
备方法，包括如下步骤：
(1)合成野生型的TAP基因；
(2)根据已知TAP序列设计引物，以步骤(1)得到的野生型TAP基因为模板扩增所述
基因片段；
(3)将步骤(2)扩增得到的基因片段连接到pGEX-3X载体中，构建重组质粒；
(4)将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。
优选地，所述引物SEQ ID NO.5-6所示的核苷酸序列。
所述核苷酸序列如下：
上游引物(SEQ ID NO.5)：5’-gggatccttgtcccgcgttacaaccgtctt-3’；
下游引物(SEQ ID NO.6)：5’-tcatcacgagaattctcagatgcaagc-3’。
优选地，所述引物中包含要插入的RGD序列。
第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的DNA片段，
如第三方面所述的重组载体或如第四方面所述的重组细胞在抗Xa因子和抗血小板聚集的
药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过将RGD插入到天然的TAP序列中，本发明抑制剂有很好的抑制活性，
抑制剂作用后血小板浓度只有3±0.4μM，Xa因子的浓度为0.252nM；
(2)本发明的重组分子包含RGD结构域的重组TAP是以天然蛋白为基础的抑制剂，
能够用来开发抗Xa因子和抗血小板聚集的药物。
附图说明
图1为本发明TAP氨基酸序列图；
图2为本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂三维结构图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明
了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂重组分子的制备
1)重组载体的构建
(1)合成野生型的TAP基因；
(2)根据已知的TAP基因设计引物：
上游引物(SEQ ID NO.5)：5’-gggatccttgtcccgcgttacaaccgtctt-3’；
下游引物(SEQ ID NO.6)：5’-tcatcacgagaattctcagatgcaagc-3’；
以步骤(1)得到的野生型TAP基因为模板，进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系如下：
反应条件如下：
所获得PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，得到
的丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因，将得到的基因连接到pGEX-3X载体中。
(3)将重组载体转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序验证。
2)重组蛋白的表达
(1)提取序列正确的重组表达载体质粒，转化到表达菌BL21(DE3)大肠杆菌中，得
到含有所述丝氨酸蛋白酶抑制剂基因序列的阳性表达菌；
具体地，本发明使用构建好的重组载体和空载体转化表达宿主菌，并筛选阳性克
隆，测序确认表达框的正确性。挑选单克隆，接种于50mL 2×YT/氨苄液体培养基中，37℃震
荡摇床中培养12-16小时，然后以1：100的比例接种200mL2×YT/氨苄液体培养基中，37℃培
养至OD＝0.5-0.7后加入IPTG，使终浓度达到0.1mM，继续30℃培养4小时。4℃，4000rpm，离
心15分钟，收集菌体，超声波破碎，再用HPLC纯化可得丝氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白，其氨基
酸如图1所示，其三维结构如图2所示。
实验例2 血小板聚集验证
(1)从健康人群获取柠檬酸盐人血，通过200g离心15min获得富血小板血浆(PRP)；
(2)本发明制备的抑制剂(SEQ ID NO.1-4)、曼巴蛇蛇毒蛋白中的RGD、天然TAP、
Hirudisin、GRGDS中的RGD和RGDS中的RGD与PRP在37℃共孵育30s，再加入引发剂ADP来激活
血小板。
(3)血小板聚集活性用Payton双通道血小板凝聚计连接到一个图形记录器上，通
过光透射的增加来检测得到，加入10μM ADP温育，并用磁力搅拌器持续搅拌，结果如表1所
示。
实验例3 Xa因子酰胺水解活性抑制的验证
将浓度为2.1nM的Xa因子在37℃预先孵育15min，分别在无(对照组)或有抑制剂的
情况下，即加入本发明制备的抑制剂(SEQ ID NO.1-4)、曼巴蛇中的RGD、天然TAP、
Hirudisin、GRGDS中的RGD和RGDS中的RGD，加20mM Tris-HCl调pH值为8.0，添加5μL 8mM S-
2765(终浓度为0.2mM)总量达到195μL，置于96孔板37℃进行显色分析。Xa因子产生的pNA量
可通过酶标仪在405nm处检测获得，结果如表1所示。
表1
注：水蛭素是一种由欧洲医蛭(医用水蛭)分泌的有效凝血酶抑制剂。Hirudisin是
经改造获得的产物，即在水蛭素的指状末端结构(残基32-35)用“精氨酸-甘氨酸-天冬氨
酸-丝氨酸”(RGDS)替换“丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸”序列。
从表1可以看出，本发明制备的丝氨酸蛋白抑制剂不仅具有血小板聚集的功能，还
具有抗Xa因子的功能，抑制效果明显好于对照组，SEQ ID NO.1所示的抑制剂作用后，血小
板抗性IC50只有3±0.4μM，Xa因子抗性IC50的浓度为0.252nM，效果显著。
实验例4 凝血酶凝血时间分析
分装5管100μL血浆置于分析器上孵育4min，向4管血浆中添加100μL凝血酶和100μ
L本发明制备的的抑制剂(SEQ ID NO.1-4)，对照管中只添加100μL凝血酶，记录稳定血栓形
成所需的时间，结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，加入本发明制备的抑制剂显著抑制了凝血酶活性，尤其SEQ ID
NO.1抑制效果最为明显。
综上所述，RGD本身可以抑制血小板聚集，但不具备Xa因子抗性功能，TAP是一种Xa
抑制剂间接抑制了凝血酶活性，可用于开发抗血栓药物，本发明的重组分子包含RGD结构域
的重组TAP是以天然蛋白为基础的抑制剂，能够用来开发抗Xa因子和抗血小板聚集的药物。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局
限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的
技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的
添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省华隆生物技术有限公司
<120> 一种丝氨酸蛋白酶抑制剂重组分子、其制备方法及应用
<130> 2016
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 1
Tyr Asn Arg Leu Cys Ile Lys Pro Arg Asp Trp Ile Asp Glu Cys Asp
1 5 10 15
Thr Pro Arg Gly Asp Met Pro Gly Pro Gly Gly Cys Asp Ser Phe Trp
20 25 30
Ile Cys Pro Glu Asp His Thr Gly Ala Asp Tyr Tyr Ser Ser Tyr Arg
35 40 45
Asp Cys Phe Asn Ala Cys Ile
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 2
Tyr Asn Arg Leu Cys Ile Lys Pro Arg Asp Trp Ile Asp Glu Cys Lys
1 5 10 15
Arg Ile Pro Arg Gly Asp Met Pro Gly Pro Tyr Pro Gly Gly Cys Asp
20 25 30
Ser Phe Trp Ile Cys Pro Glu Asp His Thr Gly Ala Asp Tyr Tyr Ser
35 40 45
Ser Tyr Arg Asp Cys Phe Asn Ala Cys Ile
50 55
<210> 3
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 3
Tyr Asn Arg Leu Cys Ile Lys Pro Arg Asp Trp Ile Asp Glu Cys Asp
1 5 10 15
Ala Thr Pro Arg Gly Asp Met Pro Gly Pro Gly Gly Cys Asp Ser Phe
20 25 30
Trp Ile Cys Pro Glu Asp His Thr Gly Ala Asp Tyr Tyr Ser Ser Tyr
35 40 45
Arg Asp Cys Phe Asn Ala Cys Ile
50 55
<210> 4
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 4
Tyr Asn Arg Leu Cys Ile Lys Pro Arg Asp Trp Ile Asp Glu Cys Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Pro Phe Thr Pro Arg Gly Asp Met Pro Gly Pro Tyr Pro Gly
20 25 30
Pro Gly Gly Cys Asp Ser Phe Trp Ile Cys Pro Glu Asp His Thr Gly
35 40 45
Ala Asp Tyr Tyr Ser Ser Tyr Arg Asp Cys Phe Asn Ala Cys Ile
50 55 60
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
gggatccttg tcccgcgtta caaccgtctt 30
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
tcatcacgag aattctcaga tgcaagc 27