一种抗真菌多肽鲎素的遗传工程合成方法 农业生产中的真菌病害危害严重，发病面积广泛，是一种十分难以防治的植物病害。一些真菌病害如水稻稻瘟病、油菜菌核病、马铃薯晚疫病和黄瓜灰霉病等对农作物生产危害极大。在过去的研究中，人们在防治真菌病害方面主要采取了以下几种方法：使用化学农药；利用常规育种技术培育抗病品种；通过遗传工程手段将外源抗病基因导入作物使其具有抗病性状；利用微生物来源的产物防治病害。其中由于微生物制剂对环境和人类安全无毒而受到人们的重视。例如，木霉(Trichoderma sp.)和粘帚霉(Gliocladium sp.)产生的胞外壳多糖水解酶和葡聚糖水解酶可用于防治植物病害。其中有些酶已提纯。从T.harzianum P1菌株培养液中提纯的内-壳多糖酶、壳二糖酶、N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷酶和一种葡糖苷酶，以及从绿粘帚霉(G.virens)41菌株培养液中提纯的内壳多糖酶等，都对真菌孢子萌发、细胞复制和菌丝生长有抑制作用。它们对各种真菌的抑制ED50值在32-200μg/ml之间(Lorito，M.et al.，Molecualr Biotechnology，2：209，1994)。又如，处理水果和蔬菜的新杀真菌剂包括由季也蒙毕赤酵母、汉森德巴利酵母、酿酒酵母、噬油假丝酵母(Candida oleophila)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、胶红酵母(Rhodotorulla mucilaginosa)、盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosprioides)、灰葡萄孢和指状青霉提取的胞外多糖。这种杀真菌剂对植物病原真菌如指状青霉、扩展青霉、意大利青霉、灰葡萄孢、仁果链核盘菌(Monilinia fructicala)和葡枝霉根(Rhizopus stolonifer)有效。此杀真菌剂是天然的，对人或环境无害。这种杀真菌剂含0.01-1.0％多糖、全酵母细胞、稀释辅料及其它杀真菌剂等(Droby S et al.，1995，Derwent BiotAbstr 14：95-07174)。还如，日本专利(平6-133763)报道用枯草芽孢杆菌SD142的培养液或菌体作为杀菌剂。美国EcoScience公司的Stack.J等发现丁香假单孢杆菌的新菌株ATCC55389可用作抑制水果微生物腐败的生物防治剂(WO9515085)。例如用于苹果、柑桔、柠檬、葡萄柚(Derwent BiotechnologyAbstracts，14：71，1995)。美国环保局已经批准马里兰州EcoScience Corp的杀真菌剂Bio-Save 10和11在美国上市，Bio-Save用的是从水果表面分离到的微生物，用于防治收获后的水果病害(Biotechnology News vol15.No9.p10.19954.17)。
在防治作物的真菌病害方面人们常常使用化学农药，但化学农药的使用已经造成了许多问题：(1)生产成本增加生产化学农药需要大量的资金投入，要求的设备复杂、工艺水平先进；(2)加速病菌产生抗药性经多次反复使用化学农药后，自然界中的病菌容易突变产生抗药性，这样人为地给病菌防治造成困难；(3)化学农药施用后在自然界中不易分解，残留的农药造成环境污染地同时还会极大地损害人类的健康；(4)滥用化学农药还会使生态环境遭到破坏、影响生态平衡。同时由于真菌是低等真核生物，其生活史要经历有性世代和无性世代，种类极其复杂而且容易发生变异，因而开发安全有效的新型广谱抗真菌生物制剂显得尤为重要。为此我们在具有高表达能力的生物反应器-酵母中生产这种抗真菌生物制剂，经发酵后上清液可用来制备产品，而酵母经过简单处理可作它用。因此本发明的一个目的是在真核生物中生产新型广谱无公害抗真菌生物制剂。
通过遗传工程手段、利用生物反应器生产无公害的新型生物制剂是目前国际上研究的热点之一，因为它将为绿色农业革命开辟新的途径。到目前为止，我们还未见到利用酵母表达、生产抗真菌生物制剂的报道，但酵母作为一种良好的真核表达系统已经广泛地成功表达出了许多具有生物活性的物质，这里仅举两例。(1)1994年有人在酵母中获得了具有全部生物学活性的、仅对昆虫具有毒杀作用的昆虫特异性神经毒素蛋白。(Martin-Eanclaire，Marie-France，Morten Sogaard，Cayo Ramos，Sandrien Cestelle，Pierre E.Bongis and BirteSvensson Production of active insect-specific scorpion neurotoxin in yeast1994 European Journal of Biochemistry 223(2)：637-645)(2)心钠素是哺乳动物心房组织心肌细胞分泌的一种多肽类激素，具有很强的利钠、利尿和扩张血管、降低血压等作用，可调节体内的水盐平衡，对于治疗高血压、心肾功能不全等疾病具有很重要的作用。有人在酵母中表达分泌了人心钠素。(秦宁，魏楠，姚锡惠，李育阳 人心钠素在酵母细胞中的合成与分泌1991中国科学(B)1：62-66)鲎素(tachyplesin)是在分析海洋生物-鲎(horseshoe crab.Tachypleus ridentatis)中的各种生物活性物质时发现的存在于血淋巴细胞中体积较小、密度较高的颗粒中的一类17氨基酸的多肽，具有抵抗外源病原体入侵的能力。这些生物活性物质包括凝集素、凝血因子、蛋白酶抑制剂及其它一些抗菌肽。鲎素不但可以抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的生长，而且对真菌的生长也具有强烈的抑制作用(Shigenaga，T.et al.，1992，Joumal of BiologicalChemistry，265：21350-21354)。在欧洲专利(Application number：923110993，Publicationnumber：0 545 730 A1)中介绍，从鲎中提取的天然鲎素多肽对几种植物病原真菌都有很强的抑制作用，这些真菌包括：Fusarium graminearum，Aspergillusflavus，Sclerotinia trifoliorum。由于该专利也曾提出可用遗传工程方法合成鲎素的设想，但无具体技术方案。
鲎素由17个氨基酸残基组成，肽链内的第十位的甘氨酸非常保守，而且羧基端具有一个独特的精氨酸-酰胺结构。由于肽链内两个二硫键的存在使得其在低pH值和高温下结构保持稳定。鲎素碱性很强，并且具有三个四肽组成的串联重复结构，即疏水氨基酸-半胱氧酸-疏水氨基酸(芳香族)-精氨酸，这种结构与发夹结构一起决定了此肽的双亲性，而这种双亲性可能与其抗菌活性有关，这个肽的阳离子“尾部”能与细菌脂多糖及膜上的酸性磷酸脂相互作用，而疏水性头部可破坏脂双分子层，这种膜系统的紊乱可能是病原微生物失去活性的主要原因(Nakamura，T.et al.，1988，Journal ofBiological Chemistry，263：16709-16713)。
鲎素的前提结构已经清楚。鲎素前体具有一个23氨基酸残基的presegment，其后为17个氨基酸的成熟肽以及一个酰胺化信号“Gly-Lys-Arg”和34-氨基酸序列，这个presegment有一高度疏水序列，说明它可能作为一个信号肽使鲎素越位到粗面内质网腔上。对34-氨基酸区的功能还不了解，在其序列内部有一由9个氨基酸组成的酸性氨基酸簇，推测此酸性区域可能通过与鲎素阳离子区相互作用来稳定前体构象，使之适于蛋白酶切割而成为成熟蛋白。此酸性区域也可能作为将鲎素转运至血淋巴中小颗粒的信号而发挥功能。鲎素前体经过加工才会成为成熟的蛋白：首先是信号肽的释放；其次，加工酶识别并切割20-21位的Arg-Asn；第三，羧肽酶切割并释放出19一Lys和20-Arg；最后，酶识别前体肽羧基端的Gly残基并催化酰胺键的形成。
目前发现，鲎素家族由五种多肽组成，其氨基酸序列高度保守，如下图所示。它们分别是tachyplesin I、II、III和polyphemusin I、II。TachyplesinI在所有亚洲鲎中都存在，而polyphemusin只在美洲鲎中发现。从它们的结构看，大部分氨基酸替代发生在Arg和Lys之间，说明碱性结构对于其抗菌活性以及与酸性磷酸脂和LPS的相互作用是十分重要的。来源于四种鲎的五种鲎素多肽的氨基酸序列的比较
本发明主要提供一种在真核生物中表达异源抗真菌基因的方法。目前用于遗传工程研究的酵母主要包括两种：即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。酿酒酵母是迄今为止研究得最为深入的真核生物，它不仅具有原核生物生长快便于培养和遗传操作的优点，而且还有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不产生有毒产物，因而被认为是表达外源蛋白特别是真核生物蛋白的最适寄主之一。近些年来，已有许多关于细菌、真菌和高等动植物基因在酿酒酵母中成功克隆和表达的例子，其中有一些重要蛋白已经应用酵母工程菌进行生产，显示出巨大的优越性。但是，随着工作的日益深入，人们发现酿酒酵母作为外源基因的表达寄主并不总是很理想，而毕赤酵母具有比酿酒酵母更明显的优点，即：简便优良的发酵方法和甲醇调节型的启动子。现在，利用毕赤酵母人们已经成功地表达了多种外源蛋白。在本发明中，就利用了毕赤酵母作为生产抗真菌多肽的寄主。
P.pastoris在70年代开始开发用作单细胞蛋白来源。培养基中的盐、微量元素、生物素和碳源价格便宜，而且不含有毒物质和致热原。生化研究表明甲醇代谢需要一系列的酶参与，从表达系统的观点看，最令人感兴趣的是酒精氧化酶(AOX)-甲醇代谢途径中的第一个酶。酵母在以诸如葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养基中生长时是检测不到AOX活性的，但在以甲醇作为碳源时，AOX占细胞内可溶性总蛋白的30％(Couderc，R andBaratti，J，1980，Agric.Biol.Chem.44：2279)。AOX合成受转录水平调节，在表达外源基因时是非常有用的。在AOX启动子的控制下，外源基因在非甲醇碳源条件下处于关闭状态，当加入甲醇时AOX启动子就可以打开。现在利用P.pastoris表达系统人们已经成功地表达了多种具有生物活性的异源蛋白。由于鲎素的氨基酸序列已知，在不改变其氨基酸序列的前提下，我们重新人工设计并合成了鲎素基因，然后将该基因构建到带有α-因子信号肽序列的酵母表达载体上，此载体经转化酵母细胞后，可稳定整合到酵母的染色体上。再经过发酵培养，在信号肽的引导下，鲎素就可以从酵母细胞中分泌到培养基中，这样培养基中就含有目的蛋白产物-鲎素，再经简单的提纯处理即获得产品。
由上述方法合成的鲎素对发生于水稻、小麦、花生、油菜、黄瓜、辣椒等植物体上的真菌病害：稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、菌核病菌、灰霉病菌、黑星病菌等多种真菌的生长具有显著抑制作用。
【附图说明】
图1人工设计的鲎素基因序列及其编码的氨基酸
图2质粒pFZT2的构建
图3克隆在质粒pFZT2上的鲎素基因的序列分析
图4酵母表达载体的构建路线
图5酵母表达载体pEAT2的酶切鉴定
lane1：载体pPIC9不能被NcoI切开
lane2：载体pEBT2可被NcoI切开
lane3：λDNA/HindIII分子量标准
图6酵母表成载体pEAT2的序列分析
图7菌株YPIC27染色体DNA的PCR检测
lanel：YPIC27lane2：载体pEAT2lane3：GS115
lane4：λDNA/EcoRI+HindIII分子量标准
图8菌株YPIC27染色体DNA的Southem blot分析。每个泳道上样量2μgDNA，经BglII过夜酶切。探针由载体pEAT2经BglII酶切分离得到，长度约5.7kb。lane1：野生型GS115染色体与探针杂交后出现三条带，1.7kb和2.4kb分别源于AOX1座位，2.8kb源于his4座位。lane2：重组菌株YPIC27与对照相比多了一条5.7kb杂交条带。
图9酵母中表达的抗真菌鲎素多肽对稻瘟病菌孢子生长的抑制作用
A.正常萌发的孢子
B.酵母分泌的血清白蛋白不能抑制孢子萌发C，D.酵母中表达的鲎素多肽分别抑制B1和D1生理小种孢子的萌发
图10酵母中表达的抗真菌鲎素多肽对黄曲霉菌孢子生长的抑制作用
A.酵母分泌的血清白蛋不能抑制黄曲霉菌孢子萌发
B.酵母中表达的抗真菌鲎素多肽对黄曲霉菌孢子生长具有抑制作用
实施例
例1
1.菌株与载体大肠杆菌转化的受体菌为JM109，购自Promega公司，酵母转化的受体菌为Pichia pastorisGS115/His-，菌株GS115/His+Mut-albumin及质粒pPIC9均由加拿大Alberta大学D.Luo博士惠赠。供试稻瘟病菌生理小种有中国水稻所沈英提供；黄曲霉菌种由中国预防医学科学院食品卫生研究所刘兴阶教授提供。
2.酶与试剂盒所有限制性内切酶及T4DNA连接酶为美国Gibco BRL公司产品，T7DNAsequencing Kit为Pharmacia公司产品，PCR Kit购自华美公司，随机引物标记Kit为Promega产品。
3.主要生化试剂DNA合成试剂及Oligo PAK纯化柱为Milipore公司产品，引物合成在ABI公司的DNA合成仪Cyclone上完成，IPTG，X-gal，低熔点琼脂糖，琼脂糖及SDS为Sigma公司产品；TEMED，过硫酸铵，丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品；同位素购自亚辉公司
4.培养基大肠杆菌完全培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)转化培养基为RDB(18.6％山梨醇，2％葡萄糖，1.34％YeastNitrogen BaseW/O aminoacids，0.00004％生物素，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，2％琼脂糖)；选择培养基MD(1.34％Yeast Nitrogen BaseW/O amino acids，0.00004％生物素，2％葡萄糖，2％琼脂糖)，MM(1.34％Yeast Nitrogen BaseW/O aminoacids，0.00004％生物素，0.5％甲醇(v/v)，2％琼脂糖)；诱导培养基BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％Yeast Nitrogen BaseW/O aminoacids，0.00004％生物素，1％甘油(v/v)，0.1mol/l磷酸缓冲液，pH6.0)，BMMY(以0.5％甲醇代替甘油，其余成分相同)。
例2
本实施例说明合成并克隆鲎素基因的程序。利用生物反应器作为工厂来源源不断地生产出抗真菌多肽。为此，在不改变鲎素多肽的氨基酸序列的前题下人工设计合成了一个抗真菌基因一鲎素基因(图1)，该基因在真核生物中转译出的鲎素多肽具有抗真菌的生物学活生。为了便于进一步的克隆操作，在基因两端设计了合适的酶切位点EcoRI和BamHI；为使该基因在寄主细胞中有较强的表达能力，我们考虑了真核生物密码子的选择偏向，使第三位碱基G+C的含量达到64％，并且在起始密码子周围设计了Kozak序列。然后将合成的基因片段和质粒pUC18都用EcoRI和BamHI在37℃酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，用T4DNA连接酶在15℃过夜连接，转化大肠杆菌JM109，涂板，挑选阳性重组子，用通用引物通过测序分析证明获得了预期的基因序列，这样就将合成的目的基因克隆到了载体pUC18上。该基因全长51个碱基，编码17个氨基酸。AAG TGG TGC TTC AGG GTG TGC TAG AGG GGA ATC TGT TAT CGC AGA TGT CGA
例3
本实施例说明鲎素基因在酵母表达载体上的构建过程。用于构建酵母表达载体的质粒是pPIC9(带有α-因子分泌信号)。首先将鲎素基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，然后通过载体与酵母P.pastoris染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。具体的过程是：将质粒pFZT2用EcoRI和XbaI双酶切，回收鲎素基因片段，再将其插入到载体pPIC9上的EcoRI和AvrII位点之间(XbaI和AvrII属同裂酶，产生相同的粘性末端)(图4)。以鲎素基因内的特征酶NcoI酶切筛选阳性克隆子(图5)，经进一步的序列分析后，表明鲎素基因已经插入到pPIC9上并且与其上游的信号肽形成了正确的阅读框架，于是获得了一个用于酵母转化的表达载体-pEAT2(图6)。这样就将带有分泌信号的目的基因克隆到了AOX启动子下游。
例4
本实施例的目的是说明酵母转化及筛选重组酵母株系的过程。质粒DNApEAT2经电击转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因可以整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白产物最终分泌至胞外，所产生的鲎素氨基酸序列与天然存在的鲎素的氨基酸序列完全相同(见图1)。外源蛋白经过这样的代谢途径，可以进行翻译后修饰，例如糖基化、形成二硫键等，从而得到具有生物活性的蛋白产物。
首先用2～3倍过量的内切酶BgllI消化质粒DNApEAT210μg(经PEG法纯化)，电泳检测酶切是否完全，使之线性化。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，-20℃保存备用。
酵母菌株GS115接种于5mlYPD中30℃培养过夜，取0.5ml接种于500mlYPD中30℃培养使O.D.600＝1.3～1.5，1500×g离心5分钟，用500ml冰预冷的无菌水洗涤沉淀，如上离心，以20ml冰预冷的1mol/1山梨醇悬浮沉淀，如上离心，以0.5ml冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀。取40μl酵母细胞液加入线性化DNAl～5μg，转移到冰预冷的无菌电击杯中冰浴5分钟。在国产电击仪LN-101上进行电击转化酵母受体菌hisGS115，电击参数为0.8kv，11.5μF。电击后立即向电击杯中加入0.5ml冰预冷的1mol/l山梨醇，然后将电击杯中的溶液转移到无菌的Eppendorf管中在RDB固体培养基上涂板，每板涂0.1ml，将培养皿倒置30℃培养至转化子出现。转化子可在基本培养基(不含His)生长，由于载体中没有酵母复制子，所以his4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于转化的酵母细胞中AOXI基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样，在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(Mut-)。
用无菌牙签从转化平板上挑取His+重组子，首先接种到MM固体培养基上，在接种到MD固体培养基上，如此挑取100个His+重组子，30℃培养2天。寻找在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子。
为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中鲎素多肽的表达情况。将His+Mut-转化子首先在BMGY培养基(以甘油为碳源)中培养，待其生长至饱和状态，移去BMGY，换入诱导培养基BMMY(以甲醇作为诱导物)，在诱导培养72小时、120小时、168小时及216小时后取上清液进行抗菌活性分析。通过对黄曲霉(Aspergillus flavus)孢子的萌发抑制实验，表明重组酵母菌株YPIC27能够分泌足够的鲎素抑制真菌孢子的萌发。
重组酵母菌株的甲醇利用缺陷型说明外源基因已经准确整合到酵母基因组中AOX1基因位点，从而破坏了该基因的功能。通过分子检测也证实了这一点。通过酶解的方法破坏酵母的细胞壁，再用SDS破坏细胞膜从而释放出染色体DNA再经过进一步的纯化处理就可以得到较纯的酵母基因组DNA。以菌株YPIC27的基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增出了一条550bp大小的DNA条带，与预期分子量大小相一致，而对照受体菌GS115(即没有经过电击转化的酵母)则无此条带，说明外源基因已经整合到了酵母基因组中(图7)。对重组酵母菌株YPIC27的基因组用内切酶BglII过夜酶切，电泳后将DNA转移到尼龙膜上进行Southern blotting分析，表明外源基因已经整合到酵母基因组的AOX1基因座位(图8)。在本实验中，用BglII消化用于转化酵母的载体pEAT2，回收探针，其长度约为5.7Kb左右，此探针内的各序列组成与转化所用的载体的序列组成完全一致。用BglII消化未转化酵母受体菌GS115及转化子YPIC27的基因组DNA，经杂交后菌株GS115(lane1)出现三条带：1.7Kb和2.4Kb的片段一来源于AOX1基因座位，2.7Kb片段来源于his4座位。转化子YPIC27(lane2)与GS115相比，多于一条5.7Kb的片段，这就是整合进酵母基因组的全长DNA。Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
例5
本实施例测定由酵母表达的抗真菌鲎素多肽对真菌生长的抑制作用。向50ml离心管中加入10mlBMGY培养基，然后接如0.1ml活化的阳性克隆子酵母细胞，30℃ 250rpm振摇使细胞生长至饱和状态。室温下4000rpm离心10分钟收集细胞，用2mlBMMY悬浮细胞，30℃下继续培养5-7天，4000rpm离心10分钟，取40μl上清液加到40孔细胞培养板中，与10μl真菌孢子溶液混合，再加入140μl PD液体培养基(孢子密度10000个/ml)，以GS115/His+Mut-albumin为对照。显微镜下观察。(1)将抗真菌鲎素多肽与稻瘟病菌孢子混合于黑暗中在28℃进行培养，16小时后观察孢子的萌发情况。结果表明绝大多数的孢子萌发受到抑制，不能形成芽管(图9)。(2)同样以黄曲霉的孢子作为对象进行抗真菌抑制实验，结果表明其孢子也不能正常萌发(图10)。
由上述遗传工程方法合成的抗真菌基因通过酵母表达并生产后的多肽具有如下特点：(1)杀菌力强，在外界环境中结构稳定，不丧失其生物活性；(2)对人畜安全无毒，不会造成环境污染；(3)生产工艺简单、可靠，生产成本低；(4)生产原料-酵母经过处理可以作为饲料，一物多用，经济效益显著。