一种富硒灰树花硒多糖及其制备方法和应用技术领域
本发明涉及一种富硒灰树花硒多糖及其制备方法和其作为抗氧化剂和人体补硒
食品的应用，属于保健食品技术领域。
背景技术
灰树花(Grifola frondosa)为担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，树花属，
又名奇果菌、贝叶多孔菌、千佛菌、莲花菌等，是一种珍稀的药食两用真菌，其子实体肉质，
柄短且呈珊瑚状，外观形似菊，气味清香四溢，肉质脆嫩可口。灰树花在我国浙江、河北、福
建、四川等地均有栽培，其营养价值极其丰富，富含大量蛋白、多糖、脂肪、粗纤维及多种有
益矿物质、微生物等。研究发现多糖作为其主要生物活性物质，具有抗肿瘤、调节免疫、抗病
毒及降血糖等活性(谢文佳，黄小玲.灰树花多糖的生物活性与研究进展.食用菌，2010，32
(5):1-3.)。中国专利于2012年4月11号公开了“一种灰树花多糖ZZK组分及其制备方法”，从
灰树花子实体中分离得到一种β葡甘聚糖(ZZK)，具有显著的抗肿瘤活性。中国专利于2014
年4月16号公开了“灰树花多糖F2的制备方法及其降血糖功能”，以灰树花子实体为原料，分
离获得一种新型灰树花多糖F2，为β吡喃糖环杂多糖且含有糖醛酸。同时，能够通过胰岛素
抵抗治疗2型糖尿病。樊懿娜等采用单一酶及复合酶法从灰树花子实体中分离纯化多糖，进
行抗氧化活性比较，所得纯化组分均不含有糖醛酸，复合酶解多糖具有较高的抗氧化活性
且与其较低的分子量相关(樊懿娜.酶法修饰灰树花多糖的分离纯化、结构表征及其抗氧化
活性研究[D].江苏大学，2011)。
硒元素是人体必需的微量元素之一，具有提高机体免疫力、清除体内自由基、解
毒、防止心脑血管疾病、糖尿病等多种生理活性。中国营养学会推荐成人日硒摄入量为60～
250μg。人体硒来源主要依靠膳食的摄入，但我国2/3地区的硒摄入量低于最低推荐值，缺硒
常引起人体代谢障碍，易引发疾病。硒主要分为无机硒和有机硒两大类，无机硒吸收效果差
且毒性较大，其毒性和生理活性的剂量大致相当，使用不当极易引起硒中毒，因而极大的限
制了它的应用；而有机硒吸收效果好且毒性较低，有资料显示无机硒的毒性是有机硒的
2.94倍，更适合补硒的要求。所以，很多研究着眼于研制各种有机硒化合物，目前已研究出
富硒酵母、螺旋藻、黑木耳、富硒茶、硒化卡拉胶等。食用菌作为富集微量元素硒的良好载
体，能够通过富集硒以提高食用菌原料的营养及功效价值；同时，食用菌富硒可以将无机硒
转化为毒性较低、功能更强的有机硒化合物，使得富硒食用菌原料更适合用作为保健食品
的原料，但由于考虑作为保健食品原料，食用菌富硒时硒的添加应该有严格的剂量限制。中
国专利于2011年11月16号公开了“一种富硒葛根多糖的制备方法及其应用”，通过叶面施硒
的方式对葛根进行富硒获得富硒葛根，从中提取得到富硒葛根多糖。中国专利于2012年12
月12号公开了“一种灰树花多糖硒复合物的生产方法”，诱变筛选新的灰树花菌株，通过发
酵生产灰树花多糖硒复合物。中国专利于2015年4月22号公开了“一种富硒灰树花栽培方
法”，利用杀活酶解后的活性富硒酵母菌为硒源，获得富硒灰树花食用菌。中国专利于2016
年5月11号公开了“标量富硒灰树花工厂化生产技术”，利用研制的硒粉制成标量灰树花基
质专用水，生产制作灰树花菌包，用常规工厂化技术生产标量富硒灰树花子实体。中国专利
于2016年7月13号公开了“一种生产富硒灰树花菌丝的方法”，采用液态培养灰树花诱变新
菌株生产富硒灰树花菌丝原料。本发明人采用菌面喷硒的方式对灰树花进行富硒，得到富
硒灰树花子实体，然后提取得到一种新的富硒灰树花硒多糖，鉴定其结构特征，并研究了富
硒灰树花硒多糖的抗氧化活性。有关该硒多糖组分及其抗氧化活性研究至今未见国内外文
献报道，也未见相应专利公开。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述背景技术存在的不足，提供一种富硒灰树花硒多糖
的制备方法及其作为抗氧化剂和人体补硒食品等的应用。
本发明采用如下技术方案：一种富硒灰树花硒多糖，其硒含量为8.37μg/g；分子量
为4.13×106Da；单糖组成为：甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为3.3:23.3:1；该硒多糖同
时具有α-糖苷键和β-糖苷键；该硒多糖呈不规则纤维网状结构，有片状和碎屑状聚集；在水
溶液中排列紧凑，呈不对称形貌，分子间相互缠绕，分子链厚度为0.5～7.4nm；富硒灰树花
硒多糖一级结构的重复单元为：
上述富硒灰树花硒多糖的制备方法，按照下述步骤进行：
一、富硒灰树花的栽培：
(1)配制培养基：原料由下述成分按重量份配比制成：
棉子壳34％，杂木屑34％，麸皮10％，玉米粉10％，山表土10％，石膏粉l％，红糖
1％，料水比1:1.1～1.2，pH值自然。
(2)装袋；
(3)灭菌：采用常压灶灭菌，将料温升至95℃，并保持40h；
(4)接种：待袋温冷却至30℃以下时，开始接种，在无菌条件下将灰树花菌种分成
菌块后迅速接种；
(5)发菌：接种后的菌棒置于遮光处，控制室温20～24℃，按“#”字形堆放培养，注
意通风换气，使其发菌完全；
(6)刺孔：充分发菌40天后，在菌棒中央位置进行刺孔，约7天后开始浇水，控制室
温24℃，湿度80％，其间弱光照射2h；
(7)出菇培养：将出菇的菌棒搬至有外遮阳设施的大棚管理，控制温度18～23℃，
湿度70～80％，保持通风；
(8)富硒栽培：对已开始分化的灰树花进行富硒培养，菌面喷施，均匀喷洒亚硒酸
钠(5.5mg/菌棒/天)，共10天，富硒结束后继续喷施水至成熟采收；
(9)采收：将采收的新鲜成熟富硒灰树花于60℃真空干燥，用超微粉碎机粉碎，过
200目筛，存于干燥器中备用。
二、富硒灰树花粗硒多糖的制备：
称取富硒灰树花干粉以料液比1:30(g/mL)加入蒸馏水进行水提，于100℃水提3h，
提取3次，提取液合并经过减压浓缩后，用三氯乙酸除蛋白，加入80％乙醇醇沉，离心后，上
清液经截留分子量为3500Da的透析袋透析72h、真空干燥3h，制得富硒灰树花粗硒多糖。
三、纯化：
将步骤(2)得到的富硒灰树花粗硒多糖溶解于0.05mol/L的NaCl溶液中，离心除去
不溶物，然后缓慢滴加至DEAE-52层析柱中，并采用0～0.2mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，
绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，得到富硒灰树花硒多糖不同组分，选取
0.05mol/L NaCl的洗脱组分合并，经浓缩、透析后，上Sephacryl S-400葡聚糖凝胶柱，用
1.5mol/L的NaCl溶液洗脱，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，经浓缩、透析、真空干燥后，
得到富硒灰树花硒多糖。
进一步的，所述步骤(二)中富硒灰树花粗硒多糖的得率为7.6％，多糖含量为
68.4％。
进一步的，所述步骤(三)中，富硒灰树花粗硒多糖在10mL NaCl溶液中经震荡加热
溶解，震荡频率为150次/分、温度为55℃的震荡恒温水浴中充分溶解10h，溶解液经4500r/
min离心10min。
进一步的，所述步骤(三)中，DEAE-52柱分离和Sephacryl S-400柱分离组分流水
透析42h、蒸馏水透析30h后，减压浓缩，于温度21℃、真空度为-0.09MPa的真空干燥箱内干
燥3h。
进一步的，所述富硒灰树花硒多糖能够作为抗氧化剂和补硒食品用于功能食品和
食品添加剂中。
本发明的优点在于：采用本发明的方法可以生产获得富硒灰树花子实体，操作简
单，成本低廉，效果较好；以富硒灰树花子实体为原料可生产获得一种新的富硒灰树花硒多
糖，其中的有机硒含量是普通灰树花多糖中有机硒含量的60倍多；富硒灰树花硒多糖的抗
氧化活性显著提高。因此本发明的富硒灰树花硒多糖除保留普通灰树花多糖的药用及保健
作用外，既可以作为抗氧化剂功能食品，又可以作为人体补硒食品。
附图说明
图1为灰树花多糖的IR谱图；
图2为富硒灰树花硒多糖的IR谱图；
图3为富硒灰树花硒多糖的1H NMR谱图；
图4为富硒灰树花硒多糖的13C NMR谱图；
图5为富硒灰树花硒多糖清除DPPH自由基的能力；
图6为富硒灰树花硒多糖清除ABTS自由基的能力；
图7为富硒灰树花硒多糖螯合Fe2+的能力。
具体实施方式
富硒灰树花的栽培
实施例1：
(1)配制培养基：原料由下述成分按重量份配比制成：
棉子壳34％，杂木屑34％，麸皮10％，玉米粉10％，山表土10％，石膏粉l％，红糖
1％，料水比1:1.1～1.2，pH值自然。
(2)装袋；
(3)灭菌：采用常压灶灭菌，将料温升至95℃，并保持40h；
(4)接种：待袋温冷却至30℃以下时，开始接种，在无菌条件下将灰树花菌种分成
菌块后迅速接种；
(5)发菌：接种后的菌棒置于遮光处，控制室温20～24℃，按“#”字形堆放培养，注
意通风换气，使其发菌完全；
(6)刺孔：充分发菌40天后，在菌棒中央位置进行刺孔，约7天后开始浇水，控制室
温24℃，湿度80％，其间弱光照射2h；
(7)出菇培养：将出菇的菌棒搬至有外遮阳设施的大棚管理，控制温度18～23℃，
湿度70～80％，保持通风；
(8)富硒栽培：对已开始分化的灰树花进行富硒培养，菌面喷施，均匀喷洒亚硒酸
钠(5.5mg/菌棒/天)，共10天，富硒结束后继续喷施水至成熟采收；
(9)采收：将采收的新鲜成熟富硒灰树花于60℃真空干燥，用超微粉碎机粉碎，过
200目筛，存于干燥器中备用。
富硒灰树花粗硒多糖的制备
实施例2：
称取富硒灰树花干粉以料液比1:30(g/mL)加入蒸馏水进行水提，于100℃水提3h，
提取3次，提取液合并经过减压浓缩后，用三氯乙酸除蛋白，加入80％乙醇反复醇沉4次，离
心后，上清液经截留分子量为3500Da的透析袋透析72h、真空干燥3h，制得富硒灰树花粗硒
多糖(Se-GFP)，多糖得率为7.6％，多糖含量为68.4％。
富硒灰树花粗硒多糖的纯化及结构特征
实施例3：
称取富硒灰树花粗硒多糖0.4g，溶于10mL0.05mol/L NaCl溶液中，于震荡频率为
150次/分、温度为55℃的震荡恒温水浴中充分溶解10h，溶解液经4500r/min离心10min。除
去不溶物后，上清液通过DEAE-52离子交换柱(2.0×50cm)进行分离，0～0.2mol/L的NaCl溶
液进行洗脱，用DHL-A恒流泵，控制流速1mL/min，用自动分部收集器逐管收集洗脱液，每管
收集5mL。收集液用苯酚-硫酸法逐管跟踪检测，以蒸馏水为空白，于490nm波长处测定吸光
度，直到不再有糖检出。根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，其中0.05mol/L NaCl的洗脱液
经减压浓缩，截留分子量为3500Da的透析袋流水透析42h、蒸馏水透析30h后，减压浓缩，于
温度21℃、真空度为-0.09MPa的真空干燥箱内干燥3h，上述步骤所得多糖组分上Sephacryl
S-400葡聚糖凝胶柱，用1.5mol/L的NaCl溶液洗脱，控制恒流泵流速为0.3mL/min，用自动分
部收集器逐管收集洗脱液，每管收集3mL。收集液用苯酚-硫酸法逐管跟踪检测，绘制洗脱曲
线收取合并洗脱液，用截留分子量为3500Da的透析袋流水透析42h、蒸馏水透析30h后，减压
浓缩，于温度21℃、真空度为-0.09MPa的真空干燥箱内干燥3h，得到富硒灰树花硒多糖组分
(Se-GFP-22)，氢化物原子荧光法测得富硒灰树花多糖经湿法消解硒含量为8.37μg/g。
取实施例3制备得到富硒灰树花硒多糖组分(Se-GFP-22)。
分子量的测定：采用高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光光散射-示差折光检测仪
联用分析法(HPSEC-MALLS-RI)对多糖相对分子质量进行测定。色谱柱为TSK-GEL系列
G6000PWXL和G4000PWXL串联色谱柱(7.8mm×30cm i.d.,TOSOH，日本)，流动相为0.05mol/L
NaH2PO4和0.15mol/L NaNO3(pH＝7)，流速为0.5mL/min，柱温为35℃。Se-GFP-22样品溶液浓
度为5mg/mL，经12000r/min离心10min后取上清液过0.22μm滤膜过滤后，取100μL进样分析。
多糖溶液的示差折光指数增量(dn/dc)为0.1460mL/g。Se-GFP-22分子量为4.13×106Da，多
分散指数(PD)为1.211。
单糖组成分析：精密称取多糖样品5mg于安瓿瓶中，用2mol/L的硫酸溶液溶解，封
口，100℃烘箱中加热水解8h后，水解液加碳酸钡中和至中性，以4000r/min离心除去BaSO4
沉淀，上清液冷冻干燥。水解产物经乙酰化后用岛津GC 2010气相色谱系统分析。Se-GFP-22
由甘露糖、葡萄糖和半乳糖三种单糖组成，其摩尔比为3.3:23.3:1，而现有专利
(201310733480.8)中，灰树花多糖F2由核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖六种
单糖组成；专利(201110398991.X)中，灰树花多糖ZZK由甘露糖和葡萄糖两种单糖组成。
红外测定：取1mg经干燥的多糖样品，与100～200mg经干燥的KBr粉末在玛瑙研钵
中轻轻研磨均匀在红外灯下操作。经压片机压成薄片后，采用NEXUS 670智能型傅立叶红外
光谱仪扫描4000～400cm-1波长段获得红外光谱图。Se-GFP-22在667.9cm-1处为Se-O-C对称
伸缩振动吸收峰，759.9cm-1处为Se＝O伸缩振动吸收峰，1024.5cm-1处为O-Se-O不对称伸缩
振动吸收峰，说明富硒修饰成功；847.3cm-1和891.6cm-1的特征吸收峰表明，Se-GFP-22同时
具有α-糖苷键和β-糖苷键，以α-糖苷键为主；1024.5cm-1、1080.9cm-1和1154.2cm-1的特征吸
收峰表明，Se-GFP-22由吡喃环组成。
甲基化分析：取5mg经干燥的多糖样品，置于10mL反应瓶中，注入DMSO，充入氮气，
密闭，超声2min，使样品充分溶解，加入100mg充分干燥的NaOH粉末，氮气保护下，搅拌至大
部分NaOH溶解。在氮气保护，避光，冰浴的条件下，缓慢加入1mL碘甲烷，室温避光搅拌反应
2h后，加入2mL水反应终止。将反应液用氯仿萃取3次，氯仿层合并，用蒸馏水洗涤数次后，真
空干燥过夜，得到甲基化样品。取少量样品经105℃干燥后进行红外光谱检测，若3200-
3600cm-1处的O-H宽峰消失，说明甲基化完全，否则重复上述过程。将完全甲基化的多糖样品
加入3mL 85％甲酸中，100℃密闭解聚6h后减压抽干，加甲醇再抽干，重复多次。加入3mL
2.5mol/L三氟乙酸100℃密闭水解6h后，反复加甲醇蒸干，以彻底除去三氟乙酸。蒸干后加
25mg硼氢化钠，并加入3mL水充分溶解，室温静置避光还原过夜。加入乙酸至pH 5，至无气泡
产生，减压蒸干，再加甲醇溶解并旋转蒸干，重复多次，以充分除去硼氢化钠。将样品40℃真
空干燥过夜，对水解后的甲基化多糖进行乙酰化后用安捷伦6890N/5975B GC-MS色谱系统
分析。
从Se-GFP-22部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAAs)GC-MS分析结果可以看出，
Se-GFP-22由四种糖残基组成，其中非还原末端T-Glcp残基的峰面积百分比为13.6％；主要
的链内残基为1,4-linked-Glcp，百分比为70.7％；分支糖残基1,3,6-linked-Manp和1,4,
6-linked-Galp分别占到总糖残基的12.1％和3.7％；分支度为29.30％。
核磁分析：取多糖样品150mg，经D2O交换3次后，溶于0.5mL D2O中，用Bruker
Avance 600MHz型核磁共振仪测定1D和2D NMR谱。从1H NMR中可以看出δ4.73的信号提示β-
吡喃环的存在，δ5.46、5.05和5.30的信号提示α-吡喃环的存在，与红外分析分析结果一致；
从13C NMR中可以看出异头碳共振区的化学位移(δ99.50、98.28、95.48和91.59)，说明Se-
GFP-22由四种糖残基组成，与甲基化分析结果一致；另外，低场区δ170～180未见碳信号，表
明其不含糖醛酸，与红外和组成分析结果一致。从1H/1H DQF-COSY，1H/1H NOESY和1H/13C
HSQC的特征信号可以确定各个糖残基1H和13C的化学位移；从1H/13C HMBC的特征信号可以看
出1H和远程13C之间的耦合关系，确定各个糖残基间连接顺序。
综合以上单糖组成、红外、甲基化、1D NMR和2D NMR分析结果，Se-GFP-22中各糖残
基(A,B,C和D)的摩尔比为19.3:3.7:3.3:1。Se-GFP-22的主链结构为1,4-α-D-Glcp，有三个
1,3,6-β-D-Manp和一个1,4,6-α-D-Galp分支单元，支链由1,4-α-D-Glcp和末端残基α-D-
Glcp组成，推测出Se-GFP-22中一级结构的重复单元为：
刚果红分析：取多糖样品5mg，加入2mL蒸馏水和2mL 80μmol/L的刚果红试剂，之后
逐渐加入1mol/L的NaOH溶液，使混合液的浓度从0逐渐提高到0.5mol/L，采用紫外可见光谱
仪扫描400～800nm，测定各碱性梯度下最大吸光值(参比为2mL蒸馏水和2mL 80μmol/L的刚
果红试剂，逐渐加入1mol/L的NaOH溶液，使混合液的浓度从0逐渐提高到0.5mol/L，以NaOH
浓度为横坐标，最大吸收波长为纵坐标绘图。Se-GFP-22与刚果红形成的络合物没有发生红
移现象，推测其为无规线团。
扫描电镜：取一定量的多糖样品粘附在样品盘上，经离子溅射仪喷金后，用JSM-
7001F型场发射扫描电子显微镜进行观测。Se-GFP-22为不规则纤维网状结构，有片状和碎
屑状聚集。
原子力显微镜：配制10μg/mL的多糖样品溶液，过0.45μm纤维素膜并收集滤液，取
10μL滤液使其均匀附着在干净的云母片上，室温下防灰干燥。采用Bruker Multimode 8型
原子力显微镜对样品进行观测。多糖分子在水溶液中排列紧凑，呈不对称形貌，分子间相互
缠绕，多糖链厚度为0.5～7.4nm。
富硒灰树花硒多糖的体外抗氧化活性
1、实验材料
1.1药品与试剂
富硒灰树花硒多糖：配制成生药浓度为2mg/mL的水溶液备用；
DPPH溶液：配制成0.2mmol/L的无水乙醇溶液；
ABTS+溶液：配制成0.2mmol/L的溶液；
磷酸盐缓冲溶液：配制成0.2mmol/L pH7.40的缓冲溶液；
菲洛嗪溶液：配制成5mmol/L的溶液；
氯化亚铁溶液：配制成2mmol/L的溶液；
1.2仪器
TU-1800紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；
BS124S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；
冷冻干燥机FD-1C-50：北京博医康实验仪器有限公司；
旋转蒸发仪RE-52C：巩义市予华仪器有限责任公司。
2、实验方法
2.1富硒灰树花硒多糖清除DPPH自由基作用
分别取2mL不同浓度的样品液于试管中，加入2mL 0.2mmol/L DPPH无水乙醇溶液，
混合均匀，暗处反应30min分钟后于517nm处测定其吸光度(AS)，以蒸馏水代替样品液测得
空白吸光度(A0)，重复三次。清除率按下式计算：
清除率(％)＝(A0-AS)/A0×100％
2.2富硒灰树花硒多糖清除ABTS自由基作用
分别取0.2mL的样品液与3.8mL上述ABTS分析溶液混合，70min后于734nm处测定其
吸光度(AS)。以蒸馏水代替样品液测得空白吸光度(A0)，重复三次。清除率按下式计算：
清除率(％)＝(A0-AS)/A0×100％
2.3富硒灰树花硒多糖螯合螯合Fe2+的能力
分别取4.4mL不同浓度的样品液于试管中，加入0.1mL 2mmol/L FeCl2溶液，混合
均匀，再加入0.4mL 5mmol/L菲啰嗪，彻底混合，室温下反应10min后于562nm处测定其吸光
度(AS)，以蒸馏水代替样品液测得空白吸光度(A0)，重复三次。清除率按下式计算：
清除率(％)＝(A0-AS)/A0×100％
3、实验结果
图5为富硒灰树花硒多糖对DPPH自由基的清除作用，可以看到灰树花多糖富硒前
后对DPPH自由基均有一定的清除作用，且富硒灰树花硒多糖的清除活性优于灰树花多糖。
在浓度为1mg/mL时，Se-GFP-22和GFP-22的清除率分别为45.71％和33.33％。图6为富硒灰
树花硒多糖对ABTS自由基的清除作用，可以看到灰树花多糖富硒前后对ABTS自由基均有一
定的清除作用，且富硒灰树花硒多糖的清除活性优于灰树花多糖。在浓度为2mg/mL时，Se-
GFP-22和GFP-22的清除率分别为58％和45.34％。图7为富硒灰树花硒多糖螯合Fe2+的能力，
可以看到灰树花多糖富硒前后均有一定的螯合Fe2+的能力，且富硒灰树花硒多糖的螯合能
力优于灰树花多糖。在浓度为2mg/mL时，Se-GFP-22和GFP-22的螯合Fe2+能力分别为59.63％
和47.63％。
4、结论
与灰树花多糖相比，富硒灰树花硒多糖对DPPH自由基、ABTS自由基的清除活性和
螯合Fe2+的能力都有显著提高。