一种以叶片为外植体的红椿再生方法技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以叶片为外植体的红椿再生方
法。
背景技术
红椿(Toona ciliata Roem.)，又名红楝子，隶属楝科(Meliaceae)香椿属
(Toona)。在我国，红椿主要分布在华南、华中、华东及西南地区，天然居群具有零星分布特
点，印度、老挝、缅甸、巴基斯坦、澳大利亚东海岸也有分布。红椿材质好，素有“中国桃花心
木”之称，是优良的家具用材。它具有早期速生性状明显、生长快等特点，生长量均超过一般
人工栽培的常绿阔叶树种，在我国南方地区已成为重点开发利用的优质速生用材树种。由
于环境的变化、天然更新能力较差及过度的采伐破坏，红椿目前已成为濒危树种，是1999年
经国务院批准的国家Ⅱ级重点保护野生植物，并列入《中国主要栽培珍贵树种参考名录》。
红椿材质细密，纹理通直，花纹美丽，芯材呈深红褐色，被广泛应用在家具设计、车船制造及
室内装饰领域；其树形美观，也可以作为行道树栽种。
目前红椿的研究主要侧重于引种、繁育等常规育种。其繁殖方式多采用种子繁殖，
但由于种子的保存能力有限，子代家系并不能完全保存亲代优良的遗传性状，故红椿的扦
插、嫁接及组织培养技术得到越来越多的关注。扦插及嫁接繁殖对红椿的嫩枝要求较高，采
穗圃的构建同样需要大量人力物力。在短时间内，传统的种子繁殖和扦插繁殖不能及时满
足种苗市场需求，此时，可通过组织培养技术解决种苗快速且大量繁殖问题。此外，构建成
熟高效的再生体系是遗传转化成功的基础，并为转入目的基因获得更加优质的红椿品种奠
定基础，有效解决红椿幼树致命虫害等诸多问题，高效推进红椿的定向遗传改良。
国外红椿组织培养技术研究报道较少，主要从成年大树上采集外植体进行离体繁
殖，所获得的腋芽诱导率均较低，且生根培养并不成功。国内红椿组织培养主要以种子及成
年大树带芽茎段作为外植体建立组培体系，但增殖情况并不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种以红椿叶片为外植体的操作更简便、取材更广泛的高效
的红椿再生方法，利用该方法能够在短期内快速获得大量优质的红椿种苗。本发明以红椿
叶片为材料，获得健康的愈伤组织，系统研究红椿的再生体系，旨在解决叶片再生问题，提
高红椿再生能力，为工厂化生产种苗、种质资源保护和基因工程研究提供有效的参考价值。
本发明的以叶片为外植体的红椿再生方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、外植体的获得：将红椿种子去掉双侧翅，在水中浸泡3～5h，经消毒后将种子播
种于固体MS培养基上培养得到无菌苗，切取无菌苗的小叶作为外植体；培养条件为温度25
±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d；
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导愈伤组织，接种时小
叶远轴面朝上；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d；培养至外植体
上分化出芽点时，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相同培养条件下培养诱导不定
芽伸长；
所述的芽诱导培养基：每升含有6-BA 1.8～3.2mg、KT 0.5～1.5mg、NAA 0.03～
0.15mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8～6.0；
所述的芽伸长培养基：每升含有6-BA0.05～0.3mg、NAA 0.1～0.3mg、蔗糖30g和琼
脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8～6.0；
C、生根培养：待不定芽伸长到3～5cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱
导生根，得到生根苗；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d；
所述的生根培养基：每升含有NAA0.1～0.3mg、蔗糖15g和琼脂5g，余量为MS培养
基，pH5.8～6.0；
D、炼苗及移栽：将生根苗炼苗后从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将生根苗在
自来水中浸泡1h，移栽到泥炭土上，进行栽培管理，得到红椿植株。
优选，所述的步骤A的消毒是将红椿种子用体积分数75％乙醇水溶液灭菌1min，无
菌水冲洗1次，质量分数10％次氯酸钠水溶液灭菌15～20min，无菌水冲洗3～5次。
优选，所述的步骤D的炼苗是打开培养瓶盖让生根苗适应2d。
优选，所述的步骤D的泥炭土是高温灭菌过的泥炭土。
所述的步骤A的固体MS培养基：每升含有蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH
5.8～6.0。
所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Murashige T,Skoog
F(1962)A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue
cultures.Physiol Plant 15:473–497。
本发明的以叶片为外植体的红椿高效组织培养和植株再生方法，可摆脱外界条件
的影响，规模化和工厂化生产出健壮、整齐一致的红椿组培幼苗；与已经报道的以红椿大树
茎段作为外植体构建再生体系相比，具有操作方便、取材广泛、可重复性强及效率高等优
势。该方法可满足市场对种苗的需求，为红椿种质资源可持续利用奠定基础。
附图说明
图1为种子培养35d得到的无菌苗，用于切取叶片。
图2为芽诱导培养基上培养30d的小叶外植体上的芽点。
图3为在芽伸长培养基上培养30d伸长的不定芽。
图4为不定芽在生根培养基上培养30d后诱导出的根。
图5为移栽成活的红椿植株。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
A、外植体的获得：将红椿种子去掉双侧翅，在水中浸泡4h；在无菌超净台上，用体
积分数75％乙醇水溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，质量分数10％次氯酸钠水溶液灭菌
18min，无菌水彻底冲洗4次，然后将种子播种于固体MS培养基上培养，培养条件为温度25±
2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养3d左右开始萌芽，35d后，无菌苗(如图1所
示)复叶长出，切取其上的单个小叶作为外植体。所述固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼
脂5g，余量为MS培养基，pH5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导愈伤组织，接种时小
叶远轴面朝上；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。外植体上开始
有愈伤出现，在培养30d后，逐渐分化为芽点(如图2所示)，将长芽的外植体转移到芽伸长培
养基上在相同培养条件下培养诱导不定芽伸长。培养30d后伸长的不定芽如图3所示。所述
的芽诱导培养基：每升含有6-BA 2.5mg、KT 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS
培养基，pH5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养
基：每升含有6-BA0.15mg、NAA 0.2mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH5.8；配制方法
是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。
C、生根培养：待不定芽伸长到4cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导
生根，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。生根培养30d后，不定芽
长出多条根得到生根苗，生根情况如图4所示。所述的生根培养基：每升含有NAA0.2mg、蔗糖
15g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备
用。
D、炼苗及移栽：打开培养瓶盖让生根苗适应2d，然后小心将生根苗从培养瓶中挖
出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡1h，移栽到装在营养杯中的高温灭菌过的
泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。移栽成
活的红椿植株如图5所示。
实施例2
A、外植体的获得：将红椿种子去掉双侧翅，在水中浸泡3h；在无菌超净台上，用体
积分数75％乙醇水溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，质量分数10％次氯酸钠水溶液灭菌
15min，无菌水彻底冲洗3次，然后将种子播种于固体MS培养基上培养，培养条件为温度25±
2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养3d左右开始萌芽，30d后，无菌苗复叶长出，
切取其上的单个小叶作为外植体。所述固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS
培养基，pH5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导愈伤组织，接种时小
叶远轴面朝上；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。外植体上开始
有愈伤出现，在培养25d后，逐渐分化为芽点，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相
同培养条件下培养诱导不定芽伸长。所述的芽诱导培养基：每升含有6-BA 1.8mg、KT
0.5mg、NAA 0.03mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH5.8；配制方法是将上述成份混
合均匀，调pH，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养基：每升含有6-BA0.05mg、NAA 0.1mg、蔗糖
30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备
用。
C、生根培养：待不定芽伸长到3cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导
生根，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。生根培养30d后，不定芽
长出多条根得到生根苗。所述的生根培养基：每升含有NAA0.1mg、蔗糖15g和琼脂5g，余量为
MS培养基，pH5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。
D、炼苗及移栽：打开培养瓶盖让生根苗适应2d，然后小心将生根苗从培养瓶中挖
出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡1h，移栽到装在营养杯中的高温灭菌过的
泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。由此得
到移栽成活的红椿植株。
实施例3
A、外植体的获得：将红椿种子去掉双侧翅，在水中浸泡5h；在无菌超净台上，用体
积分数75％乙醇水溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，质量分数10％次氯酸钠水溶液灭菌
20min，无菌水彻底冲洗5次，然后将种子播种于固体MS培养基上培养，培养条件为温度25±
2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养3d左右开始萌芽，40d后，无菌苗复叶长出，
切取其上的单个小叶作为外植体。所述固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS
培养基，pH6.0；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导愈伤组织，接种时小
叶远轴面朝上；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。外植体上开始
有愈伤出现，在培养35d后，逐渐分化为芽点，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相
同培养条件下培养诱导不定芽伸长。所述的芽诱导培养基：每升含有6-BA 3.2mg、KT
1.5mg、NAA 0.15mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH6.0；配制方法是将上述成份混
合均匀，调pH，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养基：每升含有6-BA 0.3mg、NAA 0.3mg、蔗糖
30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH6.0；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备
用。
C、生根培养：待不定芽伸长到5cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导
生根，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。生根培养30d后，不定芽
长出多条根得到生根苗。所述的生根培养基：每升含有NAA0.3mg、蔗糖15g和琼脂5g，余量为
MS培养基，pH6.0；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。
D、炼苗及移栽：打开培养瓶盖让生根苗适应2d，然后小心将生根苗从培养瓶中挖
出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡1h，移栽到装在营养杯中的高温灭菌过的
泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。由此得
到移栽成活的红椿植株。