粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的高效表达 【技术领域】
本发明涉及青霉素G酰化酶，尤其是粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)基因的重组表达质粒的构建，以及在大肠杆菌中的组成型高表达。
背景技术
青霉素G酰化酶(penicillin G acylase，E.C.3.5.1.11，PGA)能催化青霉素G(PG)脱酰氧生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)和头孢霉素G(重排酸)脱苯乙酸生成7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)。6-APA和7-ADCA是半合成β-内酰胺类抗生素的关键中间体。近50年PGA酶法已取代传统的化学裂解工艺。目前世界上工业生产6-APA和7-ADCA的固定化青霉素G酰化酶主要来自大肠杆菌(Escherichia Coli，Ec)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，Bm)。
早期(1950-1980)研究发现的细菌PGA家族的成员分为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌(Escherichia coli，Ec)，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Kluyvera citrophila，Kc)，雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri，Pr)，假单胞菌属(Pseudomonassp.，Ps)PGA和革兰氏阳性菌，如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，Bm)，粘节杆菌(Arthrobacter viscosus，Av)PGA。革兰氏阴性菌PGA家族的成员——粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis Af)PGA的基因直到1994年(美国专利5695978)才被克隆，同源性比较结果表明它处于PGA进化过程的一个独立分支。与其他来源的PGA比较，AfPGA的酶学性质有如下特点：1、AfPGA对底物具有更高亲和力，对PG Km值比EcPGA和BmPGA低一个数量级。其kcat值也是所有PGA中最高的，表现出很高的活性(Svedas V，et al.Febs Letters，1997.417：414-418)；2、AfPGA是其家族中唯一在一级结构中具有链内二硫键的成员，酶的热稳定性和pH稳定性显著提高(Verhaert RMD，et al.Appliedand Environmental Microbiology，1997.63：3412-3418)；3、而EcPGA识别手性分子的能力较差，AfPGA对苯基取代的手性分子具有较高的选择性(vanLangen LM，et al.Tetrahedron-Asymmetry，2000.11：4593-4600)；4、AfPGA在有机溶剂中表现出很高地稳定性，双水相中，催化抗生素母核氨基和苯乙酰胺缩合时，其催化效率比EcPGA高出一个数量级(van Langen LM，et al.Tetrahedron-Asymmetry，2000.11：4593-4600)。上述性质预示着AfPGA在半合成β-内酰胺类抗生素工业中会有良好的应用前景。
文献报道胞内形成的包涵体会抑制PGA的高表达，而包涵体的形成是由于表达载体为多高拷贝数和含有强启动子，导致蛋白过量表达。为了减少包涵体的形成，周志雄等尝试共表达brp基因或degP基因(Lin WJ，et al.Journalof Chemical Technology and Biotechnology，2001.76：1030-10374，5 Lin YH，et al.Biotechnology Progress，2002.18：1458-146)，提高了EcPGA的表达量。另一方面，如果能适当降低蛋白的表达量，保持蛋白合成流平衡畅通，胞内包涵体会降低，从而提高活性酶的表达。为此，我们构建了中拷贝数、强启动子的重组质粒psmlfpga，该质粒为组成型，转化大肠杆菌后，无需诱导即可表达AfPGA，从而可以简化生产工艺，降低生产成本。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种含有AfPGA基因和信号肽的组成型重组质粒psmlfpga。
本发明的另一个目的在于将重组质粒转化到特定大肠杆菌中成为能组成型高表达AfPGA的基因工程菌。
本发明的又一个目的在于提供上述基因工程菌的发酵培养基的配方。
本发明从petapga(Zhou Z，et al.Acta Biochim Biophys Sin，2003.35：416-422)扩增出包括AfPGA基因及其信号肽的片段，扩增片段与SmaI线性化的质粒psu2718连接后得重组质粒psufpga。用限制性内切酶Hind III、NcoI切psufpga得包括AfPGA基因及其信号肽的片段，同时用Hind III、NcoI切psml104(Li Y，et al.Eur J Biochem，1999.262：713-719)，两片段连接后即得psmlfga。转化质粒psmlfpga到大肠杆菌DH5α中，则得组成型、高表达基因工程菌株DH5α/psmlfpga。
本发明的组成型高表达AfPGA的基因工程菌DH5α/psmlfpga与已报道表达AfPGA的菌株比较，具有以下优点：
1、高表达
Quax等(美国专利5695978)报道将AfPGA基因克隆到大肠杆菌和原宿主菌粪产碱杆菌中，在IPTG或苯乙酸的诱导下，其表达量分别是原宿主菌的17和22倍。Deak等(Deak PM，et al.Biotechnology Letters，2003.25：397-400)将AfPGA基因克隆到一高拷贝数、鼠李糖启动子、Ap抗性的载体上，重组质粒转化大肠杆菌。经鼠李糖的诱导，在摇瓶和5L发酵罐中菌体密度分别达5g干重菌体/L和13.5g干重菌体/L；对应的酶活为700U/L和4500U/L，折算成比酶活，其表达量并不高。周政等(Zhou Z，et al.Acta Biochim Biophys Sin，2003.35：416-422)将AfPGA基因克隆到pet表达系统得petapga，该基因在大肠杆菌JM109/DE3中表达需IPTG诱导，其表达量为150U/L。同时他们还将AfPGA基因克隆到枯草芽孢杆菌中分泌表达，表达不需诱导，AfPGA可直接分泌到发酵液，其表达量可达700U/L。本发明中构建了基因工程菌株DH5α/psmlfpga，在摇瓶培养下，菌体密度达2.5g干重菌体/L，对应的酶活为3500U/L。这是目前报道的最高表达AfPGA的菌株。
2、不需要使用诱导剂
目前，在大肠杆菌中表达AfPGA的菌株均需诱导剂诱导。本发明工程菌株DH5α/psmlfpga无需诱导即可实现AfPGA基因的高表达。降低了成本，简化了培养条件。
3、菌株DH5α/psmlfpga改善了AfPGA蛋白合成流
菌株DH5α/psmlfpga中的重组质粒为中拷贝、强启动子的质粒，该菌株改善了AfPGA蛋白合成流，蛋白电泳显示胞内无蛋白前体的形成。
【附图说明】
图1为重组质粒psmlfpga的构建示意图。
【具体实施方式】
本发明的大肠杆菌DH5α基因工程菌株已于2003年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1023。
实施例1、质粒psmlfpga的构建
设计5’引物5’-GCATCCATGGTGAAAGGGCTGGTTCGT-3’，引入NcoI酶切识别位点，信号肽的原碱基序列ATGCAG......相应地改为ATGGTG......，因而信号肽的第二个氨基酸由Gln变为Val。该5’引物与3’引物5’-CCGGATCCCTAAGGCTGAGGCTGAATC-3’，通过PCR方法从载体petapga(Zhou Z，et al.Acta Biochim Biophys Sin，2003.35：416-422)上扩增得到的AfPGA基因克隆到经SmaI线性化的质粒psu2718(Martinez et al.Gene，1988.68：159-162)，得到质粒psufpga。psufpga以NcoI、Hind III消化，将获得的AfPGA基因连接到NcoI、Hind III消化的载体psml104(Li Y，et al.ProteinExpr Purif，1998.12：233-238)中，得到重组表达质粒psmlfpga。在重组质粒psmlfpga中，AfPGA基因依靠trc启动子、自身表达元件以及rrnb转录终止子而表达，然后依靠其信号肽引导AfPGA分泌到周质空间。该重组质粒的复制子为p15a(中拷贝)，抗性为四环素(Tc)。构建过程见图1。
实施例2、基因工程菌株DH5α/psmlfpga的获得
将表达质粒psmlfpga转化到大肠杆菌DH5α{遗传特征为supE44，△lacU169(Φ80 lacZ△M15)，hssdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1}中，得到转化子DH5α/psmlfpga即为本发明的大肠杆菌DH5α基因工程菌株(菌株保藏号：CGMCC No.1023；保藏日期：2003年10月27日；保藏地：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。
上述转化方法为：取1μl psmlfpga质粒加入100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴20分钟，42℃水浴90秒，冰浴3分钟，加入LB培养基(蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％)900μl，37℃水浴1小时，取50μl涂布含Tc的LB平板(LB培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，平板加1.5％琼脂，Tc 30μg/ml)。
实施实例3、菌株DH5α/psmlfpga在优化的培养条件下表达AfPGA及酶活测定
从含Tc的LB平板(LB培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl1％，平板上加1.5％琼脂)上接DH5α/psmlfpga单菌落在LB液体培养基中，于37℃，250rpm过夜培养。以1∶100接种量接种装液量为50ml的250ml摇瓶，pH 6.0-8.0，25-37℃，250rpm培养20小时。培养基如下：
蛋白胨 7-12g； 酵母膏 3-6g；
糊精/淀粉 20-40g； Na2HPO4·12H2O 0.5-2.5g；
(NH4)2SO4 0.5-1.5g； NH4Cl 0.1-1.3g；
MgSO4 0.3-1.0g； 微量元素溶液 10ml，
定容至1000ml。
其中，微量元素溶液组成如下(g/L)：
MnSO4·H2O 0.05-0.09g/L； CoCl2·6H2O 0.02-0.06g/L；
ZnCl2 0.1-0.3g/L； CuSO4·5H2O 0.05-0.15g/L；
H3BO4 0.03-0.07g/L； FeSO4·7H2O 0.1-0.3g/L；
CaCl2 1-2g/L。
取10μl发酵液，加入500μl磷酸缓冲液(50mM，pH7.5)里，37℃温浴。再加入1ml 37℃预热的1ml 0.9mg/ml 6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)溶液。反应4分钟，取出加入1ml 95％乙醇终止反应。空白对照则不加酶液。反应结束时，发应液以6000×g室温离心2分钟，于405nm测定吸光度。
酶活力定义为：1分钟水解1μmol的6-硝基-3-氨基-苯甲酸所需青霉素酰化酶的量为1单位。
酶活力计算公式为：酶活力(U/L)＝7000×A405
上述培养条件下，经分别测定以糊精和淀粉作为主要碳源的摇瓶中的菌株DH5α/psmlfpga所表达的AfPGA酶的酶活，结果如表1所示：。
表1 含糊精培养基 含淀粉培养基 酶活力(U/L) 2500-3500 2000-3000
可见，本发明的基因工程菌株DH5α/psmlfpga在上述优化的培养条件下表达的AfPGA的酶活可达到2000-3500U/L。