包括一种抗原或包含氨基酸序列 化合物的体内发生器的治疗性组合物 本发明涉及一种治疗性组合物，其包括至少一种抗原，尤其是病毒、细菌或寄生虫来源的抗原，或至少一种包含氨基酸序列化合物的体内发生器，和至少一种佐剂。根据本发明的另一方面，其涉及作为佐剂的药物上可接受的水溶性盐的新的使用。
在疫苗型治疗性组合物中佐剂的使用已知有很长一段时间。这些佐剂的主要目的是增加特异性的免疫应答。
这些佐剂在自然界中多种多样。例如，它们可能由脂质体、油相所组成，例如一般以具有水相的乳剂形式使用的Freund型佐剂或更常规的是它们可能由不溶于水地无机盐所组成。这些无机盐可能由，例如，氢氧化铝、硫酸锌、胶体氢氧化铁、磷酸钙或氯化钙所组成。氢氧化铝(Al(OH)3)是最常用的佐剂。这些佐剂尤其在Rajesh K.Guptal等的论文“佐剂，毒性和辅助性之间的平衡”，疫苗，11卷，第3期，1993，993-306〔sic〕中有描述。
上面提到的佐剂具有效力有限的缺陷。此外，它们可能对治疗的个体诱导出一定的毒性。更具体地说，当这些治疗性组合物注射时，在注射部位观察到损伤和其它局部反应如肉芽肿的形成。当佐剂为氢氧化铝时，这些缺陷不太显著。因此，后者化合物是最为常用的佐剂之一。然而，最近，所有基于铝的化合物和继之的氢氧化铝逐渐变得怀疑其成为促进某些疾病如肾功能异常或早老性痴呆出现的因素。此外，已知氢氧化铝仅有效地诱导体液免疫而不诱导细胞免疫。
本发明的第一个主题由包括一种佐剂的治疗性组合物所组成，该佐剂至少以与氢氧化铝相同的程度增加免疫应答而不导致损伤或肉芽肿型局部反应并且不易于促进治疗个体中疾病的出现。
在本发明的内容里，其增加是由佐剂促进的免疫应答是免疫物质产生的特异的应答。
根据另一个方面，本发明的主题是包括一种佐剂的治疗性组合物，该佐剂有效地诱导细胞免疫和体液免疫。
根据另一方面，本发明涉及治疗性组合物制备中新的佐剂的使用。
根据另一方面，本发明涉及用于治疗性组合物制备的新的佐剂组合物。
因此本发明涉及治疗性组合物，包括(i)至少一种抗原或至少一种包含氨基酸序列的化合物的体内发生器和(ii)至少一种佐剂，其中所述的佐剂至少由一种药用上可接受的和水溶性盐所组成，该盐由有机阴离子和选自锰、钙和锌的金属阳离子所组成。
在本发明的内容里锰是一种特别优选的金属。其原因是已观察到根据本发明的包括Mn2+阳离子的药物上可接受的水溶性盐允许诱导特别大的免疫反应，而同时毒性又低。
就本发明而言，水溶性盐可以是那些在水中的溶解性大于或等于10g/l，优选在10和2000g/l之间的盐类。
构成所述药用上可接受盐的有机阴离子优选包括至少一个被氧化的官能团。优选为磷酸基-PO4H2或羧基-COOH化合物的阴离子。
磷酸甘油是一种优选的含有磷酸基团的阴离子。
包括至少一个羧基的优选阴离子由选自下面的化合物产生：
-酸性糖类，优选为具有5～7个碳原子的酸性糖类，更优选具有6或7个碳原子的酸性糖类，
-单羧基或多羧基酸，
-氨基酸。
优选的单羧基或多羧基酸为延胡索酸和具有下面结构式(I)的化合物：其中：R代表COOH、CH3CO、CH3或CH2OH，
R’代表H或COOH和
s，t和u(其可以相同或不同)为0或3之间。
结构式(I)的优选化合物为醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和丙酮酸。
就本发明而言，酸性糖类由包括至少一个羧基官能团的糖类，和由还原性糖所组成的糖类组成。这些酸性糖类优选为通过氧化伯醇基或醛基为羧基而获得的醛糖衍生物。这种化合物可能最特别地由葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、果糖庚酸、葡糖酸庚酸和葡萄糖庚酸所组成。当有机阴离子来自氨基酸时，此氨基酸可以是α-氨基酸如谷氨酸、甲硫氨酸且最特别地是天冬氨酸。
根据本发明的药用上可接受的水溶性盐可以包括如上限定的与一种有机阴离子或不同性质的几种有机阴离子结合使用的二价阳离子。因此，作为实施例，二价阳离子如钙离子可与来自葡糖酸庚酸的阴离子和来自葡萄糖酸的阴离子结合。
在本发明中最特别优选的水溶性佐剂由葡萄糖酸锰所组成。
根据本发明的治疗性组合物可以包括在0.01和1000mg/ml之间，优选为0.1和150mg/ml之间如上面所限定的佐剂。
根据本发明的治疗性组合物可通过简单的混合含有抗原或所述的体内发生器的水悬液与上述盐的水溶液而制备。
除了由上述的药用上述可接受的水溶性盐所组成的佐剂以外，根据本发明的治疗性组合物也包括油性佐剂。在这种情况下，根据本发明的治疗性组合物优选以乳剂的形式，其结合至少一个水相和至少一个油相。
该乳剂可以为油中水(W/O)型或，优选地，为水中油(O/W)，水分散于水中油(W/O/W)或微型乳剂型。这种乳剂可根据乳剂制备的标准方法，尤其根据专利申请EP-A-489,181和EP-A-481,982中描述的方法而制备。因此，构成油相的油可以通过与由水溶液或含有抗原的悬液所组成的水相一起搅拌而乳化。
根据本发明的乳剂在重量上可能含有每99.5％到0.5％的水相中0.5％到99.5％的油相，优选地每95％到5％的水相中5％到95％的油相并且，更为优选地，每75％到25％的水相中25％到75％的油相。该乳剂必需稳定，优选当4℃保存时至少12个月内是稳定的。
油性佐剂可以为矿物油、非矿物油或矿物油与非矿物油的混合物。所述的矿物油可以为天然的或合成的矿物油。所述的非矿物油可以是植物、动物或合成来源。非矿物油优选为可代谢型的。所有这些油类对施用本发明组合物的宿主生物是无毒性作用的。它们在保存温度(约+4℃)时优选为液体或，至少，使其在该温度成为液体以产生乳剂是可能的。根据本发明的优选矿物油可以由包括具有多个碳原子优选大于16个的线性碳链且不含芳香族化合物的油所组成。这类油可以是，例如，那些市售的名为“MARCOL52”(由法国Esso生产)或“DRAKEOL6VR”(由美国Penreco生产)的油类。
可被提及的合成非矿物油实例有聚异丁烯、聚异丙烯、醇和脂肪酸的酯，如，油酸乙酯和异丙基肉豆蔻酸酯、单、二-或三甘油酯、丙二醇酯、部分的甘油酯如玉米油甘油酯，如SEPPIC公司出售的名为LANOLTM的那些酯，玉蜀季蛋白和油酰油酸酯。可被提及的植物油中有富含可被生物降解的油酸的不饱和油，例如落花生油、橄榄油、芝麻油、大豆油或麦精油(wheatgerm oil)。
动物油可特别地由角鲨烯、角鲨烷或鲸蜡油所组成。
此外，当以上述的乳剂形式时，根据本发明的治疗性组合物也可优选地含有一种或更多种表面活性剂。后者的活性剂具有亲脂或亲水性质，其特征在于HLB(亲水-亲脂平衡)值在1和19之间。
这样的表面活性剂可由以下物质组成：
*烷基聚糖苷或具有Ra-(O)-Zn结构式的烷基聚糖苷的混合物，结构式中的Ra代表线性或分枝的饱和脂肪族基团，包括4至24个碳原子，优选8～22个碳原子，Z为糖残基，优选为葡萄糖，且n在1和5之间，优选地为1.1和2之间。
*皂角甙，
*卵磷脂，
*聚羟乙基链烷醇如ICI公司出售的名为BRIJ的那些化合物，
*包括聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段聚合物如BASF公司出售的名为PLURONIC的那些聚合物。
特别优选的表面活性剂为通过缩合脂肪酸，尤其在20℃为液态的脂肪酸与分子量在80和2000之间的聚乙烯乙二醇而获得的聚乙二醇酯；这种表面活性剂由SEPPIC公司销售，商品名为SIMULSOL2599。
本发明内容中优选的另一种表面活性剂由通过缩合脂肪酸，优选在20℃为液态的脂肪酸与糖、山梨醇或甘油而获得的酯所组成。所述的糖可以由葡萄糖、蔗糖或，优选为甘露醇所组成。作为特别优选的甘露醇酯，可提及通过经1-4或2-6环化的甘露醇的多羟基化碳链脱水而获得的甘露醇油酸酯。
聚乙二醇、山梨醇或甘油的这些糖酯的衍生物也可使用。这些被修饰的衍生物尤其通过嫁接亲水官能团如醇、多元醇、乙烯氧化物、丙烯氧化物、羧酸、胺或酰胺而具有亲水性。这种衍生物可以由，例如，脱水山梨糖醇的聚氧乙烯化脂肪酯所组成，如TWEENs(参考《国际化妆品成份目录》，第5版，1993)。另一种优选型表面活性剂由乙氧基化的植物油所组成，如，乙氧基化的蓖麻油，该油任选被氢化。
为了可注射使用根据本发明的表面活性剂优选为药用上可接受的；其必须特别地不含重金属并具有很低的酸值或过氧化值。它也必须达到无害测试标准，例如，S.S.Berlin，《过敏年鉴》，1962，20，473中描述的标准或在《欧洲药物百科》中描述的异常毒性测试标准。该表面活性剂在形成乳剂前优选与油性佐剂结合。
表面活性剂在治疗性组合物中的浓度可在0.01和500mg/ml之间，优选在0.1和200mg/ml之间。
本发明中最特别适用的与表面活性剂(甘露醇酯)相联的油为那些由SEPPIC公司出售的商品名为“MONTANIDE”的油。这些油的性质，可用它们获得的乳剂类型和这些乳剂的特性(粘度和传导性)列于下表1：
表1 Na 商品名 油/甘露醇酯 乳剂类型 水相/乳剂 (％重量) 粘度(mPa S) 25℃传导性 (mScm-) 1MONTANIDEISA 25 矿物 O/W 75％ 20 5000 2MONTANIDEISA 25A 矿物+ avridine O/W 75％ 20 5000 3MONTANIDEISA 28 矿物+ 油酸乙酯 O/W 75％ 25 1000 4MONTANIDEISA 206 矿物 W/O/W 50％ 50 1000 5MONTANIDEISA 50 矿物 W/O 50％ 200 1 6MONTANIDEISA 708 植物 W/O 30％ 70 1
*Avridine＝N，N-双十八烷基-N’，N’-双(2-羟乙基)-丙二胺。
油性佐剂也可由可自身乳化的油所组成，这就是说油性制品实质上不用能量输入，例如通过缓慢的机械搅动而在水相中的扩散便可与水相形成稳定的乳剂。在这方面，可提及的可自身乳化的油类如《欧洲药物百科》中已知的名为Labrafil和Simulsel的那些油类。这些油为葡聚糖甘油酯。
优选的可自身乳化的油是那些以申请人的名义在1995年1月18日提交的法国专利申请No.9500497中描述的油类，该申请题目是“Utilisatin d’esters d’acides gras ethoxyles coome composants awto-emulsionnables notamment wtiles pour la preparation de compositionsphytosanitaires ou de medicaments a usage veterinaire ou homain”〔乙氧化的脂肪酸酯作为可自身乳化成分的使用，它特别对于制备植物-保护组合物或用于人类或兽医用途的医疗产品有用〕。在本说明书中包括其参考文献。这些油类由相应于下面结构式之一的乙氧化脂肪酸酯所组成：其中：
-R1、R3、R5、R6、R8和R10代表饱和或不饱和的具有5～30个碳原子的线性或分枝烃链；
-R2、R4、R7和R9代表饱和或不饱和的、具有1至5个碳原子的线性或分枝烃链；
在上述结构式II、III或IV中由K.ltn和n+p+q分别代表的乙烯氧化物分子总数为一整数以致所述化合物的HLB(亲水-亲脂平衡)值在约4和10之间，优选在约5和9之间。
R1优选选自棕榈酸、硬脂酸、蓖麻酸、油酸，亚油酸和亚麻酸残基，R2代表甲基团且K是1至5之间，优选等于2的整数，且此外，结构式III的优选乙氧化脂肪酸酯是具有下面的基团的酯：(i)-R6、R8和R10代表具有16～22个碳原子的烃链，特别相应于菜子油、玉米油、大豆油、落花生油和杏仁油的脂肪链。
-R7和R9代表亚甲基，CH2；
-n，p和q代表整数以使它们的和在3和30之间，并且优选等于20；或(ii)-R6、R8和R10代表相应于蓖麻油脂肪链的烃链；
-R7和R9代表亚甲基，CH2；
-n，p和q代表整数以使它们的和在5和7之间。
可自身乳化的油在根据本发明的治疗性组合物中的浓度可以大致在5和700g/l之间，优选大致在10和500g/l之间。
除了油相和水相之外，根据本发明的组合物还可以含有传统的免疫刺激剂如Avrdine，即N，N-双十八烷基-N’，N’-双(2-羟乙基)-丙二胺，MDP(胞壁酰二肽)衍生物，尤其是苏氨酰-MDP，霉菌酸衍生物或脂质A衍生物。
根据本发明的治疗性组合物在缺少任何油性佐剂时也可包括一种或更多种表面活性剂。
那么治疗性组合物以胶粒溶液的形式。这可通过以抗原或体内抗原发生器在水中的扩散与表面活性剂简单地混合而制备。
表面活性剂可选自上述的表面活性剂，结合使用油性佐剂。
所述的胶粒溶液可含有0.5～500mg/ml，优选1～250mg/l的表面活性剂。
根据本发明的治疗性组合物可包括抗原如病毒、微生物，更特别地为细菌或寄生虫，或包含肽链的化合物。这种化合物可由蛋白或糖蛋白，特别是获自微生物的蛋白或糖蛋白，合成肽或蛋白或通过遗传工程而获得的肽所组成。所述的病毒和微生物可被完全灭活或是活的减毒型的。作为可构成根据本发明的抗原的病毒，可提及的有狂犬病毒、Aujeszky病毒、流感病毒、口蹄疫病毒或HIV病毒。作为可构成根据本发明抗原的细菌型微生物，可提及的有大肠杆菌和巴斯德氏菌属、Furonculosis属、弧菌属(Vibriosis)、葡萄球菌属和链球菌属的那些细菌。作为寄生虫，可提及的有锥体虫属、疟原虫属和利什曼原虫属的那些寄生虫。
根据本发明的治疗性组合物包括的抗原浓度取决于该抗原性质和治疗个体的性质。然而，特别值得注意的是根据本发明的佐剂(可以与上述的油性佐剂和/或表面活性剂结合使用或不结合使用)使以适当的方式降低所需抗原的常用剂量成为可能。适当的抗原浓度可由本领域的技术人员按常规加以测定。该剂量一般在0.1μg/ml～1/gml的级别，更普遍地在1to〔sic〕μg/ml与100mg/l之间。
根据本发明的治疗性组合物也可包括包含氨基酸序列的化合物的体内发生器，这就是说一种生物学化合物，它能在导入了体内发生器的宿主有机体中表达这样一种化合物。包括氨基酸序列的化合物可以为蛋白、肽或糖蛋白。
这些体内发生器一般通过遗传工程方法获得。
更具体地说，它们可以由活的微生物，一般为病毒所组成，作为重组载体而起作用，其中插入有核苷酸序列，尤其是外显子基团。这些化合物称为且特别用作重组亚单位疫苗。
在此方面，可参考M.Eloit等的论文.，病毒学杂志(1990)71，2925-2431，国际申请WO-A-91,00107或国际申请WO-A-94/16681。
构成重组亚单位疫苗的微生物优选为无外鞘的重组病毒，选自如，腺病毒、疫苗病毒、金丝雀痘(canary pox)病毒，疱疹病毒和杆状病毒。插入到微生物中的外显子基因可来自如，Aujeszky病毒或HIV。
根据本发明的体内发生器也可由包括外显子核苷酸序列的重组质粒所组成，该序列能在宿主有机体中表达包括氨基酸序列的化合物。这种重组质粒和其施用给宿主有机体的方式在以下文献中有描述，包括Lin等1990，循环82：2217，2221；Cox等.，病毒学杂志.，1993年9月，67，9，5664-5667和以申请人的名义，题目为“Une compositioncomprenant un plasmide recombinant et ses utilisations comme vaccinet medicament”〔一种包括重组质粒的组合物和其作为疫苗和医疗产品的使用〕的申请日为1995年3月21日的国际申请WO/FR 95/00345。
根据包括在体内发生器中的核苷酸序列的性质，在宿主有机体中表达的包括氨基酸序列的化合物可以：
(i)是一种抗原，并且允许激发免疫反应，
(ii)对疾病，实质上是在宿主有机体中引发的功能性疾病具有治疗作用。在这种情况，体内发生器允许对宿主进行基因治疗型处理。
作为实例，这种治疗作用可由体内细胞因子发生器所组成，如白细胞介质，尤其是白细胞介素2。后者允许激发或增强旨在选择性去除癌细胞的免疫反应。
所述的体内发生器在根据本发明的治疗性组合物中的浓度在此也特别依赖于所述发生器的性质和其要施用的宿主的性质。此浓度可容易地由本领域的技术人员根据常规的实验而测定。
然而作为指导，可以指出当体内发生器是重组微生物时，其在根据本发明的治疗性组合物中的浓度可以在102和105个微生物/ml之间，优选在105和1012个微生物/ml之间。
当体内发生器是重组质粒时，其在根据本发明治疗性组合物中的浓度可以在0.01和100g/l之间。
根据本发明的治疗性组合物可用作预防性或治疗性医疗产品。依据抗原或体内发生器的性质，根据本发明的治疗性组合物可施用于鱼，甲壳纲动物如虾，家禽，尤其是鹅、火鸡、鸽子和小鸡，犬属动物如狗，猫属动物如猫，及猪、灵长动物、牛、羊和马。根据本发明的包括上述药物上可接受的水溶性盐的治疗性组合物也可施用于人类。治疗性组合物可用常规的方式施用，尤其通过皮下、肌肉内或腹膜内注射或通过口腔或粘膜途径。
根据本发明的另一方面，其由佐剂的使用所组成，该佐剂由药用上可接受的上述水溶性盐所组成，此盐用于制备预防或治疗感染性疾病，尤其是由上述的病毒或微生物产生的感染性疾病的疫苗。
根据本发明的另一方面，其由药用上可接受的水溶性盐的使用所组成，该盐用于制备治疗功能性疾病，如癌症或粘稠物质阻塞症(mucoviscidosis)的治疗性组合物。
在这些使用的另一方面，所述的药用上可接受的盐可与下面中的至少一种结合使用：油性佐剂，表面活性剂和一种自身与表面活性剂结合的油性佐剂；这些油性佐剂和表面活性剂如上述。
包括所述药物上可接受的盐和油性佐剂和/或上面提到的表面活性剂的佐剂组合物构成了本发明的另一方面。其中的适当的这些佐剂组合物包括至少一个水相。
在后者的情况，包括至少一个油相和适当表面活性剂的根据本发明的佐剂组合物可以是乳剂的形式。此乳剂可以为W/O、O/W、W/O/W或微型乳剂(microemulsion)型。
这些乳剂在重量上可包括每99.5％～0.5％的水相中0.5％～99.5％的油相，优选每95～5％的水相中5～95％的油相，更为优选每75～25％的水相中25～75％的油相。
其中合适的乳剂，它们可包括0.01～500mg/ml，优选0.1～200mg/ml的至少一种表面活性剂。
当根据本发明的佐剂组合物除了药物上可接受的盐和水相以外，仅包括一种或更多种表面活性剂时，那么它以胶粒溶液的形式。此胶粒溶液的表面活性剂含量可以在0.01和900mg/ml之间，优选在1和250mg/ml之间。
根据本发明的佐剂组合物通常包括0.02～3000mg/ml，优选0.1～1000mg/ml，且更为优选为0.1～150mg/ml的根据本发明的药用上可接受的盐。
这些组合物用于制备根据本发明的治疗性组合物。
后者的组合物然后可通过简单地混合佐剂组合物与包括抗原或包括氨基酸序列的化合物的体内发生器的组合物而制备。
以下面的实施例和附图将更好地理解本发明。
实施例用平均重量为18～20g的OF1小鼠完成。
表示的结果为获自10只小鼠结果的平均值。
治疗性组合物包括Sigma Grade V牛血清白蛋白(BSA)作为抗原。
治疗性组合物皮下注射。
体液免疫应答根据ELISA方法通过分析总IgG和总IgG1而测定。
细胞免疫应答根据ELISA方法通过分析IgG2a而测定。
实施例中提到的抗体水平相当于高于背景噪声的最终稀释度。
实施例中使用下面的缩写：-Glu ＝葡萄糖酸酯-Fruhp ＝果糖庚酸酯-Gly ＝甘油磷酸酯-Gluhp ＝葡萄糖庚酸酯-Al(OH)3＝氢氧化铝-Asp ＝天冬氨酸
因此，作为实施例，GluMn为葡萄糖酸锰。实施例1
制备包括50μg BSA的每100μl治疗性组合物(或剂量)。
这些治疗性组合物于Do(即注射日期)注射进入小鼠。
测定注射后14天和28天的抗-BSA抗体水平(初级应答)。
在D28，相同的治疗性组合物注射入相同的小鼠。
于D42和D56测定抗-BSA抗体的水平。
获得的结果列于下表II。
表II 疫苗 组合物 佐剂 佐剂剂量 (mg/剂量) 抗-BSA抗 体/初级应 答(D14) 抗-BSA抗 体/初级应 答(D28) 抗-BSA抗 体/初级应 答(D42) 抗-BSA抗 体/初级应 答(D56) 1 - - ＜500 ＜500 ＜500 ＜500 2 GluMn 1 64,000 32,000 256,000 256,000 3 GluCa 3 16,000 8000 128,000 96,000 4 FruhpCa 1 4000 2000 64,000 48,000 5 GlyCa 2 4000 2000 64,000 64,000 6 GluZn 0.5 16,000 6000 96,000 96,000 7 GluhpZn 1 8000 6000 64,000 64,000 8 AspMg 1 ＜500 ＜500 ＜500 ＜500 9 AspMg/k 1 ＜500 ＜500 ＜500 ＜500 10 Asp Ca 1 4000 4000 48,000 48,000 11 Asp Mn 1 32,000 32,000 128,000 128,000 对照[sic] - ＜500 ＜500 ＜500 ＜500
对照组合物相应于未接种的小鼠。
获得的结果显示，与未接种的对照和不包括任何佐剂的治疗性组合相比，添加根据本发明的佐剂到治疗性组合物中诱导明显的免疫刺激活性。
这些结果也显示出二价锌、锰和钙盐较天冬氨酸镁具有显著的优越性，后者与未接种的对照或不包括佐剂的组合物相比没有诱导出明显的免疫刺激活性。
也可能注意到GluMn，尽管以低浓度使用，可获得特别高水平的抗体。实施例2
根据本发明的水溶性盐，GluMn的免疫刺激效应与不溶性盐，Al(OH)3的免疫刺激效应进行比较。
所用的100μl体积的治疗性组合物(剂量/小鼠)包括50μg抗原和1mg Al(OH)3。
也注射不包括任何佐剂的剂量。
一批小鼠未接种(对照)。
获得的结果列于下表III。
表III： 佐剂IgGl初级应答D14IgGl初级应答D28IgGl次级应答D42IgGl次级应答D56IgG2a初级应答D14IgG2a初级应答D28IgG2a次级应答D42IgG2a次级应答D56 -＜500＜500＜500＜500＜500＜500＜500＜500 GluMn32,00064,000256,000256,0004000800024,00064,000 Al(OH)316,00064,000128,000256,00010006000800032,000 对照＜500＜500＜500＜500＜500＜500＜500＜500
IgGl代表体液应答。
IgG2代表细胞应答。
用根据本发明的佐剂而获得的体液和细胞应答大于用常规佐剂如Al(OH)3获得的应答。实施例3
为了证明水溶性盐型佐剂与油性佐剂(表1中定义的MontanideISA 25)之间的协同效应，对各种治疗性组合物的效应进行比较。其中的每种包括50μg抗原并具有100μl的体积(剂量/小鼠)。
获得的结果列于下表IV：
表IV： 水溶性盐 盐含量 (mg/剂量) Montanide ISA 25(mg/剂量) 体液免疫性 (D14) 细胞免疫性 (D14) - - 25 24,000 3000 GluMn 1 - 64,000 4000 GluMn 1 25 96,000 8000 GluMn 0.5 - 16,000 ＜2000 GluMn 0.5 25 96,000 6000
油性佐剂与根据本发明的可溶性盐的组合使获得优于通过单独使用每种佐剂获得简单增加抗体水平获得的抗体水平成为可能，的确证实了增效作用。对于低量的GluMn(0.5mg/剂量)，此增效作用甚至更为显著。实施例4
为了证明阴离子有机性质的重要性，对各种钙盐的免疫刺激效应进行比较。
每种100μl体积的治疗性组合物含有50μg抗原(对照除外)和0.5mg钙盐，以使每种组合物中钙浓度为2.7mg。
抗体在接种后的42天进行分析。
于D28重复注射该治疗性组合物。抗体于D42进行分析。
获得的结果列于表V：
表V： 盐 体液免疫 细胞免疫 CaCO3 32,000 4000 CaCl2 64,000 24,000 CaHPO4 64,000 10,000 GluCa 128,000 32,000 - 3000 ＜2000
在这些测试中观察到CaCl2诱导很大的损伤。实施例5
将100μl体积的包括50μg抗原的治疗性组合物注射入各批小鼠中，每批包括5只小鼠。于D8和D35对局部反应(损伤和肉芽肿)进行评价。
获得的结果分别列于表VI和表VII。
表VI(D8)： 小鼠号盐浓 度(mg/剂量) 1 2 3 4 5GluMn 1 + + - - +GlyMn 1 L + ++ + -GluMn(*) 1 ++ +++ + - +GluCa 1 - - - - -MnCl2+ 1 +++ L L L LAl(OH)3 1 +++ +++ ++ +++ ++++
表VII(D35)： 小鼠号盐浓 度(mg/剂量) 1 2 3 4 5GluMn 1 - + + + -GlyMn 1 - + + + +GluMn(*) 1 ++ ++ ++ +++ +GluCa 1 - - - - -MnCl2+ 1 +++ LL LL L LAl(OH)3 1 ++++ +++ ++ +++ ++++
(*)：与25mg MONTANIDE ISA 25联合使用的GluMn
- ＝无肉芽肿
+ ＝小肉芽肿
++ ＝中等肉芽肿
+++ ＝大肉芽肿
++++ ＝很大肉芽肿
- ＝无损伤
L ＝小损伤
LL ＝中等损伤
LLL ＝大损伤
LLLL ＝很大损伤
DCD ＝实验过程中死亡的小鼠
选择的Al(OH)3浓度相应于在此浓度该盐可获得最大免疫应答的浓度。此Al(OH)3浓度为在上述实施例中使用的浓度。